Multiplex-Assays können nützliche Informationen für grundlegende zelluläre Mechanismen und beseitigen Abfälle von Reagenzien und unnötig wiederholende Experimenten. Wir beschreiben hier ein Multiplex-Caspase-3/7 Aktivitätstest unter Verwendung von fluoreszierenden und lumineszier-basierte Verfahren, um die Lebensfähigkeit der Zellen in einem in vitro Modell Hypothalamus folgenden oxidativen Herausforderung mit Palmitinsäure bestimmen.
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Methodenartikel
Verwendung eines Caspase Multiplexing-Test zur Apoptose in einer Zelle Hypothalamus Modell ermitteln
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die Fähigkeit, Tests in Studien von komplexen zellulären Mechanismen Multiplexen beseitigt die Notwendigkeit für wiederholte Versuche, stellt die internen Kontrollen und verringert Abfall Kosten und Reagenzien. Hier beschreiben wir die Optimierung eines Multiplex-Assays, um die Apoptose zu beurteilen Ein Palmitinsäure (PA) Herausforderung in einem in vitro-Modell des Hypothalamus, unter Verwendung von sowohl Fluoreszenz-und Lumineszenz-basierten Assays, um lebensfähige Zellzahlen und Caspase-3/7-Aktivität in einer 96-Well-Messung Mikrotiterplatten-Format. Nach PA Challenge wurden lebensfähigen Zellen durch eine Resazurin-basierte Fluoreszenztest bestimmt. Caspase-3/7 Aktivität wurde dann unter Verwendung eines luminogenen Substrat, DEVD und normalisiert auf die Zellzahl. Dieses Multiplexing Assay ist eine nützliche Technik zum Bestimmen Änderung Caspase-Aktivität nach einer apoptotischen Stimulus, wie z. B. gesättigte Fettsäure Herausforderung. Die gesättigten Fettsäuren PA Hypothalamus oxidativen Stress und Apoptose zu erhöhen, was die potenziellen Einfuhrnz der Assays wie hier beschrieben in die Untersuchung der Beziehung zwischen gesättigten Fettsäuren und neuronalen Funktion.
Einleitung
Ernährung reich an gesättigten Fettsäuren, wie Palmitinsäure (PA) haben, Fettleibigkeit und andere Begleiterkrankungen, einschließlich Herz-Kreislauf-Erkrankungen und Diabetes 1, 2 verbunden worden. Hohe Fett-Diäten haben auch gezeigt, dass oxidativer Stress, Apoptose und neuronale Degeneration im Hypothalamus, einem wichtigen Regulator der Appetit und Energieaufwand 3-7 erhöhen. Das Verständnis der Mechanismus, durch den hohen Fett-Diät-Exposition induziert Hypothalamus Dysregulation ist somit wichtig für die Entwicklung von pharmakologischen Behandlungen für Übergewicht. , Die zellulären Mechanismen, durch die Nahrungsfett beeinflusst die neur....
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Protokoll
1. Überzug und Pflege von Zellkultur
- Warme Dulbecco modifiziertem Eagle Medium (DMEM), Kulturmedien (DMEM + 10% FBS + 1% Penicillin / Streptomycin / Neomycin) bis 37 ° C
- Erhalten Lager von gefrorenen Zellen A12 von -80 ° C
- Schnell auftauen Zellen in 37 ° C Wasserbad; einmal aufgetaut, sanft Pipette Zellen auf eine 75 cm 2 entlüftet Kulturflasche übertragen und 10 ml der Kulturmedien.
- Inkubieren Kolben über Nacht in 5% CO 2 Inkubator bei 37 ° C. Saugen Medien nach 24 Stunden und ersetzen mit frischen Medien. Weiterhin wachsende Zellen, bis 70-80% Konfluenz erreicht ist (2-3 Tagen Wachstum).
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Ergebnisse
Das Protokoll oben beschrieben, führt Multiplexen zwei Assays zur Bestimmung Mechanismen des Zelltods. Fig. 1 zeigt eine Übersicht über das Protokoll zur Zelllebensfähigkeit und Caspase-3/7-Aktivität zu bestimmen. Caspase-Aktivität wurde in Zellen, die mit PA nach 2 h Inkubation (Fig. 2A und Tabelle 1) in Frage deutlich erhöht. Verlust der Zellmembranintegrität ist eine morphologische Veränderung mit der Induktion von Apoptose, die nach 2 Stunden Einwirkung PA (.......
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Diskussion
Das Multiplex-Assay ist ein gut anerkanntes Verfahren, die von Wissenschaftlern in zahlreichen Anwendungen wie PCR-Mikroarrays, Immun und andere Protein-basierten Nachweismethoden 13, 14 verwendet wurde. Kürzlich, Multiplexing-Tests haben sich in den in-vitro-Platte-basierte Experimente zunehmend genutzt und haben als eine genaue Methode zur Bewertung der Zytotoxizität validiert und Lebensfähigkeit 12. In dem obigen Protokoll zeigen wir die Wirksamkeit der Multiplex-Fluoreszenz-und Lumines.......
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Offenlegungen
Die Autoren haben keine Konflikte offen zu legen.
Danksagungen
Die hier beschriebene Arbeit wurde durch das US Department of Veterans Affairs Biomedical Laboratory Forschung und Entwicklung BX001686-1A1 und VA Rehabilitation Forschung und Entwicklung finanziert.
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Materialien
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Adulte Maus-Hypothalamus-Zelllinie mHypoA-1/2 | Cellutions Biosystems Inc. | CLU172 | |
| Dulbecco' s Modifizierter Adler" s Medium | Invitrogen | 10313-039 | |
| Fötales Rinderserum | PAA Labs | A15-751 | |
| Penicillin/Streptomycin | Invitrogen | 15070-063 | |
| Palmitinsäure | Sigma-Aldrich | P0500 | |
| Dimethysulfoxid | Sigma-Aldrich | D2650< | |
| br/> PrestoBlue Reagenz für die Zellviabilität | Invitrogen | A13262 | |
| Caspase-Glo 3/7 Assay Systems | Promega | G8091 | |
| 96 W Optische Bodenplatte, schwarzes Polystyrol, in Zellkulturen behandelt, mit Deckel, steril | Thermo Fisher Scientific | 165305 | |
| SpectraMax M5 Multi-Mode Mikrotiterplatten-Molekulare | Bauelemente |
Referenzen
- Akil, L., Ahmad, H. A. Relationships between obesity and cardiovascular diseases in four southern states and Colorado. J. Health Care Poor Underserved. 22, 61-72 (2011).
- Posey, K. A., et al. Hypothalamic proinflammatory lipid accumulation, inflammation, ....
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Nachdrucke und Genehmigungen
