El objetivo del protocolo es utilizar métodos óptimos para estimular las vías de detección de ADN citoplasmáticos en células e in vivo. Esto se logra mediante la mejora de la generación de ADN de largo, de doble cadena durante la ligadura de extremos romos. Las células o ratones se transfectaron a continuación usando un reactivo de transfección de lípidos.
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Artículo de método
La estimulación de citoplasmáticos de ADN Sensing Pathways
En este artículo
Resumen
Resumen
Con el fin de estimular eficazmente una respuesta inmune innata, el ADN debe ser de longitud suficiente y pureza. Se presenta un método donde el ADN de doble cadena (dsDNA), que tiene las características necesarias para estimular el ADN citoplásmico vías sensoriales pueden generarse de forma barata y con facilidad. Por el concatemerization de oligonucleótidos cortos, sintéticos (que carecen de motivos CpG), dsDNA se puede generar a ser de longitud suficiente para activar el citosólica vía de detección de ADN. Este protocolo implica ligación de extremos romos de los oligonucleótidos en presencia de polietilenglicol (PEG), que proporciona un entorno eficaz para la ligadura que se produzca. Los concatemers dsDNA se pueden utilizar, después de la purificación por extracción con fenol / cloroformo, para simular la respuesta inmune innata in vitro por los protocolos de transfección estándar. Este ADN se puede utilizar también para estimular la inmunidad innata en vivo por inyección intradérmica en el pabellón de la oreja de un ratón, por ejemplo. Porestandarizar el proceso de concatemerization y los protocolos de estimulación posteriores, una activación fiable y reproducible del sistema inmune innato puede ser producido.
Introducción
El ADN es un componente vital de todos los organismos y las células eucariotas, que mantienen en compartimentos específicos. Una función del sistema inmune innato es identificar cuando tal compartimentación se rompe o cuando el material extraño se introduce en el organismo a través de un incumplimiento de las barreras físicas, externos. En el cuerpo humano hay una serie de proteínas que existen para ayudar a degradar pequeñas cantidades de ADN que puede escapar de la compartimentación correcta; DNAsa I, II, y III quiebro de ADN en el plasma, endosoma, y el citosol, respectivamente. Sin embargo, se ha demostrado que los ratones que carecen de ADNasa II muer....
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Protocolo
1. concatemerization
- Cebadores Resuspender Fw y Rv (véase la Tabla de Materiales para las secuencias de primers) a una concentración de 10 mg / l en la biología molecular de grado H 2 O. Luego, mezclar 5 l de Fw y 5 l de imprimación Rv en un tubo de 1.5 ml.
- Mezcla de cebador recocido por calentamiento a la temperatura de recocido correcto (75 ° C para los cebadores descritos aquí) durante 15 min. Deja en el banco para que se enfríe a temperatura ambiente (TA). Prepare el PEG8000 60% durante esta incubación disolviendo en ddH 2 O.
- Añadir 50 l de 60% PEG8000 (para lograr una concentración final de 30%), 10 l de 10x....
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Resultados
Los resultados a continuación indican que el ADN concatemerized se puede generar con relativa facilidad y es capaz de estimular una respuesta inmune innata robusta en las células y en ratones. Con el uso de PEG8000, se puede ver claramente que la longitud del ADN que se genera es significativamente más larga e igualmente capaz de inducir la transcripción de CXCL10. Como se observa mediante análisis en gel de agarosa, la concatemerization estándar tiene longitudes de ADN de hasta 800 pares de bases (pb), mientras q.......
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Discusión
Los protocolos descritos aquí se utilizan para generar ADN de doble cadena para estimular la respuesta inmune innata citosólica con resultados reproducibles en una amplia gama de tipos de células e in vivo. Dado que el principal reactivo sustrato utilizado es un oligonucleótido sintético, hay flexibilidad en este sistema para el uso de secuencias de ADN alternativas o modificaciones químicas. Es posible, por ejemplo, para reemplazar el oligonucleótido cadena directa descrito en este protocolo con uno que contie.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Los autores no tienen reconocimientos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Imprimación directa | Integrated DNA Technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA |
| Imprimación inversa | Integrated DNA Technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCACTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Agua de grado de biología molecular | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 polinucleótido quinasa | Promega | M4101 | |
| T4 ADN ligasa | Promega | M1801 | |
| Fenol:cloroformo | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Cloroformo | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Etanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L Tampón | |
| carga de gel de ADN | New England Biolabs | B7021S | |
| Agarosa | Bioline | BIO-41025 | |
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Jeringa Hamilton Hamilton | 80901 Modelo 1705 | ||
| agujas de 30 G | BD Bioscience | 304000 | |
| SYBR Safe Tinción de gel de ADN | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) imprimación | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP | mix Fermentas | R0192 | |
| Super Script III transcriptasa inversa | Life Technologies | 56575 | |
| Tampón de síntesis de ADNc de primera cadena | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Mezcla maestra rápida | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 imprimación murina hacia adelante | Integrated DNA Technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 cebador inverso murino | Integrated DNA Technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 cebador delantero murino | Integrated DNA Technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 cebador delantero murino | Tecnologías integradas de ADN | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
Referencias
- Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H., Nagata, S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005).
- Ishikawa, H., Ma, Z., Barber, G. N. STING regulates intracellu....
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Reimpresiones y permisos
