Este protocolo describe la detección por qPCR de citomegalovirus en tejido de biopsia fijado en formol e incluido en parafina, que es rápido, sensible, específico y útil para interpretar patrones equívocos de tinción de hematoxilina y eosina o inmunohistoquímicos.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
qPCR es un método sensible y rápido para la detección de ADN de citomegalovirus en fija en formol, biopsia de tejido embebido en parafina
En este artículo
Resumen
Resumen
Es crucial para identificar la infección por citomegalovirus (CMV) en el tracto gastrointestinal (GI) de los pacientes inmunodeprimidos, dado su mayor riesgo de desarrollar una infección grave. Muchos métodos de laboratorio para la detección de la infección por CMV se han desarrollado, incluyendo serología, el cultivo viral y métodos moleculares. A menudo, estos métodos reflejan afectación sistémica por CMV y no identifican específicamente la participación del tejido local. Por lo tanto, la detección de la infección por CMV en el tracto gastrointestinal se realiza con frecuencia por la histología tradicional de tejido de la biopsia. La tinción con hematoxilina y eosina (H & E) en conjunción con técnicas de inmunohistoquímica (IHC) se han mantenido los pilares de examinar estas biopsias. H & E e IHC veces resultan en (dudosos) patrones de tinción atípicos, lo que hace difícil la interpretación. Se demostró que la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR) para CMV con éxito se puede realizar en fijado en formol, tejido de biopsia incrustado en parafina (FFPE) de muyalta sensibilidad y especificidad. El objetivo de este protocolo es demostrar cómo llevar a cabo las pruebas de qPCR para la detección de CMV en tejido de biopsia FFPE en un laboratorio clínico. Este método es probable que sea de gran beneficio para los pacientes en los casos de la aparición de manchas por CMV en biopsias GI.
Introducción
Interpretación de la infección por citomegalovirus (CMV) en muestras clínicas es críticamente importante. CMV es un miembro de la subfamilia Betaherpesvirinae de herpesvirus. Al igual que otros virus de herpes, CMV tiene la capacidad de establecer una infección persistente o latente que se caracteriza por una falta de replicación viral activa 1. La reactivación del virus puede producirse en momentos de estrés o de otro tipo de inmunosupresión, lo que lleva a la replicación viral activa caracterizada por la liberación de viriones, que puede estar acompañado de manifestaciones de la enfermedad 2-4. Gastrointestinal (GI) los síntomas de la enfermed....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
Con la aprobación de la Junta de Revisión Institucional, se realizó una búsqueda en la base de datos de laboratorio electrónico para identificar fijado en formol e incluido en parafina (FFPE) bloques que representan los casos de infección por citomegalovirus (CMV) en gastrointestinal (GI) biopsias diagnosticadas por histopatología (hematoxilina y eosina (H & E) y / o inmunohistoquímica (IHC)).
1. Procesamiento de tejido de FFPE GI biopsia de tejido
- Recoger FFPE GI bloques de tejido de biopsia para el citomegalovirus (CMV) reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa (qPCR). Estos bloques se almacenan a temperatura ambiente.....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
Un total de 228 bloques de tejido fueron probados por reacción en cadena de polimerasa cuantitativa (qPCR), que se compone de 91 citomegalovirus (CMV) casos positivos sobre la base de la histología e inmunohistoquímica positiva (IHC), 18 con equívoca CMV IHC, y 79 controles negativos. Como se ilustra en la Figura 2, los casos de CMV positivos se han demostrado inclusiones típicas de CMV virales (A) y / o tinción IHC positivo (B). Casos dudosos se han demostrado patrones.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Muchos métodos de laboratorio están disponibles para el diagnóstico de la infección por citomegalovirus (CMV), incluyendo serología, el cultivo viral, los ensayos moleculares de viremia, la histología de las biopsias, y, como se ha demostrado recientemente, ensayos moleculares de fijado en formol (FFPE) biopsia incluido en parafina 5,6 tejido. Serología, una vez a la base del diagnóstico, sólo identifica fiablemente la exposición y no se correlaciona bien con la infección aguda por citomegalovirus 7.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Reconocemos Amy Thomasson por su ayuda en la preparación de este manuscrito, y Fredrik Skarstedt y Ryan Christy por sus esfuerzos en la preparación de las figuras.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1,7 ml Tubos de microfuga Costar | 3620 | ||
| Pinzas dentadas | Servicios de microscopía electrónica | 62086-1S | Micro pinzas MF-1 |
| Centrífugas de sobremesa (microfugas) | Eppendorf | 5424 | |
| Xileno | Fisher | Fisher Scientific: X3P | 1 galón |
| Etanol | Fisher | Fisher Scientific: ET108 | 96-100% |
| Microtomo | Leica | RM2255 | |
| QIAamp DNA FFPE Tissue Kit | Qiagen | 56404 | |
| artus CMV LightCycler PCR ASR | Qiagen | 4500025 | |
| Centrífuga LightCycler | Roche | 75005087 | |
| LightCycler Bloque de enfriamiento | Roche | ||
| Herramienta de taponado LightCycler | Roche | 3357317 | |
| Kit de compensación de color | Roche 2158850 | ||
| LightCycler 20 μ l Capilares | Roche | 1 909 339 | |
| Cuchillas | Sakura | Fisher Scientific: 4689 | Accu-Edge de perfil bajo |
Referencias
- Hodinka, R. L. Manual of Clnical Microbiology. 2, ASM Press. 1558-1574 (2011).
- Lasry, S., et al. Interstrain variations in the cytomegalovirus (CMV) glycoprotein B gene sequence among CMV-infected children attending six day ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
