وترد تفاصيل بروتوكول للفي المختبر وضع العلامات الخلايا الجذعية الجنينية البشرية مع ثاني النانوية توليد التوافقي. وتعرض أيضا منهجيات التحقيق HESC بواسطة المجهر متعدد الفوتون والتمايز بهم في مجموعات القلب.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
في هذه التجربة تصور، وتقدم تفاصيل البروتوكول في المختبر لوضع العلامات من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية (HESC) مع النانوية الجيل الثاني التوافقي (HNPs). هذه الأخيرة هي عائلة جديدة من تحقيقات أدخلت مؤخرا لوصفها العينات البيولوجية للتصوير متعددة الفوتون. HNPs قادرة على مضاعفة وتيرة ضوء الإثارة من خلال عملية البصرية غير الخطية من الجيل الثاني التوافقي مع عدم وجود قيود على الطول الموجي الإثارة.
متعدد الفوتون منهجيات HESC التمايز في مجموعات القلب (كما حافظت الثقافات الهواء السائل على المدى الطويل) استنادا يتم عرض بالتفصيل. على وجه الخصوص، وأظهرت الأدلة على كيفية تعظيم مكثفة الثاني التوافقي (SH) انبعاث HNPs معزولة خلال الرصد 3D من الضرب أنسجة القلب في 3D. هو مفصل أيضا تحليل الصور الناتجة لاسترداد أنماط النزوح 3D.
المقدمة
أنظمة غير الخطية المجهري، وذلك بفضل قدرات الكامنة ثلاثة باجتزاء الأبعاد بهم، وقد أدت على نحو متزايد الطلب على صورة مستقرة fluorophores مع عصابات امتصاص ثنائي الفوتون في المستقبل القريب من الأشعة تحت الحمراء. فقط في العامين الماضيين، لاستكمال تطوير العلامات المستندة إلى مضان (الأصباغ، ونقاط الكم، النانوية تحويل متابعة)، وقد تم التصوير منهجية مختلفة الاستفادة من استخدام أسرة رواية الجسيمات النانوية غير الخطية بطبيعتها عن التسميات، أي النانوية التوافقي (HNPs) التي تم تطويرها خصيصا لمتعدد الفوتون المجهري. هذه التسميات، استنادا إلى بلورات noncentrosymmetric غير العضوية، وممارسة النقيض البصرية توليد SH من وتيرة الإثارة: على ....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
1. الثقافة وتوسيع ESC الإنسان
- إعداد وسط الانتشار الخلية (وتسمى PM) تحتوي على خروج المغلوب DMEM تستكمل مع 20٪ مصل خروج المغلوب، 1٪ MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية، 1٪ الجلوتامين L-200 ملم، 1٪ البنسلين الستربتوميسين، و 3.5 ميكرولتر β-المركابتويثانول.
- ذوبان الجليد ESC الإنسان (HESC) في 8 مل PM المتوسطة وأجهزة الطرد المركزي منهم 5 دقائق في 115 x ج لتجاهل تستكمل DMSO تجميد المتوسطة.
- إضافة 1 مل من PM المتوسطة التي تحتوي على 10 ملي روك المانع لم....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
قبل تقييم النشاط الضرب بواسطة التصوير متحد البؤر، تم إجراء توصيف دقيق للاستجابة البصرية غير الخطية من المرشحات السليكوون، إما وحده أو في وجود HNPs في تركيز عال (1 ملغ / مل). تم التأكد من أن: ط) الركيزة العارية اثنين من الفوتون مضان متحمس ضعيف جدا، ولا يمكن منع قياس العينات البيولوجية ذات الصلة، والثاني) انبعاث SH من HNPs معزولة يمكن الحصول عليها بسهولة عن طريق التصوير من خلال الركيزة في وضع برنامج التحصين الموسع للكشف عن (الشكل 2). كان الهدف أن يكون الضوابط المرجع.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
تطبيق تكنولوجيا النانو لأبحاث الخلايا الجذعية هو حقل جديد نسبيا ولكن التوسع السريع. كما أشار إلى ذلك العديد من المقالات مراجعه عن هذا الموضوع، واستخدام الجسيمات النانوية يمكن تطبيقها على إنجاز المهام البحثية المختلفة، بدءا من خلية تتبع (سواء في التجارب المختبرية والحية)، إلى التسليم داخل الخلايا من البروتينات والجينات، وخلق ليس أقلها البيئات الخلوية بيوميمتيك لالتفضيلية التحفيز / تثبيط تمايز مسارات محددة 19،20. النهج الموصوفة في هذا البروتوكول يقتصر على تتبع بص.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
والكتاب ليس لديهم ما يكشف.
شكر وتقدير
فإن الكتاب أود أن أنوه تمويل جزئي من FP7 مشروع بحث مشروع INTERREG الرابع فرانس سويسرا NAOMI NAMDIATREAM الأوروبية (NMP4-LA-2010-246479، http://www.namdiatream.eu) و.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| حاضنة المجهر | OKO LAB | UNO package (المرحلة العليا) | 37 & deg; C ، 5٪ CO2< / sub> ، |
| مجهر متعدد الفوتون | مرطب Nikon | AR1-MP | |
| مسح سريع ، أربعة كاشفات | |||
| مرشحات SHG والتألق الذاتي | Semrock | FF01-360 / 12-25 | |
| FF01-395 / 11-25 ؛ | |||
| FF02-485 / 20-25 | |||
| أهداف المجهر | نيكون | ||
| CFI Plan Fluor 10X | NA 0.30 ، WD 16 مم | ||
| CFI Plan Apo 20X | NA 0.75 ، WD 1.0 مم ، VC | ||
| CFI Apo 40X | NA 1.25 ، WD 0.18 مم & lambda ؛ S ، مثبط Rhock معطف النانو | ||
| الكريستالي ؛ | سيجما | Y-27632 | |
| خروج المغلوب DMEM | Invitrogen | 10829 | |
| ضربة قاضية مصل | Invitrogen | 10828 | |
| MEM الأحماض الأمينية غير الأساسية | Invitrogen | 1140 | |
| L-glutamine 200 mM & nbsp ؛ | Invitrogen | 25030 | |
| Penicillin-Streptomycin | Invitrogen | 15140 | |
| β-mercaptoethanol | سيجما | M7522 | |
| كولاجيناز IV ؛ | Gibco | 17104-019 | |
| أداة مكشطة الأسطوانة | StemPro EZPassage, Invitrogen | 23181-010 | |
| StemPro Accutase | نظام Gibco | S11105-01 | |
| Aggrewell | StemCell Technologies | 27845 | |
| Hyclone serum | Thermo Scientific | SH30070.03 | |
| الجيلاتين | Sigma | G9391 | |
| 6 آبار ألواح | فالكون | 353046 | |
| 24 بئر أطباق | مرشحات Nunclon | 142475 | |
| Polytetrafluoroethylene (PTFE) | Millipore | NA76 / 25 | |
| Inserts | Millipore | PICM03050 |
المراجع
- Bonacina, L., et al. Polar Fe(IO3)3 nanocrystals as local probes for nonlinear microscopy. Applied Physics B-Lasers and Optics. 87, 399-403 (2007).
- Nakayama, Y., et al. Tunable nanowire nonlinear optical probe. Nature. 447, 1098-1101 (2007)....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
