Summary
Proteínas de la superficie celular son biológicamente importantes y ampliamente glicosilada. Presentamos aquí un enfoque glucopéptidos captura para solubilizar, enriquecer y deglycosylate estas proteínas para análisis proteómicos fáciles LC-MS basados.
Abstract
Proteínas de superficie celular, incluyendo las proteínas de la matriz extracelular, participan en todos los principales procesos y funciones celulares, tales como el crecimiento, la diferenciación y la proliferación. Una caracterización completa de estas proteínas proporciona una rica información para el descubrimiento de biomarcadores, la identificación del tipo de célula, y la selección de medicamentos-objetivo, así como ayudar a avanzar en nuestra comprensión de la biología celular y fisiología. Proteínas de superficie, sin embargo, plantean desafíos analíticos significativos, debido a su inherente baja abundancia, alta hidrofobicidad, y las modificaciones posteriores a la traducción pesados. Tomando ventaja de la glicosilación prevalente en proteínas de la superficie, se introduce aquí un enfoque glicopéptido de captura de alto rendimiento que integra las ventajas de varios medios N-glycoproteomics existentes. Nuestro método puede enriquecer los glicopéptidos derivados de proteínas de la superficie y retire sus glicanos para proteómica fáciles utilizando LC-MS. La N-glicoproteoma resuelto comprende la información de la identidad y la cantidad de proteínas, así como sus sitios de glicosilación. Este método se ha aplicado a una serie de estudios en áreas que incluyen el cáncer, las células madre, y la toxicidad del fármaco. La limitación del método radica en la baja abundancia de proteínas de la membrana de superficie, de tal manera que se requiere una cantidad relativamente grande de muestras para este análisis en comparación con estudios centrados en las proteínas citosólicas.
Introduction
Proteínas de superficie celular interactúan con el medio ambiente extracelular y transmiten señales desde el exterior al interior de una célula. Por lo tanto, estas proteínas, incluyendo las proteínas de la matriz extracelular, desempeñan papeles críticos en todos los aspectos de la biología celular y la fisiología que van desde la proliferación, el crecimiento, la migración, la diferenciación al envejecimiento y así sucesivamente. Proteínas de superficie funcionan mediante la interacción con otras células, proteínas y moléculas pequeñas 1-3. La caracterización molecular de las proteínas de la superficie celular es de gran interés no sólo para los biólogos sino también para las empresas farmacéuticas, ya que más del 60% de los medicamentos están dirigidos a las proteínas de la superficie celular 4.
Espectrometría de masas tándem (MS), con su sensibilidad superior, exactitud, y el rendimiento para la identificación de proteínas y péptidos, ha sido una herramienta poderosa para los estudios proteómicos globales 5,6. Sin embargo, las proteínas de superficie plantean importantes desafíos a la proteómica basadas en MS, comoexisten la mayoría de las proteínas de la superficie en cantidades bajas y con modificaciones pesados. Las regiones que abarcan la membrana de las proteínas de la superficie hacerlos hidrófobo; esto es especialmente el caso para las proteínas transmembrana multipaso. Es por lo tanto difícil de disolver proteínas de membrana en soluciones acuosas sin la ayuda de un detergente; sin embargo, el uso de detergentes generalmente suprime el rendimiento de HPLC y MS 1,7,8 en la identificación de proteínas. Por lo tanto, las proteínas de membrana han sido mal caracterizada proteómica directas basadas LC-MS.
La glicosilación es una de las modificaciones post-traduccionales más importantes y abundantes que tienen lugar en las proteínas de la superficie celular 9. La enorme complejidad y heterogeneidad de los glicanos obstaculizan MS señal de péptidos "10. Sin embargo, varios métodos proteómicos han utilizado esta modificación única para enriquecer las proteínas de superficie y para eliminar los restos de azúcar a partir de proteínas antes del análisis LC-MS. Estos métodos incluyen a base de la lectina de afinidad de captura 11 y captura química a base de ácido bórico o basado-hidrazida 12, así como las separaciones de cromatografía hidrófilos 8,13. La eliminación de los glicanos transforma proteínas de la membrana a las proteínas regulares y simplifica drásticamente la caracterización MS. Debido a que la glicosilación tiene lugar también en las proteínas secretadas que tienen alta solubilidad en contraste con proteínas de la membrana, muchos métodos glycoproteomic están optimizados para proteínas solubles, y tienden a tener menor selectividad glicopéptido y la sensibilidad cuando se realiza el despliegue proteínas de membrana 8,14. Otros métodos también existen para enriquecer, en particular, las proteínas de la superficie celular, tales como los que utilizan ultracentrifugación 15 y estrategias de etiquetado 16. Una comparación detallada entre nuestro método y otros métodos existentes para la caracterización de proteínas de la membrana se llevó a cabo recientemente 17, y los resultados indicaron que nuestro método puede llevar a cabo igualmente bien, si no semejor, que todos los métodos de proteómica membrana en comparación, pero con una mayor simplicidad.
Para ayudar a los investigadores utilizan este método, detallamos aquí un protocolo general. Este método integra varias ventajas de las estrategias de glycoproteomics existentes y se diseñó específicamente para glicoproteínas de membrana, sin embargo, el método funciona igual de bien para las proteínas secretadas. Las características de este método incluyen: 1) una completa solubilización de proteínas de membrana, 2) un enriquecimiento de glicopéptidos en lugar de glicoproteínas para eliminar el impedimento estérico potencial cuando se utiliza un sustrato sólido de captura, 3) el uso de la química hidrazida para formar enlaces covalentes entre glicopéptidos y el sustrato de captura, de tal manera que los glicopéptidos unidos pueden tolerar lavados rigurosos para alta glycoselectivity, y 4) la capacidad para llevar a cabo todo el procedimiento de captura en un tubo para reducir la pérdida de muestra y se acorta la duración del procedimiento. Después de la aplicación de este método para el estudio de una variabledad de muestras biológicas incluyendo las células y los tejidos, se observó una alta selectividad (> 90%) a las glicoproteínas 8,17,18.
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Protocol
1. Cosecha Membranas
- Añadir tampón hipotónico (Tris-HCl 10 mM, KCl 10, 1,5 mM de MgCl 2, pH 8,0) con un cóctel inhibidor de la proteasa en un sedimento de células (~ 10 8 células) y se incuba durante 15-30 min en hielo. Lisar las células haciendo pasar la muestra a través de agujas de jeringa (5-10 pasadas) o la homogeneización de la muestra por un homogeneizador Dounce (15-30 golpes). Utilice un hemocitómetro y tinción con azul de tripano para comprobar la eficiencia de la lisis.
- Obtener la fracción microsomal por una centrifugación diferencial del lisado a 3.000 gx 15 min y después a 100 000 gx 2 h. La primera centrifugación obtiene un gránulo que es la fracción nuclear, y la posterior centrifugación del sobrenadante genera un segundo gránulo, que es la fracción microsomal que contiene la membrana plasmática, así como orgánulos unidos a la membrana 8. El sobrenadante final es la fracción citosólica. Guarde las fracciones microsomales de -80 ° C congelador durante más Analyses como se indica a continuación.
2. Disolver, Desnaturalizar, y digerir proteínas de membrana
- Disolver la fracción microsomal en el tampón de desnaturalización (40 mM de Tris, EDTA 10 mM, TCEP 10, 0,5% Rapigest, pH 8) y a continuación se incuba la solución a 100 ° C durante 10 min.
- Enfriar la solución se calentó a temperatura ambiente, añadir ultra-alta pureza en polvo urea en la solución a 8 M concentración final y se incuba la muestra a 37 ° C durante 30 min.
- Añadir solución de yodoacetamida a la muestra a 15 mM de concentración final, y se incuba la solución en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente para alquilar los tioles libres en la muestra. Añadir solución de DTT a la muestra a una concentración final de 10 mM y se incuba la solución durante otros 10 minutos a temperatura ambiente para enfriar rápidamente la yodoacetamida excesiva.
- Diluir 10 veces la solución obtenida con 40 mM de tampón Tris a pH 8, y, posteriormente, añadir tripsina a la muestra en una proporción 01:20 de trypsin de la proteína total. Mantener la reacción de digestión en un 37 ° C horno durante la noche para asegurar que se complete la reacción.
- Terminar la digestión por la acidificación de la solución de la muestra a pH 1 con HCl, una condición que también rompe el detergente, es decir, Rapigest. Degradar el Rapigest a 37 ° C durante 1 hora, y retire la precipitación desarrollado por centrifugación.
- Limpiar el sobrenadante que contiene péptidos de la muestra por un cartucho C-18 de extracción en fase sólida (SPE) y secar la muestra obtenida por SpeedVac.
- Realizar un análisis de SDS-PAGE de muestras antes y después de la digestión con tripsina para confirmar la eficacia de la digestión.
3. Captura glucopéptidos
- Disolver los péptidos limpiado en el tampón de acoplamiento (acetato de sodio 100 mM, pH 5,5). Añadir peryodato de sodio en la solución de péptido a una concentración final 10 mM durante 30 minutos en la oscuridad, a temperatura ambiente. Esto se oxida los grupos cis-diol en los glicanos a aldehídos, Que permiten que los glicanos para acoplar a la resina a través de la química hidrazida. Se detiene la peryodato excesiva por sulfito de sodio a una concentración final de 20 mM y pH 5 durante 10 min a temperatura ambiente.
- Introducir resina hidrazida derivatizado en la solución de péptido en una proporción de 01:04 (resina de solución) a par de glicopéptidos a la resina. Se incuba la reacción a 37 ° C durante 1-2 días con rotación de extremo a extremo para el acoplamiento completo.
- Retirar los péptidos no unidos por lavado de la resina dos veces con 1 ml de cada uno de los siguientes: agua DI, 1,5 M NaCl, metanol y 80% de acetonitrilo. Finalmente, lavar la resina con 3 x 1 ml de 100 mM NH 4 HCO 3 a pH 8 para intercambiar el tampón del sistema a 100 mM NH 4 HCO 3.
- Recoger el sobrenadante y los lavados para el análisis de péptidos no unidos (opcional).
- Soltar los N-glicopéptidos de la resina por PNGasa F en una incubación durante la noche a 37 ° C con unan de extremo a extremo de rotación. Recoge los péptidos liberados por centrifugación y un lavado con acetonitrilo al 80%. Se seca la solución obtenida en el SpeedVac para el análisis LC-MS.
4. Fraccionamiento adicional (opcional)
Para simplificar aún más la complejidad de la muestra, fraccionar los N-glicopéptidos obtenidos. Por ejemplo, volver a disolver los péptidos secos en 10 mM de formiato de amonio, pH 3 con 20% de acetonitrilo y el uso de intercambio catiónico fuerte (SCX) cromatografía para fraccionar los péptidos. Seque el eluyente obtenido, y luego analizar las fracciones de péptidos obtenidos por fase inversa LC-MS 8,17,18.
5. Limpieza de los N-glicopéptidos Liberadas (Opcional)
Si se elevan las preocupaciones por la contaminación potencial de los péptidos, redisolver los péptidos secos en ácido fórmico al 0,1% y el uso de una columna de SPE MCX para limpiar aún más los péptidos antes de análisis por LC-MS de fase inversa.
Durante la escisión selectiva de N-glicopéptidos de la resina, PNGasa F convierte la asparagina vinculado-N glicano a un ácido aspártico. Por lo tanto, hay un 0,9840 Da desplazamiento de masa de los liberados N-glicopéptidos. Para identificar con precisión estos péptidos, se necesita añadir a los parámetros de búsqueda, junto con modificaciones comunes tales como la carbamidometilación de la cisteína y la oxidación de la metionina de esta modificación.
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Representative Results
Un diagrama de flujo representativo del procedimiento experimental se resume en la figura 1. El etiquetado y otras etapas de fraccionamiento son opcionales y detalles se describen en una publicación reciente 18. Otra opción es analizar los péptidos no modificados, que no reaccionan con la resina. Las ventajas de análisis de los péptidos no modificados incluyen el potencial de identificación de péptidos y proteínas no glicosiladas, tales como claudinas en uniones estrechas; Una ventaja adicional es la cuantificación más precisa. Sobre la base de estas ventajas, hemos llamado este método g-g lobal ssisted q roteomics p cuantitativas a (gagQP) a lycocapture-, y se detalla el análisis en un reciente publicaciones 18.
Un espectro típico glicopéptido tomada después del método de enriquecimiento se muestra en la Figura 2. En el glicopéptido obtenido, la N-glicanos se retiró y la asparagina-glicano unido (N) Wcomo convertido a un ácido aspártico (D) por PNGasa F; Por lo tanto, el espectro se puede buscar fácilmente utilizando cualquier motor de búsqueda en bases de datos proteómica de secuencia de proteínas común.
El método de captura puede ser evaluado por glicoproteínas modelo disponibles comercialmente antes de su aplicación con muestras biológicas complejas y valiosas. Algunos glicoproteínas modelo de uso frecuente incluyen avidina (de pollo), ovoalbúmina (pollo), la invertasa (levadura), α-1-antitripsina (humana), conalbúmina (pollo), y ribonucleasa B (bovina) (todos pueden ser obtenidos de Sigma). Los glicopéptidos con frecuencia identificados a partir de estas proteínas se pueden encontrar en una publicación anterior 8. Una base de datos FASTA proteína de secuencia personalizada que sea adecuada para la búsqueda automática de los resultados de LC-MS generados a partir de estas proteínas modelo se puede descargar desde el siguiente enlace (http://www.sfu.ca/chemistry/groups/bingyun_sun/tools.html ), que incluye las proteínas anteriores modelos cotizadas, así como una rev ersed la base de datos de levadura-secuencia, contaminantes comunes y PNGasa F.
Un típico resultado LC-MS de los N-glicopéptidos capturados se muestra en la Figura 3, en la que más de 100 glicoproteínas pueden ser identificados a partir de una sola LC-MS de ejecución de una fracción microsomal de células. La selectividad de enriquecimiento para ambas glicoproteínas y glicopéptidos es generalmente más de 90%. Un análisis exitoso puede tener una selectividad de enriquecimiento de 95%. El uso de una columna SCX y gradiente por etapas para fraccionar aún más las muestras antes de la LC-MS analiza por lo general duplicar el número de identificaciones de glicoproteína 17. A veces, cuando la cantidad de los glicopéptidos obtenidos es baja, la impureza acumulada de los viales se puede observar en la muestra final. Estos contaminantes pueden ser removidos por el método proporcionado en el paso 5.
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Pasos y diamantes Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento experimental. Rectángulos se requieren son pasos opcionales.
Figura 2. Colisión inducida disociación (CID) espectro de AEPIL N ISNAGPWSR de la levadura de Baker después de que el método de glicopéptido de captura. La asparagina subrayada (N) se convierte en el ácido aspártico (D) como se destaca en rojo en la secuencia del péptido en la figura .
Figura 3. 2D parcela de el resultado de LC-MS de la N-GLycopeptides obtenidos a partir de células madre embrionarias de ratón (E14.Tg2a). Los puntos son los péptidos detectados, y el color del punto representa la confianza de identificación obtenido estadísticamente (es decir, probabilidad de péptido).
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Discussion
Aquí presentamos una estrategia glucopéptidos captura para perfilar las proteínas de la superficie celular. El método se puede aplicar para estudiar las proteínas secretadas, tales como los de la sangre, así como en otros fluidos corporales o en medios de cultivo celular.
El éxito del método se basa en la digestión completa de las muestras; por lo tanto, una caracterización de SDS-PAGE de la eficiencia de la digestión es necesario, especialmente para el análisis por primera vez de una muestra. Una digestión completa puede ser un reto para las proteínas de membrana, y sólo puede ser posible después de la solubilización completa de la fracción de membrana. El proceso de solubilización comienza cuando se introduce el detergente y termina después de la incubación de la urea. Por lo tanto, si nubosidad presenta en la muestra antes de la adición de urea, pero desaparece después de la incubación de urea, la solubilización es suficiente. Si la fracción de membrana es difícil de disolver, aumentar la cantidad de detergente utilizado. Para las muestras de tejido de la membrana rica entales como los tejidos del cerebro y adiposo, 5% Rapigest se puede utilizar. A veces, la precipitación puede aparecer durante la dilución de las muestras antes de la digestión con tripsina, que se observa con más frecuencia para muestras de suero humano. La causa de esta precipitación es principalmente las concentraciones disminuidas de urea y detergente. Esta precipitación se eliminará generalmente por tripsina durante la digestión y no es una preocupación. Sin embargo, cuando las formas de precipitación, es importante para hacer girar el vial de la muestra durante la etapa de digestión para asegurar una buena mezcla. El pH de la etapa de glycocapture es importante porque las aminas primarias en péptidos, tales como los de N-terminal y lisinas, reaccionarán con los aldehídos recién formados después de la oxidación con peryodato. Por lo tanto, es importante para protonar estas aminas mediante el ajuste del pH de la solución de captura por debajo de 6,0 usando tampón de acetato, para evitar que interfieran con la captura.
Usando una relación de resina para capturar una soluciónredonda 01:03-01:04 asegura una mezcla suficiente durante la etapa de captura. Un mínimo de 50 l de resina es necesario en función de nuestra experiencia; cantidades menores harán que la posterior serie de lavados difíciles de realizar y se introducirá la pérdida de muestra severa debido a la pérdida de resina. Hemos obtenido buenos resultados usando 100-300 l de resina de 0,5 a 2 mg de proteína total. Sin embargo, la relación entre la cantidad de proteínas y la resina puede ser dependiente de la muestra, se recomienda a optimizar esta condición para sus muestras y aplicaciones específicas.
La química hidrazida captura ambos O-y glicopéptidos N-ligados en el sustrato; debido a la falta de una enzima eficaz para liberar todos los glicopéptidos O-ligados, que sólo se utiliza para los estudios PNGasa F N-glicopéptidos 8,12. La posibilidad de estudiar el tipo O de glucopéptidos puede requerir que el descubrimiento o la bioingeniería de hidrolasas adecuadas.
Este método se puede detener a varios pcordones, incluyendo: 1) después de la obtención de la fracción de membrana, 2) después de la digestión de tripsina y la limpieza de los péptidos, y 3) después de la liberación de los N-glicopéptidos. Procedimientos adicionales se pueden introducir durante estos intervalos. Por ejemplo, los péptidos digeridos pueden ser marcados de forma diferencial por n-isotags como se indica en la Figura 1, para el análisis cuantitativo. El uso de un método llamado gagQP, en el que se analizan los péptidos no modificados en paralelo con los glicopéptidos, la exactitud de la cuantificación puede ser mejorada significativamente como hemos demostrado en una publicación reciente 18.
Sí captura glicopéptido puede disminuir efectivamente la complejidad de la muestra, y por lo general no es necesario para fraccionar aún más las enriquecidos N-glicopéptidos. Las excepciones se aplican a las situaciones en las que las muestras son abundantes, pero con una dinámica de concentración considerables, y las proteínas de interés se encuentran en baja abundancia, como en el descubrimiento de biomarcadores de proteínas en la sangre opara un estudio completo de las proteínas de la superficie celular. En esas circunstancias fraccionamiento adicional se puede implementar para los N-glicopéptidos capturados para proporcionar una mejor penetración de la glicoproteoma. Como la parte inferior de la glicoproteoma se aborda a través de fraccionamiento, la identificación de los no glicopéptidos introducidas por la unión no específica se incrementará. Típicamente se observaron lo tanto una disminución de glicopéptido y la selectividad de la glicoproteína (a ~ 85%) después de un fraccionamiento adicional de N-glicopéptidos 17. Por lo tanto, los investigadores tienen que sopesar los pros y los contras al diseñar el procedimiento más adecuado.
Para los investigadores que nunca han usado un método de N-glicopéptido de captura, lo mejor es practicar el método con algunos N-glicoproteína (s) puro de haber conocido los sitios de glicosilación que se enumeran anteriormente 8. Este método es robusto y la selectividad para N-glicopéptidos es alta. Un inconveniente de este método reside en la baja abundancia inherente de surla cara N-glicoproteínas; para una caracterización completa de la muestra, una cantidad mayor generalmente se requiere que la de la proteómica citosólicas. Sin embargo, si las células cultivadas se pueden expandir in vitro o los tejidos de interés son abundantes, este inconveniente es insignificante.
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Disclosures
Los autores declaran que no tienen intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Esta investigación ha sido financiada por el fondo de puesta en marcha de la Universidad Simon Fraser.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DTT | Sigma | 646563 | |
| TCEP | Sigma | 646547 | |
| Iodoacetamide | Sigma | A3221 | |
| Rapigest SF | Waters | 186001860 | |
| Sodium periodate | Sigma | 311448 | |
| PNGase F | New England Biolabs | P0704S | |
| Affi-Gel Hz hydrazide gel | Bio-Rad | 153-6047 | |
| Trypsin | Worthington Biomedical | LS02115 | |
| Sep-Pak C-18 cartridge | Waters | WAT054955 | |
| Oasis MCX cartridge | Waters | 186000252 | |
| Protease inhibitor coctail | Sigma | P8340 | |
| Urea | Amersco | 568 | |
| Sodium sulphite | Caledon | 8360-1 | |
| Invertase | Sigma | I0408 | |
| α-1 trypsin | Sigma | F2006 | |
| Ribonulease B | Sigma | R7884 | |
| Avidin | Sigma | A9275 | |
| Ovalbumin | Sigma | A5503 | |
| Conalbumin | Sigma | C0755 |
References
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