活体成像小鼠胚胎大脑皮层发育过程中的有丝分裂

摘要

神经前体细胞的有丝分裂是神经发生过程中的一个关键参数。目前对神经前体细胞有丝分裂的大部分认识主要基于对固定组织的分析。在胚胎脑切片中进行活体成像是一种多功能的技术，可在受控环境中以高时间和空间分辨率评估有丝分裂过程。

摘要

尽管有丝分裂持续时间较短，但它是一个复杂且动态的多步骤过程，对包括大脑在内的器官发育至关重要。在发育中的大脑皮层中，神经前体细胞的有丝分裂异常可导致脑体积和功能的缺陷。因此，迫切需要开发工具以深入理解神经前体细胞有丝分裂的机制。啮齿类动物的皮层发育是研究这一过程的优秀模型。神经前体细胞的有丝分裂通常在固定的脑切片中进行观察。本方案将详细描述一种用于活体成像有丝分裂的方法 离体 胚胎脑切片。我们将描述该实验的关键步骤，包括：脑组织提取、脑组织包埋、振动切片机制备脑切片、切片染色与培养，以及延时成像。随后，我们将演示并详细说明如何进行有丝分裂的图像采集后分析。本实验示例结果使用了活体染料Syto11、转基因小鼠（组蛋白H2B-EGFP和中心粒centrin-EGFP）以及 在子宫内 电穿孔（mCherry-α-tubulin）。我们将讨论如何最优地优化该操作流程，以及如何对其进行修改以研究有丝分裂的遗传调控。在脑切片中对有丝分裂进行活体成像，是一种灵活的方法，可在受控环境中评估年龄、解剖结构和遗传干扰的影响，并以高时间和空间分辨率生成大量数据。因此，本方案将补充现有的神经前体细胞有丝分裂分析工具。

引言

本实验方案的总体目标是描述如何在胚胎脑切片中进行神经前体细胞有丝分裂的活体成像。通过在体外培养条件下对脑切片进行活体成像，本方案提供了一种简便的方法，可在高度接近体内环境的条件下，检测神经前体细胞有丝分裂的多个方面 体内 环境。该方法可应用于突变动物的脑组织和/或经过实验干预处理的脑组织 在子宫内 电穿孔^1-5该技术还可通过向培养基中添加药理学试剂，简便地检测这些试剂对神经前体细胞有丝分裂的影响。总之，本文将使研究神经发生的研究人员能够更便捷地掌握这一技术上具有挑战性的实验方案。

在神经发生过程中，不同的神经前体细胞群体通过精确的分裂产生神经元，这些神经元最终形成成年新皮层的六层结构^6-8。在皮层发育早期，神经前体细胞池通过神经上皮（NE）细胞的对称分裂实现自我更新并扩增。随后，NE细胞转化为放射状胶质细胞（RGCs）。最初，RGCs通过对称分裂产生两个新的RGCs；然而在神经发生的主要阶段，RGCs主要以不对称方式分裂。在不对称分裂中，一个RGC产生一个新的RGC以及一个终末分裂神经元，或一种更特化的前体细胞（包括短神经前体细胞（SNP）、外放射状胶质细胞（ORG）或中间前体细胞（INP）^2,3,7,9。INPs、SNPs和ORGS随后分别在皮层的室下区、脑室区和基底部生成神经元。因此，前体细胞的细胞分裂是生成新皮层神经元的基本过程。

方案

1. 培养基的制备（图1，步骤1）

1. 切片培养基
   1. 25 ml 的脑片培养基足以制备5个玻璃底培养皿，每孔放置2片脑片。
   2. 在50 ml锥形管中，加入250 µl 100倍N2溶液和500 µl不含维生素A的50倍B27溶液，再加入DMEM/F12培养基至总体积为22.5 ml。
   3. 过滤除菌溶液，随后加入 1.25 ml 热灭活马血清和 1.25 ml 胎牛血清。
   4. 在37 °C水浴中孵育溶液 在切片制备的整个过程中。
   5. 添加生长因子（FGF 和 EGF，终浓度为 10） ng/ml 和 20 ng/ml）后立即开始培养。该培养基的成分配比已优化，旨在促进培养细胞的存活，并提高神经前体细胞的增殖速率，从而最大限度地增加在脑片中观察到有丝分裂细胞的概率。
2. 完全HBSS解离液
   1. 加入50 ml 10倍浓缩HBSS、1.25 ml 1 M Hepes（pH 7.4，终浓度2.5 mM）、6 ml 2.5 M D-葡萄糖（终浓度30 mM）和2.2 ml 0.9 M NaHCO₃，用去离子水定容至500 ml，配制完全HBSS溶液。₃ （FC 4 mM）和高压灭菌的diH₂O 至终体积 500 ml。
   2. 过滤除菌后，于 4 °C 保存，直至收....

结果

该实验的成功以及在一次活体成像过程中观察到多个有丝分裂细胞，很大程度上取决于切片的完整性和进行图像采集时切片所处的解剖位置。如下文所述，切片的解剖位置是一个重要因素。图3A展示了我们在前后方向（rostral-caudal）和内侧-外侧方向（medial-lateral）上获得最佳结果的位置。有关此主题的进一步讨论，请参见Noctor²⁶。切片的完整性在不同区域可能存在差异，这可在开始延时成像前通过观察整个切片（如步骤7.6所述）进行判断。在E13.5胚胎脑组织的良好区域中，可观察到以下特征：在脑室边缘可发现大量有丝分裂细胞，间期细胞核呈椭圆形而非圆形，且相对于脑室边缘呈柱状排列。而在质量较差的脑组织区域中，细胞核则呈现圆形且排列略显紊乱（比较图3B与图3C，并参见图3D中一张切片状态良好的示意图）。

当达到理想条件时，该实验可实现对有丝分裂不同阶段的定性鉴定。这些阶段可通过DNA模式的分析来识别（见图3E

讨论

我们所描述方案的主要优势在于，它能够提供神经前体细胞有丝分裂的动态时间分辨率。通常，可视化发育中脑组织有丝分裂的实验是通过固定组织切片的免疫荧光染色来完成的。但这种方法仅能提供某一时间点的有丝分裂快照。

在脑切片中进行有丝分裂成像时，有几个步骤尤为关键：1）脑切片应始终保持附着在琼脂糖上，以在转移和装片过程中维持脑组织切片的完整性。2）在切片制备与成像过程中，需控制前后（头-尾）方向的切片位置。通常尾侧脑切片效果最佳，因为在这些切片中，放射状胶质细胞（RGC）的基底突起能够保持完整，有利于细胞的健康状态。3）进行活细胞成像时，使用配备60倍物镜的共聚焦转盘显微镜效果最佳，既可实现高分辨率，又能避免Syto11染料引起的光漂白现象。4）活细胞成像时，图像采集的时间参数至关重要。根据所用显微镜设备的不同，可设置每1分钟至每10分钟进行一次时间序列成像。间隔超过10分钟通常过长，难以捕捉有丝分裂的高分辨率动态过程。

该方案确实存在一定的局限性。实验是使用 离体 组织。可以想见，在脑切片中获得的观察结果可能有所不同 .......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
100X N2	Life technologies	17502048	用于培养基
50X B27（不含维生素A）	Life technologies	12587010	用于培养基
DMEM/F12	Life technologies	11320033	用于培养基
热灭活马血清	Sigma Aldrich	H1138-500ml	用于培养基
热灭活小牛血清	Sigma Aldrich	F4135-500ML	用于培养基
FGF	R&D Systems	3139-FB-025	用于培养基
EGF			用于培养基
10X HBSS	Life technologies	14065-056	用于胚胎解剖
Hepes游离酸	Sigma Aldrich	H4034	稀释至1 M（pH 7.4）
2.5 M D-葡萄糖	Sigma Aldrich	G8769	用于胚胎解剖
0.9 M NaHCO3	Life technologies	25080-094	用于胚胎解剖
低熔点琼脂糖	Fisher	BP165-25	用于制备切片
Syto11	Life technologies	S7573	分装为5µl等份
3 mg/ml I型胶原酶	Life technologies	A1048301	用于切片培养
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-1.5-14-C	用于切片培养
培养皿			用于胚胎解剖
数字温度计			用于测量琼脂糖温度
刮铲			用于转移脑组织
画笔			转移脑组织的替代工具
振动切片机	Leica	VT1000s	用于制备切片
解剖显微镜			用于胚胎解剖
成像显微镜			需要配备共聚焦显微镜，并配有孵育腔室