开发可生物素化的融合蛋白在各个研究领域具有广泛的应用前景。重组蛋白工程技术是一种简单直接且成本效益高的方法，能够高效地获得按特定设计定制的蛋白质。
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摘要
摘要
重组蛋白工程已得到利用 大肠杆菌（Escherichia coli） 近40年来几乎用于所有表达系统，时至今日 E. coli 仍然是使用最广泛的宿主生物。该系统的灵活性允许添加诸如生物素标签（用于链霉亲和素相互作用）以及绿色荧光蛋白或樱桃红蛋白等较大的功能蛋白。此外，通过整合非天然氨基酸，如金属离子螯合剂、具有独特反应活性的功能基团、光谱探针以及可赋予翻译后修饰的分子，使得对蛋白质性质和功能的操控更加精确。因此，该技术能够创建可定制的融合蛋白，在多个研究领域具有重要应用价值。特别是，由于生物素与亲和素及链霉亲和素之间具有高亲和力的相互作用，生物素化蛋白序列已被广泛整合到多种靶蛋白中。这一修饰有助于增强标记蛋白的检测与纯化，并为细胞分选等后续应用开辟了途径。因此，生物素标记分子在生物工业和生物医学领域的影响日益广泛。在本研究中，我们构建了含有神经生长因子（NGF）和信号素3A（Sema3A）功能区域的重组生物素化融合蛋白。我们此前已报道过这些生物素化融合蛋白以及其他活性蛋白序列如何被固定于生物材料上，用于组织工程与再生医学目的。本实验方案概述了在毫克规模上构建可生物素化蛋白的基本步骤，利用 T7 lac 可诱导载体和 E. coli 表达宿主，从转化开始，到扩增和纯化。
引言
蛋白质是一类广泛存在的生物大分子，负责执行多种生物学功能，最终促成组织的正常形成与有序构建。这些分子可启动成千上万条信号通路，调控基因及其他蛋白质的上调和/或下调，从而维持人体内部的稳态平衡。单个蛋白质的功能异常会影响整个信号网络，可能导致严重疾病或障碍的发生。在实验室中对单个蛋白质进行工程化改造，为应对这些不良效应提供了一种解决方案，并可作为小分子药物的替代策略。1977年，编码14个氨基酸生长抑素序列的基因成为最早利用基因工程技术合成的多肽之一 E. coli11979年不久之后，胰岛素被克隆至质粒pBR322中，并实现了转化、表达与纯化。2自那时起，重组蛋白的影响已扩展到多个研究领域，如生物材料、药物递送、组织工程、生物制药、农业、工业酶制剂和生物燃料。 等等。 （参见相关综述文献）3-8这主要归因于该技术通过添加特定应用的化学基团或蛋白质序列所展现出的多功能性，这些修饰可用于靶蛋白的鉴定、稳定化和纯化等多种目的。
通过重组DNA技术，可在多种真核和原核宿主系统中表达重组蛋白，包括哺乳动物、植物、昆虫、酵母、真菌或细菌。每种宿主系统具有不同的优势，通常需根据蛋白功能、产量、稳定性、总体成本及可扩展性来确定最佳表达系统。细菌细胞通常缺乏真核宿主所具备的翻译后修饰机制即 糖基化，二硫键桥接....
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方案
1. 目标蛋白的设计
- 利用美国国家生物技术信息中心网站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）获取目标蛋白的氨基酸序列，需考虑目标物种及任何剪接变体。选择对应于该蛋白活性区域的氨基酸序列。
注意：对于 Sema3A，选择了氨基酸 21-747。设计了一个与 NGF 的融合蛋白，其中将 barstar 的氨基酸 1-90 序列添加至 NGF 的氨基酸 122-241 位。 - 在N端添加以下序列：用于纯化的6×His标签（HHHHHH）、用于切除His标签的烟草蚀刻病毒（TEV）蛋白酶切割位点（ENLYFQG）、用于在赖氨酸（K）位点进行蛋白生物素标记的生物素化序列（GLNDIFEAQKIEWHE），以及含有间隙的柔性铰链序列，以提供足够的空间促进蛋白正确重折叠（EFPKPSTPPGSSGGAP）。
注意：这些序列可根据所需的融合蛋白进行调整。 - 将完整的氨基酸序列送至公司，针对目标宿主物种进行基因设计/优化并合成。使用试剂盒或商业服务，通过BamHI-NotI位点将基因亚克隆至选定的载体中。
2. 制备琼脂平板
注意：所有抗生素、培养皿、缓冲液的储备液必须严格保存 等等。 妥善保存（温度和时间），并保持无蛋白酶污染（已灭菌）。<....
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结果
克隆与测试表达
正确涂布时，应形成单个分离的菌落，以提高挑取克隆转化细菌细胞的几率（图2A）。然而，若涂布细胞过多、平板在37 °C孵育时间过长或转化效果不理想，则菌落可能覆盖整个琼脂平板或形成较大的细胞聚集体（图2B和图2C）。在测试表达过程中，NGF和Sema3A首先在37 °C诱导4小时，SDS-PAGE分析结果显示两种蛋白均位于可溶性组分中（图2D）。蛋白表达量尚可，因此进一步考察了在18 °C过夜诱导的表达情况。结果表明，NGF在可溶性组分中的表达有所改善，而Sema3A则无明显差异（图2E）。
分离、纯化与生物素标记
NGF 和 Sema3A 均采用上述方案中所述的天然分离技术进行分离，并通过 FPLC 柱进行纯化。此外，这些.......
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讨论
重组蛋白工程是一项跨越多个学科的强大技术。该技术成本效益高、可调节性强，且操作相对简单，能够实现大量定制化蛋白质的生产。需要特别注意的是，目标蛋白的设计与表达并非总是直接可行。基础表达水平和重组蛋白的稳定性取决于载体、大肠杆菌（E. coli）菌株、肽标签添加以及培养参数的具体选择。我们的特定设计标准采用已广泛验证的大肠杆菌（E. coli）菌株用于蛋白工程。此外，质粒载体包含T7 lac启动子和氨苄青霉素抗性基因，以实现重组蛋白的稳定表达。
在获得高纯度亚克隆质粒后，首要的主要步骤是将目标蛋白成功转化至宿主细胞，并确定该蛋白的可溶性。测试表达是优化目标蛋白合成的最佳时机。应挑取小而孤立的菌落（图 2A) 以确保更有效地筛选含有质粒的细菌细胞。可采用一些故障排除策略，例如重新划线以重新分布菌落，或缩短琼脂平板的培养时间，从而有助于获得更好的菌落形态。重组蛋白的表达会诱导宿主菌株产生应激反应，这一现象并不意外。36
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢阿克伦大学为本研究提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 1,4-二硫苏糖醇，DTT，99.5% | Chem-Impex International | 127 | 100 g |
| 2-羟乙基硫醇 β-巯基乙醇 | Chem-Impex International | 642 | 250 ml |
| 冰醋酸 | EMD | AX0073-9 | 2.5 L |
| 琼脂 | Bioshop | AGR001.500 | 500 g |
| 氨苄青霉素钠盐 | Sigma-Aldrich | A9518 | 25 g |
| 消泡剂 204 | Sigma-Aldrich | A6426 | 500 g |
| Barstar-NGF pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| BL21(DE3) 感受态细胞 | Novagen | 69450 | 1 ml；表达宿主 |
| Bradford 试剂 | Sigma-Aldrich | B6916 | 500 ml |
| BugBuster | Novagen | 70922-3 | 100 ml |
| 凝胶过滤标准品 | Bio-Rad | 151-1901 | 6 瓶 |
| 甘油 | Bioshop | GLY001.1 | 1 L |
| 盐酸胍/氨基甲酰胍盐酸盐 | Chem-Impex International | 152 | 1 kg |
| His-Pur Ni-NTA 树脂 | Thermo Scientific | 88222 | 100 ml |
| 盐酸 | EMD | HX0603-3 | 2.5 L |
| 咪唑 | Chem-Impex International | 418 | 250 g |
| IPTG | Chem-Impex International | 194 | 100 g |
| Laemmli 上样缓冲液 | Bio-Rad | 161-0737 | 30 ml |
| 月桂基硫酸钠，十二烷基硫酸钠 | Chem-Impex International | 270 | 500 g |
| LB 培养基 | Sigma-Aldrich | L3022 | 1 kg |
| NovaBlue 感受态细胞 | Novagen | 69825 | 1 ml；克隆宿主 |
| 磷酸盐缓冲液 | Sigma-Aldrich | P5368-10PAK | 10 包 |
| 氯化钾 | Chem-Impex International | 01247 | 1 kg |
| Sema3A-pET-21a(+) | GenScript USA Inc. | 4 µg | |
| SimplyBlue SafeStain | Invitrogen | LC6060 | 1 L |
| 氯化钠 | Sigma-Aldrich | S5886-1KG | 1 kg |
| 氢氧化钠 | Fisher Scientific | S318-500 | 500 g |
| 磷酸氢二钠 | Sigma-Aldrich | S5136-500G | 500 g |
| 磷酸二氢钠 | Sigma-Aldrich | S5011 | 500 g |
| 优质肉汤（Terrific Broth） | Bioshop | TER409.5 | 5 kg |
| 盐酸四环素 | Chem-Impex International | 667 | 25 g |
| Tris/甘氨酸/SDS 缓冲液，10× | Bio-Rad | 1610732 | 1 L |
| Trizma Base | Sigma-Aldrich | T1503 | 1 kg |
| 胰蛋白胨 | EMD | 1.07213.1000 | 1 kg |
| 酵母提取物，颗粒状 | EMD | 1.03753.0500 | 500 g |
| ÄKTApurifier10 | GE Healthcare | 28-4062-64 | 包含试剂盒和配件 |
| 台式轨道摇床 | Thermo Scientific | SHKE4000 | MAXQ 4000 |
| BirA500 | Avidity | BirA500 | 酶附带反应缓冲液和生物素溶液 |
| 透析盒 | Thermo Scientific | 66380 | Slide-A-Lyzer（加强型） |
| 透析管 | Spectrum Laboratories | 132127, 132129 | 截留分子量：25,000 和 50,000 |
| 流路切换阀 FV-923 | GE Healthcare | 11-0011-70 | |
| FluoReporter 生物素定量检测试剂盒 | Invitrogen | 1094598 | |
| Frac-950 收集管架，C 型架 | GE Healthcare | 18-6083-13 | |
| 组分收集器 Frac-950 | GE Healthcare | 18-6083-00 | 包含试剂盒和配件 |
| 加热/制冷循环器 | VWR | 13271-102 | 型号 1156D |
| 加热烘箱 FD 系列 | Binder | 型号 FD 115 | |
| HiLoad 16/60 Superdex 200 pg | GE Healthcare | 17-1069-01 | 已停产——替代产品：HiLoad 16/600 Superdex 200 pg |
| J-26 XPI Avanti 离心机 | Beckman Coulter | 393126 | |
| JA 25.50 转子 | Beckman Coulter | 363055 | |
| JLA 8.1 转子 | Beckman Coulter | 969329 | 包含 1 L 聚丙烯瓶 |
| JS 5.3 转子 | Beckman Coulter | 368690 | |
| 层流罩 | Thermo Scientific | 1849 | Forma 1800 系列洁净工作台 |
| 酶标仪 | TECAN | infinite M200 | |
| Mini-PROTEAN Tetra 电泳槽 | Bio-Rad | 165-8004 | 4 块胶垂直电泳系统 |
| Mini-PROTEAN TGX 预制胶 | Bio-Rad | 456-9036 | 任意 kDa，15 孔梳 |
| Ni-NTA 柱 | Bio-Rad | 737-2512 | 49 ml 体积 ECONO-Column |
| 质粒小提试剂盒 | Omega Bio-Tek | D6943-01 | |
| PowerPac HC 电源 | Bio-Rad | 164-5052 | 250 V，3 A，300 W |
| 圆底聚丙烯共聚物离心管 | VWR | 3119-0050 | 50 ml 离心管，适用于 JA 25.50 转子 |
| Spin-X UF 浓缩管 | Corning | 431488, 431483 | 20 和 6 ml；截留分子量：10,000 Da |
| 亚克隆服务 | GenScript USA Inc. | 蛋白服务 | |
| 超声波处理器 | Cole-Parmer | 18910445A | 型号 CV18 |
| Vortex-Genie 2 | Scientific Industries | SI-0236 | 型号 G560 |
参考文献
- Itakura, K., et al. Expression in Escherichia coli of a chemically synthesized gene for the hormone somatostatin. Science. 198 (4321), 1056-1063 (1977).
- Goeddel, D. V., et al. Expression in Escherichia coli of chemic....
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重印与许可
