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Neuroscience

में सहज हरकत गतिविधि का निर्धारण Published: April 10, 2014 doi: 10.3791/51449
Automatic Translation
1, 1, 1
1Genetics and Developmental Biology, School of Medicine, University of Connecticut Health Center

Summary

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर ऐसे सहज हरकत गतिविधि के रूप में व्यवहार को प्रभावित है कि आनुवंशिक या पर्यावरणीय जोड़तोड़ का अध्ययन करने में उपयोगी होते हैं. यहाँ हम अवरक्त बीम और सहज हरकत गतिविधि यों तो डेटा विश्लेषण सॉफ्टवेयर के साथ नज़र रखता इस्तेमाल करता है कि एक प्रोटोकॉल का वर्णन.

Abstract

ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर व्यवहार को प्रभावित है कि पर्यावरण और आनुवंशिक जोड़तोड़ का अध्ययन करने के लिए एक उत्कृष्ट मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है. ऐसा ही एक व्यवहार सहज हरकत गतिविधि है. यहाँ हम ड्रोसोफिला आबादी पर नज़र रखता है और एक समय में कई दिनों के लिए मक्खियों का सहज हरकत गतिविधि की सतत निगरानी की अनुमति देता है कि एक ट्रैकिंग प्रणाली का इस्तेमाल करता है कि हमारे प्रोटोकॉल का वर्णन. इस विधि, सरल, विश्वसनीय, और उद्देश्य है और उम्र बढ़ने, लिंग, भोजन की गरमी सामग्री में परिवर्तन, दवाओं के अलावा, या मानव रोगों कि नकल आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव की जांच करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

Introduction

फल मक्खियों, ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर, सीखने और स्मृति, सामाजिक संपर्क, आक्रामकता, नशीली दवाओं के दुरुपयोग, नींद, संवेदी समारोह, प्रेम प्रसंग, और 1,2 संभोग के रूप में जटिल व्यवहार अंतर्निहित तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव के रूप में इस्तेमाल किया गया है. कई प्रोटोकॉल के माध्यम से अध्ययन किया गया है कि एक व्यवहार सहज हरकत गतिविधि है. नकारात्मक geotaxis ड्रोसोफिला गतिविधि को मापने के लिए विकसित की पहली तरीकों में से एक था, और इस प्रोटोकॉल मक्खियों कंटेनर 1,3 की तह तक हिल गया के बाद शीशी की एक निश्चित ऊंचाई तक पहुँचने कि मक्खियों का प्रतिशत मापने शामिल है. इस विधि में, सीधा सस्ती होने के फायदे हैं, और यह किसी भी प्रयोगशाला में किया जा सकता है किसी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं होती है. यह मक्खी गतिशीलता 3 पर विभिन्न आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए एक मूल्यवान स्क्रीनिंग उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया गया है. हालांकि, यह समय और श्रम गहन एक हैएन डी कारण शीशियों और मानव रिकॉर्डिंग के चर झटकों को पूर्वाग्रह की संभावना है.

नकारात्मक geotaxis विधि नीचे करने के लिए मक्खियों के झटकों निम्नलिखित मक्खी शीशियों की तस्वीरें लेता है जो तेजी से चलने का नकारात्मक geotaxis (रिंग) विधि 4,5, के विकास के द्वारा पर सुधार हुआ है. इस प्रोटोकॉल का लाभ इसकी संवेदनशीलता और एक ही समय में मक्खी शीशियों की एक बड़ी संख्या का परीक्षण करने की संभावना है. हालांकि, इस प्रोटोकॉल अभी भी मानव त्रुटि के लिए क्षमता है, और केवल नकारात्मक geotaxis के उपाय. अन्य प्रयोगशालाओं हरकत गतिविधि 6 निर्धारित करने के लिए संस्कृति शीशियों में साधारण अवलोकन का इस्तेमाल किया है.

हाल ही में मक्खी हरकत गतिविधि को मापने के लिए कई वीडियो रिकॉर्डिंग सिस्टम विकसित किया गया है. एक वीडियो निगरानी प्रोटोकॉल 7 रिकॉर्डिंग से पहले समायोजन के लिए समय प्रदान करता है. Slawson एट अल द्वारा वर्णित विधि. भी movemen को रोकने के लिए एक हवाई नाड़ी का उपयोग करता हैसंभावित जानवरों 7 पर तनाव हो सकता है जो रिकॉर्डिंग के शुरू, जब तक टी. इस विधि औसत गति, अधिकतम गति, गति में समय बिताना, आदि एक और तीन आयामी ट्रैकिंग प्रणाली मुक्त उड़ान टेकऑफ़ 8 ~ 0.2 सेकंड के दौरान व्यक्तिगत मक्खियों के अधिक से अधिक वेग के उपायों पर जानकारी प्रदान करता है. एक तीन आयामी वीडियो निगरानी प्रोटोकॉल GFP और मक्खी गतिशीलता 9 निर्धारित करने के लिए प्रतिदीप्ति का पता लगाने के लिए अनुमति फिल्टर के साथ लगे कई कैमरों व्यक्त मक्खियों का उपयोग करता है. इस प्रोटोकॉल में मक्खियों की वजह से ड्रोसोफिला संस्कृति की आकृति में संभावित है जो बेलनाकार उड़ान पैटर्न, प्रदर्शन करते हैं 10 शीशियों. इस विधि दो मक्खियों 11 का सहज आंदोलन को मापने की अनुमति देता है कि एक गुंबद का उपयोग करके सुधार किया गया था. स्वचालित रूप से नजर रखने और ड्रोसोफिला की व्यक्तिगत और सामाजिक व्यवहार यों तो एक कैमरा का उपयोग करता है कि एक उच्च throughput विधि भी 12 वर्णित किया गया है. Zou एटअल. पीने, खाने, उड़ान, चलती है, जीवन भर के व्यवहार और इस तरह के विश्राम के रूप में आंदोलनों रिकॉर्ड करने के लिए दो कंप्यूटर की मदद से कैमरे का उपयोग करता है, या व्यक्तिगत tephritid फल की मौत 13 मक्खियों कि एक व्यवहार की निगरानी प्रणाली (बीएमएस) विकसित की है. कई अन्य वीडियो सिस्टम मक्खी व्यवहार गतिविधि 14,15 नजर रखने के लिए विकसित किया गया है.

यहाँ हम जनसंख्या पर नज़र रखता है कि इस्तेमाल ड्रोसोफिला गतिविधि बढ़ाता के लिए एक विधि का वर्णन. इन पर नज़र रखता है एक 12 घंटे की दिन रात प्रकाश चक्र पर 25 डिग्री सेल्सियस तापमान और आर्द्रता नियंत्रित इन्क्यूबेटरों में रखे जाते हैं. प्रत्येक आबादी पर नजर रखने के लिए तीन अलग अलग ऊंचाई पर तैनात छल्ले में रखा अवरक्त बीम हैं. एक मक्खी के छल्ले के पार ले जाता है हर बार यह है कि स्वतंत्र रूप से रिकॉर्ड एक माइक्रोप्रोसेसर द्वारा दर्ज की गई और शीशी के भीतर मक्खियों की गतिविधि में गिना जाता है, जो अवरक्त किरण, बीच में आता है. एक माइक्रोप्रोसेसर उपयोगकर्ता परिभाषित interva पर कंप्यूटर को शीशी के भीतर कुल गतिविधि अपलोडLS कि 1 सेकंड से 60 मिनट के लिए भिन्न हो सकता है. यहाँ वर्णित विधि मक्खियों नए वातावरण को समायोजित करने के लिए पर्याप्त समय प्रदान करता है और मक्खियों के रूप में कई 120 के रूप में आबादी का सहज हरकत गतिविधि का एक साथ मापने के लिए अनुमति देता है. इसके अलावा, हम भोजन की तैयारी का वर्णन रखरखाव मक्खी, गतिशीलता आबादी तापमान नियंत्रित इन्क्यूबेटरों में नज़र रखता है, और परिणाम को प्रभावित कर सकता है कि संभावित कारकों की स्थापना. इस विधि विभिन्न पर्यावरणीय या आनुवंशिक संशोधनों मक्खियों की सहज हरकत गतिविधि को प्रभावित कैसे अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.

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Protocol

नोट: गुआंगज़ौ एस तनाव ब्लूमिंगटन स्टॉक केंद्र से प्राप्त मानक जंगली प्रकार पृष्ठभूमि लाइन है.

1. भोजन तैयार करने और खाद्य के 1000 मिलीलीटर के लिए पकाने की विधि

नोट: इस खंड में भोजन तैयार करने के लिए प्रोटोकॉल का वर्णन करता है. बड़े धातु के बर्तन एक समय में भोजन के बारे में 18 एल तैयार करने के लिए उपयोग किया जाता है. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल का आकार छोटा और 1000 मिलीलीटर एच 2 ओ का उपयोग करता है खाद्य दो बार autoclaved है.

  1. 643 मिली लीटर पानी में 113 ग्राम sucrose और 28 ग्राम brewers खमीर मिश्रण. 15 मिनट के लिए पूरे मिश्रण को एक हलचल पट्टी के साथ 25 डिग्री सेल्सियस पर एक गर्म थाली सेट पर सामग्री को छोड़ दें.
  2. 20 मिनट के लिए आटोक्लेव खाद्य समाधान.
  3. 268 मिली लीटर पानी में 49 ग्राम cornmeal और 8.1 ग्राम अगर मिलाएं और 1.2 चरण में वर्णित autoclaved खाद्य मिश्रण में जोड़ें. एक बड़े चम्मच या एक whisk साथ अच्छी तरह से मिलाएं.
  4. एक और 20 मिनट के लिए आटोक्लेव खाद्य मिश्रण.
  5. एक थाली पर खाद्य प्लेस और एक हलचल पट्टी के साथ लगातार मिश्रण के साथ शांत हो जाओ. मैंच अतिरिक्त समाधान 60 डिग्री सेल्सियस पर सेट अप एक गर्म थाली पर खाना रखने और भोजन की आवश्यकता के तापमान तक पहुँच जाता है जब समाधान जोड़ने, ऐसे mifepristone (RU486) के रूप में, भोजन में शामिल किया जाना चाहिए.
  6. 10.7 मिलीलीटर 100% EtOH में 2.4 जी tegosept भंग करने और पूरी तरह से भंग और लगभग 15 मिनट के लिए मिश्रण करने के लिए एक उत्तेजक के साथ एक ठंडा प्लेट पर रहते हैं.
  7. भोजन का तापमान 60 डिग्री सेल्सियस है, जब भोजन के लिए tegosept समाधान जोड़ें और मिश्रण अच्छी तरह से.
  8. एक विस्तृत शीशी में भोजन के बारे में 10 मिलीलीटर डालना एक पंप या एक खाद्य औषधि का प्रयोग करें. एक समय में 100 चौड़ा, प्लास्टिक की शीशियों (1 ट्रे) में एक साथ खाना डाल सकते हैं एक खाद्य औषधि का उपयोग करके.
  9. Kimwipes और पनीर कपड़े से शीशियों कवर और शांत करने के लिए 12-24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर खाना छोड़ दें. 4 डिग्री सेल्सियस पर खाना रखने और 3-4 सप्ताह के भीतर का उपयोग करें. मक्खी काम के लिए उपयोग करने से पहले कमरे के तापमान पर खाना गर्म.

ग्लास शीशियों के 2. तैयारी

  1. चरण 1 में सूचीबद्ध प्रोटोकॉल के अनुसार भोजन तैयार करते हैं. आबादी की निगरानी के लिए सही आकार है जो प्रत्येक संकीर्ण, कांच की शीशी में भोजन की विभाज्य 5 एमएल. भोजन की यह राशि आबादी की निगरानी की सबसे कम अंगूठी नीचे होना काफी कम किया जाना चाहिए.
  2. खाद्य कमरे के तापमान को शांत होता है के बाद स्पंज प्लग के साथ शीशियों को कवर किया और अप करने के लिए 2 सप्ताह के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रखने के लिए उन्हें. एक शीशी में भोजन की राशि के बजाय कम है, क्योंकि यह किसी भी सुखाने को रोकने के लिए एक या दो सप्ताह के भीतर भोजन का उपयोग करने के लिए सबसे अच्छा है.
  3. उपयोग से पहले कमरे के तापमान को शीशियों को गर्म.

माता पिता का मक्खियों के 3. रखरखाव

  1. मानक प्रयोगशाला भोजन के साथ व्यापक प्लास्टिक की शीशियों में मक्खियों बढ़ने और एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र पर 25 डिग्री सेल्सियस पर एक humidified, तापमान नियंत्रित पर्यावरण कक्ष में शीशियों रखना. दिन के उजाले की अवधि इस प्रयोगशाला में 6:00 बजे शुरू होता है.
  2. सुबह में स्पष्ट वयस्क पैतृक मक्खियों एकत्र किया जाएगा, जहां से शीशियों से मक्खियों.
  3. नव eclosed flie लीजिएएस और eclosion मादा मक्खियों कुंवारी हैं सुनिश्चित करने के बाद 8 घंटे के भीतर एक सीओ 2 पैड पर लिंग के आधार पर उन्हें अलग. मक्खियों eclosion के बाद 8 घंटा दोस्त के लिए शुरू करते हैं.
  4. कुंवारी पुरुष और महिला मक्खियों उम्र के 5 और 10 दिनों के बीच होते हैं, तो मानक भोजन और शीर्ष पर सक्रिय खमीर की कई अनाज के साथ एक शीशी में 10 पुरुषों और 10 मादा मक्खियों डाल दिया.
    नोट: मक्खियों की एक ही नंबर का उपयोग करते हुए और दो दिनों के लिए एक शीशी में उन्हें रखने के द्वारा लार्वा का घनत्व नियंत्रण. सक्रिय खमीर के अलावा अंडा उत्पादन को बढ़ावा देता है.
  5. दोस्त और 2 दिनों के लिए एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रित पर्यावरण कक्ष में अंडे देना मक्खियों रखें. अभिभावकों की मक्खियों के 5-10 शीशियों सेट करें.
  6. हर दूसरे दिन एक नया प्लास्टिक की शीशी को मक्खियों के पास है और 25 डिग्री सेल्सियस पर एक मशीन में अंडे के साथ शीशियों रखना

प्रायोगिक मक्खियों के 4. संग्रह

  1. 9 दिनों के बाद मक्खियों शीशियों से eclose शुरू कर देंगे जहां parentaएल मक्खियों (3.6 कदम में वर्णित है.) अंडे रखी. साफ और पहले दिन के दौरान eclosed कि मक्खियों त्यागने और इनक्यूबेटर शीशियों वापसी. 1 दिन पर eclosed मक्खियों से अधिकांश महिलाएं हैं. मक्खियों के एक अधिक सिंक्रनाइज़ जनसंख्या दिवस 2 पर eclose जाएगा.
  2. सीओ 2 पैड पर 24 घंटा जगह नव eclosed मक्खियों के भीतर और एक तूलिका या धातु के चम्मच से 25 पुरुष और शीशियों प्रति 25 मादा मक्खियों इकट्ठा. सीओ 2 के किसी भी प्रभाव को कम करने के लिए समय की एक छोटी अवधि के लिए सीओ 2 पैड पर मक्खियों रखें. शीशी पर eclosion के दिन नीचे लिखें. प्रयोगात्मक के लिए और नियंत्रण समूहों के लिए कम से कम 5 दोहराने शीशियों को इकट्ठा करो.
  3. एक 12 घंटा / प्रकाश अंधेरे चक्र के साथ 25 डिग्री सेल्सियस तापमान नियंत्रित पर्यावरण संगठनों में शीशियों रखें.
  4. एक चिमनी का उपयोग कर हर दूसरे दिन एक नया प्लास्टिक की शीशी को मक्खियों से गुजरती हैं.
  5. प्रयोग के लिए वांछित उम्र तक पहुँच जाता है मक्खियों उम्र.

5. गतिशीलता मॉनिटर्स की स्थापना

  1. जगहजनसंख्या एक तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में नज़र रखता है.
  2. PSIU में एक खोलने के लिए 5 व्यक्ति को मॉनिटर करने के लिए कनेक्ट कर सकते हैं जो 5 मार्ग splitters (बहु - रेखा), के माध्यम से बिजली की आपूर्ति इंटरफेस यूनिट (PSIU) के लिए एक 4 तार टेलीफोन केबल के साथ प्रत्येक मॉनिटर कनेक्ट. आंकड़े 1 ए और 2 बी देखें.
  3. एक लाइन बिजली के आउटलेट (100-240 वी) के लिए PSIU कनेक्ट करें. 2 संभोग PSIU जैक से एक में बिजली की आपूर्ति उत्पादन कनेक्टर प्लग करें. ठीक से कनेक्ट होने पर आसन्न हरी बत्ती हरी illuminates.
  4. यूनिवर्सल सीरियल बस (यूएसबी) हार्डवेयर के लिए PSIU कनेक्ट करें. डेटा रिकॉर्डिंग के लिए एक Macintosh या Windows पीसी के साथ USB हार्डवेयर के बीच यूएसबी केबल से कनेक्ट करें. यह संग्रह एक समय में दिन के लिए चलाता है के बाद से ही डेटा संग्रह के लिए समर्पित एक कंप्यूटर के लिए सबसे अच्छा होगा.
  5. यूएसबी सॉफ्टवेयर (PSIUdrivers.zip) डाउनलोड करें. यूएसबी ड्राइवर सॉफ्टवेयर विद्युत आपूर्ति इंटरफेस का इस्तेमाल किया और केवल एक बार डाउनलोड करने की जरूरत है. यह एक synthesizesकंप्यूटर प्रोग्राम और PSIU / गतिविधि पर नज़र रखता है के बीच डेटा लिंक. एक पीसी का उपयोग एक COM बंदरगाह के लिए और एक Macintosh के लिए एक सरल धारावाहिक बंदरगाह का उपयोग करें.
  6. निर्माता नोट्स 308.pdf द्वारा दिए गए निर्देशों का पालन करते हुए लबादा OSX (इंटेल) के लिए या विंडोज पीसी (XP/Vista/7) कार्यक्रमों के लिए कंप्यूटर प्रोग्राम डाउनलोड.
  7. कंप्यूटर प्रोग्राम प्रारंभ करें और प्राथमिकताएं, रोशनी या मॉनिटर्स पर क्लिक करके कार्यक्रम निर्धारित किया है. उपयोगकर्ता कार्यक्रम को रोकने के लिए "बंद" का चयन करता है जब तक कार्यक्रम चलेगा. कंप्यूटर प्रोग्राम या कंप्यूटर बंद कर दिया जाए मॉनिटर बीम रुकावट गिनती करने के लिए जारी रहेगा, लेकिन कार्यक्रम को फिर से शुरू किया है जब तक मायने रखता दर्ज नहीं किया जाएगा. उस मामले में पहले पढ़ने PSIU कंप्यूटर से डेटा भेजा पिछली बार के बाद से सभी मामलों में शामिल होंगे.
  8. प्राथमिकताएँ टैब का चयन करें और सीरियल पोर्ट, पीसी के लिए लबादा और COM के लिए PSIU चुनें.
  9. पढ़ने सेकंड से लेकर उस अंतराल, मिनट, या एक घंटे का चयन करें.
    10. <ली> मॉनिटर का चयन करें: प्रत्येक मॉनिटर निर्माता द्वारा दिया जाता है कि अपनी अद्वितीय संख्या है. निर्माता द्वारा मॉनिटर करने के लिए दिए गए नंबरों से मेल खाती है कि निगरानी सीमा चुनें.
  10. रोशनी बॉक्स: सॉफ्टवेयर पर नजर रखने के नंबर करने के लिए अगले एक हरे रंग की रोशनी से चिह्नित किया गया है, जो सब पर नज़र रखता ठीक से जुड़े हुए हैं कि सुनिश्चित करें. एक लाल बत्ती कनेक्शन खो दिया है कि इंगित करता है, और एक ब्लैक बॉक्स प्रणाली बंद या अनुचित तरीके से स्थापित किया है कि इंगित करता है.

6. प्रयोग सेट करना

  1. 4 डिग्री सेल्सियस से युक्त भोजन कांच की शीशियों निकालें और कमरे के तापमान को उन्हें गर्म करते हैं.
  2. सीओ 2 पैड पर एक ही उम्र के अलग पुरुष और महिला मक्खियों. उम्र बढ़ने के अध्ययन के लिए यह रूप में कम उम्र के 3 दिन के रूप में गतिशीलता पढ़ाई शुरू करने के लिए संभव है.
  3. खाद्य युक्त कांच की शीशी में 10 पुरुष या 10 मादा मक्खियों रखो. मक्खियों के प्रत्येक प्रयोगात्मक और नियंत्रण रेखा के लिए और प्रत्येक लिंग के लिए कम से कम तीन शीशियों का प्रयोग करें.
  4. छठी रखेंमक्खियों मक्खियों सुनिश्चित करने के लिए सीओ 2 से उबरने जब ​​तक उनके पक्ष में ए एल एस भोजन में अटक मत हो. के बारे में 8:00 पर और सीओ 2 से उबरने के लिए कमरे के तापमान पर लगभग 2 घंटे के लिए उन्हें छोड़ अलग मक्खियों.
  5. इन्क्यूबेटरों में रखे आबादी मॉनिटर अंदर शीशियों रखें.
  6. मक्खियों उन्हें उपन्यास में पर्यावरण के लिए समायोजित करने के लिए इनक्यूबेटर में डाल रहे हैं के बाद पहले 24 घंटे के भीतर एकत्र आंकड़ों त्यागें.
  7. भोजन के सूखने से बचने के लिए नई शीशियों को 3 या 4 दिनों के बाद मक्खियों से गुजरती हैं. मक्खियों मौत होने का खतरा है या उम्र 40 दिनों या बड़े होते हैं, दिन 2 के लिए एकत्र 2 दिन और उपयोग डेटा के बाद मक्खियों से गुजरती हैं. इसके अलावा, पर्याप्त replicates सुनिश्चित करने के लिए समूह के प्रति अधिक से अधिक तीन शीशियों का उपयोग करें. मृत मक्खियों के साथ शीशियों से डाटा अवहेलना और विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए.

7. गतिविधि पर नज़र रखता चल रहा है और कुल सहज गतिविधि को गिना

  1. प्राथमिकताओं का चयन - डेटा संग्रह के लिए अंतराल <.br /> नोट: कंप्यूटर प्रोग्राम की अनुमति देता है 1 सेकंड से 60 मिनट से लेकर अंतराल पर डेटा का संग्रह. 10 और 30 मिनट की अवधि के समय अंक की भारी संख्या होने के बिना गतिशीलता के बारे में पर्याप्त जानकारी प्रदान करने के लिए पाया गया है. चयनित समय अवधि में, प्रोग्राम कंप्यूटर के लिए प्रत्येक की निगरानी के लिए वर्तमान में कुल गिनती भेजने और शून्य से फिर से गिनती शुरू होगी. कंप्यूटर प्रोग्राम कंप्यूटर डेटा सिस्टम के द्वारा बनाई गई एक नए फ़ोल्डर में डेटा स्टोर. प्रत्येक निगरानी में एकत्र आंकड़ों का अलग से जमा कर रहे हैं, और व्यक्तिगत पाठ दस्तावेजों प्रत्येक शीशी के लिए बनाई गई हैं. डेटा लगातार रूप में लंबे समय कार्यक्रम संचालित के रूप में एकत्र कर रहे हैं.
  2. प्रयोग के अंत में, विंडोज पीसी (XP/Vista/7) कार्यक्रम के लिए लबादा OSX के लिए FileScan110X (इंटेल) या SystemMB108 का उपयोग कर डेटा को स्कैन.
    नोट: स्कैन कार्यक्रम डुप्लिकेट रीडिंग समाप्त और रिकॉर्डिंग पूरी हो चुकी है कि सुनिश्चित करता है.
  3. एक विशिष्ट समय और संगठन में एकत्र आंकड़ों सहेजेंदिनों की eriod. एक प्रयोगात्मक नाम चुनें और विश्लेषण के लिए कंप्यूटर डेटा फ़ोल्डर से फाइल कॉपी.
    नोट: इस समय, गतिविधि अंतराल बदला जा सकता है और अलग अलग लोगों के लिए बदल दिया. मूल डेटा कंप्यूटर डेटा फ़ोल्डर में संग्रहीत रहना होगा और जब तक वे नष्ट नहीं कर रहे हैं के रूप में लिया जा सकता है.

8. डेटा विश्लेषण

  1. डेटा विश्लेषण के लिए एक्सेल स्प्रेडशीट के स्तंभों में पाठ फ़ाइलों में एकत्र डेटा की प्रतिलिपि. इस सॉफ्टवेयर द्वारा एकत्र आंकड़ों अन्वेषक द्वारा चयनित समय की अवधि में एक निगरानी में कुल गतिविधि का प्रतिनिधित्व संख्या में होते हैं, जो स्तंभ, में हैं.
    नोट: प्रत्येक की निगरानी के लिए एकत्र आंकड़ों अलग पाठ फ़ाइलों में हैं. प्रत्येक की निगरानी के लिए 32 स्तंभ हैं. पहले छह कॉलम खाली हैं और केवल 0 होते; अगले तीन बीच में नीचे की अंगूठी पर एकत्र डेटा होते हैं, और शीर्ष अंगूठी पर. वे कोई डेटा नहीं करते हैं क्योंकि चैनलों के बाकी नष्ट किया जा सकता है. प्रत्येक अंगूठी एक outputsसमय के अनुसार ही मूल्य. चित्रा 2 में कच्चे डेटा का स्क्रीन शॉट देखें.
  2. अवरक्त मुस्कराते हुए तीन अलग अलग ऊंचाई पर एकत्र गतिविधि की राशि का प्रतिनिधित्व करता है कि प्रत्येक की निगरानी के लिए समय की एक वांछित अवधि के भीतर कुल गतिविधि की गणना.
    नोट: समय अवधि में कई घंटे, 24 घंटे या कई दिनों से लेकर कर सकते हैं.
  3. औसत हरकत गतिविधि और 3 जैविक प्रतिकृति का प्रतिनिधित्व करते हैं कि 3 मॉनिटर के बीच मानक विचलन का निर्धारण करते हैं.
    नोट: डेटा परीक्षणों के एक नंबर का उपयोग करके सांख्यिकीय महत्व के लिए विश्लेषण किया जा सकता है. एक दो पूंछ छात्र के टी परीक्षण, विचरण का एक तरह से विश्लेषण (एनोवा) और एक Tukey एचएसडी के बाद अस्थायी परीक्षण सहज हरकत गतिविधि 16 से 24 घंटे पर कई पर्यावरणीय या आनुवंशिक जोड़तोड़ के प्रभाव को निर्धारित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस्तेमाल किया जा सकता है और पहले 17 प्रकाशित किया गया है कि अन्य कार्यक्रमों के एक नंबर रहे हैं.

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Representative Results

ड्रोसोफिला में सहज हरकत गतिविधि मक्खी लिंग (चित्रा 3), भोजन (3B चित्रा) की कैलोरी सामग्री और / प्रकाश अंधेरे चक्र पर निर्भर करता है. प्रकाश बंद है एक बार मक्खी गतिविधि नाटकीय रूप से कम हो जाती है. चित्रा 3 पुरुष और महिला मक्खियों की हरकत गतिविधि रिकॉर्डिंग के 24 घंटे दिखाता है. एक्स अक्ष पर एक तारांकित प्रकाश बंद था जब समय के निशान और अंधेरे चक्र के लिए संक्रमण. चित्रा 3 बी मकई भोजन पर 3 दिनों उम्र मक्खियों पुरुष के लिए तीन आबादी की निगरानी में एकत्र औसत सहज हरकत गतिविधि के बीच मानक विचलन को दिखाता है. 24 घंटे के दौरान सहज शारीरिक गतिविधि के लिए एकत्र किए गए आंकड़ों में भी एक 24 घंटे की अवधि, चित्रा -3 सी के दौरान उड़ान प्रति कुल गतिविधि के रूप में व्यक्त किया जा सकता है.

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चित्रा 1:.. दो आबादी की मक्खियों का सहज हरकत गतिविधि की निगरानी के लिए जनसंख्या मॉनिटर सेटअप ए) कई जनसंख्या मॉनिटर 5 मार्ग splitters के लिए एक 4 तार टेलीफोन केबल के साथ जुड़ा हुआ है और एक तापमान नियंत्रित इनक्यूबेटर में रखा जाता है बी) उच्च बढ़ाई जनसंख्या पर नज़र रखता है और तीन अलग अलग ऊंचाई पर तैनात अवरक्त बीम के साथ तीन अंगूठियां भीतर शीशियों की नियुक्ति जो शो पर नज़र रखता है,. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 2
चित्रा 2: तो द्वारा उत्पन्न कच्चे डेटा की स्क्रीन शॉटftware तिथि दिखा, समय और अंगूठियां 1, 2 में एकत्र डेटा, और 3. आर अंगूठी के लिए खड़ा है. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें.

चित्रा 3
चित्रा 3: पुरुष (काला) और महिला का) जवाब सहज हरकत गतिविधि (मैजेंटा) मानक प्रयोगशाला आहार पर 24 घंटे के दौरान मक्खियों. डेटा 10 मिनट डिब्बे में एकत्र की है और प्रत्येक) पुरुष मानक प्रयोगशाला आहार पर 24 घंटे के दौरान मक्खियों का औसत सहज हरकत गतिविधि 10 मक्खियों. बी युक्त तीन शीशियों के बीच औसत गतिविधि के रूप में गणना की मक्खी प्रति औसत गतिविधि का प्रतिनिधित्व कर रहे हैं. डेटा 10 मिनट डिब्बे में एकत्र की है और वें के बीच औसत गतिविधि के रूप में गणना की मक्खी प्रति औसत गतिविधि का प्रतिनिधित्व कर रहे हैंREE शीशियों. 20 दिन पुराने नर का मानक विचलन हरे रंग में चिह्नित हैं. सी) कुल गतिविधि कम कैलोरी पर मक्खियों (0.5X) (ग्रीन) और उच्च कैलोरी (1.5X) (24 घंटे से अधिक ब्राउन) भोजन. बड़ी छवि को देखने के लिए यहां क्लिक करें .

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Discussion

मक्खियों का सहज हरकत गतिविधि उम्र, आनुवंशिक पृष्ठभूमि, और लिंग 2,13,18,19 के रूप में कई कारकों से प्रभावित होता है. इसके अलावा, इस तरह के भोजन, वातावरण के तापमान, विभिन्न दवाओं के अलावा, और दिन / रात प्रकाश चक्र की गरमी सामग्री के रूप में पर्यावरणीय कारकों मक्खी गतिविधि को प्रभावित कर सकते हैं. उदाहरण के लिए, एक ही उम्र के पुरुष मक्खियों महिलाओं (चित्रा 1) की तुलना में एक उच्च सहज शारीरिक गतिविधि है. इसलिए, एक ही उम्र और लिंग की मक्खियों एक दूसरे से तुलना की जानी चाहिए. ऐसे overexpression या एक विशेष जीन के समारोह के नुकसान के रूप में मक्खी गतिविधि पर आनुवंशिक जोड़तोड़, के प्रभाव की जांच करते हैं, प्रयोगात्मक और नियंत्रण मक्खियों विभिन्न आनुवंशिक पृष्ठभूमि या दूसरी साइट संशोधक के किसी भी संभावित प्रभाव को दूर करने के लिए एक ही आनुवंशिक पृष्ठभूमि में होना चाहिए. यह 1118 या 10 की पीढ़ियों के लिए YW पुरुषों डब्ल्यू करने के लिए प्रयोगात्मक मादा मक्खियों backcrossing द्वारा प्राप्त किया जा सकता है. 10 के बादbackcrossing की पीढ़ियों, 1118 या YW मक्खियों डब्ल्यू एक आनुवंशिक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. आनुवंशिक पृष्ठभूमि के लिए नियंत्रित करने के लिए एक और तरीका है जो की अनुमति देता inducible GAL4 GeneSwitch (GAL4-जी एस) यूएएस द्विआधारी प्रणाली का उपयोग करने के लिए है overexpression या मक्खियों में एक समय और ऊतक विशेष ढंग से ब्याज की जीन के नीचे विनियमन (आरएनएआई) mifepristone के अलावा (RU486) 20,21 साथ खाना खिलाया. GAL4 dimerize और यूएएस अनुक्रम के लिए बाध्य करने के लिए RU486 आवश्यक है. जेनेटिक नियंत्रण भाई कर रहे हैं मक्खियों EtOH के अलावा (RU486 मंदक) के साथ भोजन पर रखा.

विभिन्न तरीकों ड्रोसोफिला गतिशीलता रिकॉर्ड करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. यहाँ वर्णित विधि, सरल विश्वसनीय, अधिक जानकारीपूर्ण है, और इस तरह के नकारात्मक geotaxis के रूप में ड्रोसोफिला गतिशीलता का निर्धारण किया जाता अन्य तरीकों की तुलना में पूर्वाग्रह से कम क्षमता है. इसमें समय की एक लंबी अवधि के लिए मक्खियों के कई आबादी का उद्देश्य एक साथ रिकॉर्डिंग का लाभ दिया हैमानक संस्कृति की स्थिति. जनसंख्या पर नज़र रखता का उपयोग करके हरकत गतिविधि को मापने के भोजन के विभिन्न गरमी सामग्री मक्खी गतिविधि को प्रभावित या सीआर 16 पर मक्खियों की वृद्धि की गतिविधि अंतर्निहित आनुवंशिक तंत्र का अध्ययन करने के लिए कैसे अध्ययन के लिए उपयोगी हो सकता है. इसी प्रकार, इस प्रणाली के विभिन्न आनुवंशिक परिवर्तन, उम्र बढ़ने, या मक्खी सहज शारीरिक गतिविधि पर विभिन्न दवाओं के अलावा के प्रभाव का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया गया है. व्यक्तिगत ट्यूबों के बजाय जनसंख्या पर नज़र रखता इस्तेमाल की नींद व्यवहार का विश्लेषण करने, और दूसरों 17,22-24, विवो में circadian लय का अध्ययन, मक्खियों की अलग जीनोटाइप में एच 2 ओ 2 प्रतिरोध को मापने के लिए अनुमति देता है.

किसी भी विधि की तरह, इस निगरानी प्रणाली के लिए सीमाएं हैं. समय की एक लंबी अवधि के लिए मक्खियों जब निगरानी, ​​मक्खी मौत के लिए एक संभावित विशेष रूप से वृद्ध मक्खियों का उपयोग करते हैं, तो वहाँ है. केवल स्वस्थ मक्खियों का उपयोग इस को रोकने में मदद मिलेगी. हम भी प्रति अधिक से अधिक 3 जैविक प्रतिकृति का उपयोग करने की कोशिशसमूह मक्खियों पुराने या मरने के लिए प्रवण हैं. एक समाधान मक्खियों वातावरण को समायोजित करने के बाद ही गतिशीलता पर नज़र रखता है और, दिन 2 के दौरान एकत्र उपयोग डेटा में 2 दिनों के लिए मक्खियों रखने के लिए है. मृत्यु होती है, तो हम गणना में शीशी के लिए एकत्र किए गए आंकड़ों का उपयोग नहीं करते. हम Trikinetics गतिविधि की निगरानी में ही खड़ी तैनात शीशियों का उपयोग किया गया है, क्षैतिज शीशियों स्थान के लिए एक संभावना है. हम खाद्य मानक इनक्यूबेटर संस्कृति की स्थिति के समान है जो शीशी के तल पर है, क्योंकि खड़ी शीशियों के लिए जगह का चयन करें. इस मक्खियों ऊपर और शीशियों नीचे चलने के लिए और अधिक स्थान की अनुमति देता है, और यह नकारात्मक geotaxis प्रयोगों के समान है. खाद्य सुखाना एक समस्या 24 हो जाता है अगर इनक्यूबेटर की नमी भी निगरानी की जानी चाहिए. इस प्रणाली के औसत गतिविधि के मामले में डेटा प्रदान करता है, और गतिविधि की प्रकृति के बारे में विशिष्ट विवरण प्रदान नहीं करता है. दो मक्खियों एक ही समय में बीम पार इसके अलावा, अगर, यह WIकरूँगा केवल एक रुकावट के रूप में दर्ज किया. यहाँ वर्णित प्रोटोकॉल कुल गतिविधि को बढ़ाता के लिए उपयोगी है, लेकिन इस तरह की उड़ान प्रक्षेपवक्र या वेग के रूप में और अधिक सटीक जानकारी 12,14,25 वांछित हैं अगर अन्य प्रोटोकॉल उपयोगी डेटा प्रदान कर सके.

इस प्रयोग के बाद, कारण आनुवंशिक या पर्यावरणीय जोड़तोड़ करने के लिए सहज हरकत गतिविधि में मतभेद जाना जाएगा. इस प्रोटोकॉल का भविष्य संशोधन ऊपर, मध्य, और जनसंख्या पर नज़र रखता है के नीचे के छल्ले पर मक्खियों की गतिविधि के विभिन्न स्तरों का विश्लेषण करने के लिए हो सकता है. इस मक्खी आबादी भोजन के निकट शीशी के नीचे या शीर्ष पर अपने समय के सबसे अधिक खर्च निर्धारित करें कि क्या होगा. अपने मौजूदा रूप में प्रोटोकॉल ड्रोसोफिला प्रयोगात्मक और नियंत्रण आबादी का सहज हरकत गतिविधि की सटीक, एक साथ मात्रा का ठहराव के लिए अनुमति देता है.

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Disclosures

हम खुलासा करने के लिए कुछ भी नहीं है.

Acknowledgments

इस काम के स्वास्थ्य के राष्ट्रीय संस्थान (बीआर करने AG023088) से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Sucrose FCC Food Grade 100 LB, Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90471380
Brewer’s Yeast Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90331280
Drosophila Agar Fine SciMart DR-820-25F
Cornmeal Fisher Scientific MP Biomedicals ICN90141125
Methyl4-hydroxybenzoate, tegosept Sigma H5501-5KG
EtOH Pharmco-AAPER 111000200
Active Dry Yeast Fisher Scientific ICN10140001
Fly CO2 pad LabScientific BGSU-7
Stereo Microscope Olympus SZ40
Drosophila carbon dioxide (CO2) tank Airgas UN1013
Small paint brush for pushing the flies
Shell vial wide Fischer Scientific AS519
Buzzplugs for wide plastic vials Fischer Scientific AS275
Glass vials (25 x 95 mm) Fischer Scientific Kimble 60931-8 AS-574
Sponge plugs for glass vials SciMart DR-750
Drosophila Food Dispenser Applied Scientific (Fischer Scientific) AS780Q
DPM Drosophila Population Monitor Trikinetics Inc.
DC Power Supply with line cord Trikinetics Inc.
PSIU9 The Power Supply Interface Unit Trikinetics Inc.
Telephone cables and 5 way splitters Trikinetics Inc.
Universal Serial Bus (USB) hardware Trikinetics Inc.
Macintosh or Windows PC with UCB port
DAMSystem308X Data Acquisition Software for Macintoch OSX (Intel) www.trikinetics.com
DAMSystem308 Data Acquisition Software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
Name Company Catalog Number Comments
DAMFileScan108X software for Macintosh www.trikinetics.com
DAMFileScan108X software for Windows PC (XP/Vista/7) www.trikinetics.com
USB software (PSIUdrivers.zip) www.trikinetics.com
DAMSystem Notes 308 (http://www.trikinetics.com/Downloads/DAMSystem%20Notes%20308.pdf

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References

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में सहज हरकत गतिविधि का निर्धारण<em&gt; ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
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Woods, J. K., Kowalski, S., Rogina, B. Determination of the Spontaneous Locomotor Activity in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (86), e51449, doi:10.3791/51449 (2014).

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