Summary
Crête neurale (NC) des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation du développement humain et de la maladie et des thérapies de remplacement cellulaire. Ici, une adaptation libre-alimentation de l'a largement utiliséAbstract
Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont un grand potentiel pour l'étude du développement embryonnaire humain, pour la modélisation des maladies humaines dans le plat et comme une source de cellules transplantables pour des applications de régénération après la maladie ou les accidents. Les cellules de la crête neurale (CN) sont les précurseurs pour une grande variété de cellules somatiques adultes, comme les cellules du système nerveux périphérique et les cellules gliales, les mélanocytes et les cellules mésenchymateuses. Ils sont une source précieuse de cellules pour étudier les aspects du développement embryonnaire humaine, y compris la spécification du destin cellulaire et la migration. En outre la différenciation de cellules progénitrices CN en types de cellules à différenciation terminale offre la possibilité de modéliser les maladies humaines in vitro, étudier les mécanismes de la maladie et de générer des cellules pour la médecine régénératrice. Cet article présente l'adaptation d'un protocole in vitro de différenciation actuellement disponibles pour la dérivation de cellules NC de hPSCs. Ce nouveau protocole nécessite 18 jours de différenciation, est facilement extensible et hautement reproductible entre cellules embryonnaires humaines (CSEh souches) des lignes ainsi que les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) des lignes sans chargeur. Les anciens et les nouveaux protocoles donnent des cellules NC de l'identité égale.
Introduction
Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) ont montré un immense potentiel, en particulier pour l'enquête et le traitement futur des maladies humaines, pour laquelle aucun des modèles animaux de bonnes ni de tissus primaires sont disponibles. Exemples d'applications pour la technologie CSEh / hiPSC sont les suivantes: les cellules d'intérêt particulier peuvent être générés à partir de CSEh / hiPSCs pour la médecine régénérative à une quantité illimitée. Les cellules peuvent être produites à partir de patients porteurs d'une maladie spécifique et utilisées pour établir des modèles in vitro de la maladie 2,3. Ces modèles de la maladie peuvent alors être utilisés pour le dépistage de drogues à grande échelle dans la recherche de nouveaux composés médicamenteux 4 ainsi que les essais de médicaments existants pour l'efficacité et la toxicité du 5. Dans des modèles de maladie in vitro peuvent conduire à l'identification des mécanismes de la maladie de nouveaux. Pour toutes les applications de la technologie CSEh / iPSC il est important de travailler avec spécifique, bien définirtypes d cellulaires touchées dans la maladie d'intérêt. Ainsi, la disponibilité de protocoles de différenciation in vitro solides et reproductibles est essentiel pour toutes les applications de la technologie CSEh / hiPSC. Protocoles sont souhaitables qui montrent une variabilité minimale, dépense de temps, d'efforts, la difficulté et le coût ainsi que la reproductibilité maximale entre les lignes CSEh / hiPSC et différents chercheurs.
Cellules de la crête neurale (NC) apparaissent pendant la neurulation vertébrés entre l'épiderme et l'épithélium neural. Elles prolifèrent et migrent largement tout au long de l'embryon en développement et donnent lieu à une impressionnante diversité de types de cellules de la descendance, y compris des os / du cartilage, du squelette cranio-facial, les nerfs sensoriels, les cellules de Schwann, les mélanocytes, les cellules musculaires lisses, les neurones entériques, neurones autonomes, des cellules chromaffines , les cellules du septum cardiaque, des dents et des surrénales / thyroïde cellules glandulaires 6. Ainsi, des cellules NC sont un type de cellule attractive pour le domaine des cellules souches et important pour lemodélisation d'une variété de maladies, telles que la maladie de Hirschsprung 7, dysautonomie familiale 8, ainsi que les cancers tels que le neuroblastome 9. En outre, ils offrent la possibilité d'étudier les aspects du développement embryonnaire humain in vitro.
Actuellement disponibles et largement utilisés dans le protocole de différenciation in vitro pour la dérivation de cellules NC à partir de CSEh 10,11 nécessite jusqu'à 35 jours de différenciation et il implique l'induction neurale sur les cellules stromales de connexion telles que les cellules MS5 et est donc effectuée dans des conditions mal définies. Alors qu'il peut être mis à échelle pour produire de grandes quantités de cellules NC, par exemple nécessaire pour haut débit médicament dépistage 4, c'est la main-d'œuvre et coûteux. En outre, elle implique des passages manuel de rosettes de neurones, ce qui peut être difficile à reproduire, et donc est soumis à une variabilité dans l'ensemble, en particulier lorsqu'elle est appliquée à une grande variété de hESC ou hiPSClignes. Ici, la dérivation progressive des cellules NC dans un protocole de 18 jours qui est libre de cellules nourricières est affiché. Cette méthode est plus courte et plus défini que le protocole actuellement utilisé. En outre, il est très robuste dans la génération de cellules NC entre les différentes lignes de hiPSC. Surtout, il est démontré que les cellules NC produites par les deux protocoles émergent à la frontière de rosettes neurales (ci-après appelé rosette-NC ou R-NC). Les cellules dérivées en utilisant soit des deux protocoles semblent morphologiquement identiques, ils expriment les mêmes marqueurs NC et se regroupent dans l'analyse des microréseaux. Des cellules NC obtenues à l'aide du nouveau protocole (R-NC) sont fonctionnels, semblables à des cellules dérivées NC en utilisant l'ancien protocole (MS5-R-NC) de telle sorte qu'ils peuvent migrer et se différencier en neurones supplémentaire. Par conséquent, les cellules peuvent être utilisées en même temps que les cellules MS5-R-CN. Le protocole de la cellule R-NC pour la dérivation de cellules NC à partir de CSEh / iPSC sera utile pour toutes les applications de la technologie CSEh / iPSC impliquant la lignée NC. </ P>
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Protocol
1. Préparation de milieux de culture, des boîtes recouvertes et entretien de hPSCs
Préparation 1.1 Médias
Remarque: Filtrez tous les médias pour la stérilisation et conserver à 4 ° C dans l'obscurité pendant 2 semaines. noms de réactifs, la société et numéros de catalogue sont répertoriés dans le tableau des matières.
- DMEM/10% de FBS: Mélanger 885 ml de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml Pen / Strep et 5 ml de L-glutamine.
- HES-moyen: Mélanger 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml de L-glutamine, 5 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution essentielle d'acides aminés, de 1 ml β-mercaptoéthanol. Ajouter 10 ng / ml de FGF-2 après filtration du milieu.
ATTENTION: β-mercaptoéthanol est toxique, éviter l'inhalation, ingestion et contact avec la peau. - Moyen KSR-différenciation: Mélanger 820 ml Knockout DMEM, 150 ml KSR, 10 ml de L-glutamine, 10 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution d'acides aminés essentiels et 1 ml β-mercaptoéthanol.
- N2-differentiatisur le milieu: Dissoudre 12 g de poudre dans DMEM/F12 980 ml dH 2 O, ajouter 1,55 g de glucose, 2 g de bicarbonate de sodium et 100 mg APO transferrine humaine. Mélanger 2 ml dH 2 O: 25 mg d'insuline humaine et 40 ul de NaOH 1 N, ajouter la solution dissoute dans le milieu. Ajouter 100 pi de dichlorhydrate de putrescine, 60 pl sélénite, 100 pi de la progestérone et porter le volume à 1 L avec dH 2 O.
1.2 Revêtement de boîtes de culture
- Matrigel revêtement: Dégel 1 ml gelés matrigel aliquote par aspiration 19 ml DMEM/F12 sur l'aliquote jusqu'à ce qu'il soit dissous. Éliminer les grumeaux en le faisant passer à travers un tamis cellulaire de 40 um et la plaque 8 ml/10 cm plat. Incuber les boîtes pendant 1 heure à température ambiante. Aspirer le matrigel immédiatement avant l'étalement des cellules.
Remarque: Travaillez rapidement avec matrigel car il peut s'agglutiner à des températures supérieures à 4 ° C. - Revêtement PO / Lam / FN: Ajouter 10 ml de 1 x PBS contenant 15 ug / ml de bromhydrate de poly-L ornithine dans un plat de 10 cm. Incuber le plat pendant une nuit à 37 ° C. Laver les plaques avec du PBS 1x fois et ajouter 10 ml/10 cm plat de 1x PBS contenant 2 pg / ml souris laminine-I et 2 pg / ml de fibronectine. Incuber les boîtes pendant une nuit à 37 ° C. Avant l'étalement des cellules, enlever complètement la solution et laisser les plaques sécher complètement à température ambiante pendant 15-20 min en les debout sur le mur de la hotte de culture de tissus sans le couvercle.
Remarque: Les plats sont complètement sec et prêt pour le placage de la cellule où l'on peut voir des structures cristallines sur la surface (visible à l'œil nu). Les plaques peuvent être conservées à température ambiante pendant quelques heures dans cet état séché. Plats PO / Lam / FN doivent être préparés deux jours à l'avance. En cas d'urgence Lam / FN peut être incubé pendant 2-4 heures seulement. Toutefois, cela risquerait résultats différenciation / de survie sous-optimales.
1.3 Maintien de hPSCs
Remarque: hPSCs sont maintenus sur 0,1% de gélatine et de la souris mitotique inactivé fibroblastes embryonnaires (MFE) à la HES-milieu supplémenté avec 10 ng / ml de FGF-2 comme décrit précédemment 10,12. Les cellules doivent être divisés tous les 6-8 jours.
- Manteau un plat de 10 cm avec 8 ml de 0,1% de gélatine (PBS 1x sans en magnésium ou calcium) à température ambiante pendant 5 min.
- Décongeler MEF congelés rapidement dans un bain d'eau à 37 ° C. Ajouter 1 million MEF à 10 ml DMEM/10% de FBS.
- Aspirer la gélatine et plaquer les cellules. Incuber à 37 ° C pendant au moins 6 heures.
- Aspirer le DMEM/10% de FBS de la plaque MEF prêt, laver la plaque avec PBS 1x fois et ajouter 10 ml de la HES-milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 dichlorhydrate. Laisser le milieu se réchauffer à 37 ° C pendant 20 min.
Remarque: Pour fendage manuel de hPSCs une hotte à flux laminaire avec un microscope intégré est utilisé. Cependant, les cellules peuvent être soumises à des passages en utilisant des méthodes de substitution appropriées. - Sous une hotte à flux laminaire avec un microscope intégré, détachez colonies distinctes en utilisant un levier de cellule et les laisser flotter.
- Utilisez unSeringue de 1 ml pour aspirer les colonies flottantes et les dépêcher sur le, plaque MEF chaud frais. Transférer environ un quart des cellules de la nouvelle antenne. Incuber à 37 ° C.
- Nourrir les cellules quotidien avec le milieu HES frais.
2. Placage de hPSCs pour la différenciation
Remarque: hPSCs devraient être divisée ou plaqué de différenciation lorsque les colonies sont grandes, mais qui ont encore des arêtes vives avec aussi peu que possible cellules qui se différencient au niveau de leurs frontières (voir la figure 1B). Lorsque les cellules sont maintenues en utilisant des passages manuel, les colonies doivent être suffisamment grandes pour être facilement vu par les yeux. Pour obtenir la bonne idée de ce point de temps on peut conserver un plat HPSC séparée pendant deux semaines sans repiquer et regarder les cellules atteignent et passer le point de moment idéal pour passages / les différencier.
- Préparer boîtes de 10 cm avec matrigel 1 heure avant de commencer la différenciation. Revêtement de matrigel réussie peut êtregarantie à un grossissement de 4x.
- Lorsque les hPSCs sont prêts à être divisé, aspirer le milieu et ajouter 4 ml de 0,05% de trypsine-EDTA pour les cellules.
- Secouez le plat horizontalement pendant 2 min vigoureusement jusqu'à ce que l'on peut voir sur les FAE comme des cellules individuelles soulevant la plaque sous le microscope. Les colonies HPSC restent attachés comme des colonies.
- Immédiatement et abondamment, aspirer la trypsine et laissez la plaque reposer à température ambiante pendant 2-4 min.
- Ajouter 2 ml d'HES-support à la plaque et à l'aide d'une pipette P1000, détacher les cellules.
Remarque: Si les cellules ne peuvent pas être levées facilement de la surface, la plaque peut être incubée vide à température ambiante pour un autre 2-3 min. - Transférer les cellules à 8 ml HES-milieu supplémenté avec 10 uM Y-27632 dichlorhydrate.
- Aspirer le matrigel d'un préalablement préparé de 10 cm. Plaquer les cellules à un ratio de 1:1 ou 1:2 (par exemple: Les cellules d'un plat de 10 cm sont divisés en deux boîtes de 10 cm) sur la plaque de Matrigel. Incuber à 37 °C pendant une nuit.
Note: Ce revêtement devrait aboutir à environ 100 000 cellules / cm 2.
3. L'induction de la différenciation neurale
Remarque: La différenciation peut être initiée (jour 0) lorsque les cellules sont de 90-100% de confluence (voir figure 1C), généralement le lendemain. Si la confluence exacte n'est pas encore atteinte, les cellules peuvent être nourris quotidiennement avec HES-moyen jusqu'à ce qu'ils soient prêts pour la différenciation. En variante, le nombre initial de cellules étalées peut être augmentée.
- Au jour 0 à 3, nourrir les cellules quotidien avec 10 ml/10 cm bomber moyen KSR-différenciation contenant 0,1 uM LDN193189 et 10 uM SB431542.
- Le jour 4 et 5 aliments les cellules avec 75% de milieu KSR-différenciation et 25% de milieu N2 différenciation à la fois contenant et LDN193189 SB431542.
- Au jour 6 et 7 d'alimentation des cellules avec 50% de milieu KSR-différenciation et 50% de milieu N2 différenciation à la fois contenant LDN193189 et SB431542.
- Le jour 8 et 9 alimenter les cellules avec 25% de milieu KSR-différenciation et 75% de milieu N2 différenciation à la fois contenant et LDN193189 SB431542.
- Le jour 9 et 10 de la préparation des plats PO / Lam / FN comme indiqué au point 1.2.2 de réensemencement des cellules sur 11 jours.
- Le jour 10 cellules d'alimentation avec un milieu N2 différenciation contenant LDN193189 et SB431542.
4. Replacage en gouttelettes pour Spécification NC
- Le jour 11 aspirer Lam / FN des plaques préalablement préparés et laissez-les sécher complètement à température ambiante pendant 20-30 minutes, comme expliqué au point 1.2.2.
- Éliminer le milieu des cellules qui se différencient, se laver les cellules une fois avec PBS 1x et ajouter 8 ml accutase/10 cm plat. Incuber pendant 20 min à 37 ° C.
- L'utilisation d'un dispositif de levage de la cellule, détacher les cellules et les remettre en suspension dans Accutase avec une pipette de 5 ml. Transférer la suspension dans un tube de 15 ml.
- Ajouter 5 ml de PBS 1x et tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g.
- Remettre en suspension les cellules dans 10 ml 1x PBS. Pour assurer une suspension de cellules individuelles, les filtrer à travers un tamis cellulaire de 40 pm et compter les cellules en utilisant un hématimètre ou une technique équivalente.
- Faire tourner les cellules vers le bas et les remettre en suspension dans un milieu N2-différenciation contenant 200 pM d'acide ascorbique (AA), 20 ng / ml de BDNF, 100 ng / ml FGF8, 20 ng / ml SHH, 10 uM Y-27632, dichlorhydrate à la concentration de 100 000 -150 000 cellules/10 ul.
- L'utilisation d'un repeat-pipette, plaque 10 pi gouttelettes proches les uns des autres, sans les toucher sur le PO séché / Lam / FN 15 cm plats.
Remarque: Un plat de 10 cm de cellules différenciées aboutit normalement à environ 2-3 fois 15 cm plats ou environ 100 x 10 pi droplets/15 cm plat. - Laissez les gouttelettes s'élèvent à température ambiante pendant 20-30 minutes, puis très soigneusement (ne pas déranger les gouttelettes) ajouter 30 ml d'N2/AA/BDNF/FGF8/SHH/Y et incuber à 37 ° C.
- Le jour 12, nourrir soigneusement les cellules avec 20 ml/15 cm plat N2/AA/BDNF/FGF8/SHH.
- De day 14-17 nourrir les cellules chaque deuxième ou troisième jour de N2/AA/BDNF/FGF8.
- Le jour 16 et 17 préparer PO / plaques Lam / FN à Réensemencement cellules NC après tri FACS.
5. Cellulaire activé par fluorescence (FACS) des cellules NC
Remarque: La préparation des cellules pour FACS nécessite environ 2 h.
- Le jour 18 moyen de supprimer, laver les cellules une fois avec PBS 1x dans le plat et ajouter 12 ml Accutase. Incuber les cellules pendant 20 min à 37 ° C.
- L'utilisation d'un dispositif de levage de la cellule, détacher les cellules de la surface et laisser flotter. Introduire à la pipette les cellules en suspension en utilisant une pipette de 5 ml, transférer à un tube de 50 ml et ajouter 30 ml de PBS 1x. Faites tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g.
- En utilisant une pipette P1000, remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 2% de FBS / HBSS (la HBSS contient 15 mM de HEPES). Ajouter 19 ml de 2% de FBS / HBSS et de filtrer des cellules à travers un tamis cellulaire de 40 um pour assurer une suspension cellulaire unique. Incuber les cellules sur la glace pour 15 mdans de blocage d'anticorps puis les compter en utilisant un hématimètre.
- Faire tourner les cellules vers le bas et les remettre en suspension à la concentration de 10 millions de cellules / ml dans 2% de FBS / HBSS.
- Mettre de côté 1 million de cellules par la tache, unique teinté (HNK-1 seulement et p75 seulement) et l'anticorps secondaire taché seulement (APC seulement et 488 uniquement) FACS contrôle.
- Ajouter 5 ul de HNK-1 et 5 pi de p75 anticorps primaire par 10 millions de cellules dans 1 ml de suspension pour les échantillons appropriés et incuber pendant 20 min sur la glace.
- Laver les cellules dans 10 ml de PBS 1x (centrifugeuse 5 min à 114 x g) et remettre en suspension les cellules dans 1 ml de 2% de FBS / HBSS. Ajouter 2 ul d'une APC et 488 ul de l'anticorps secondaire par 10 millions de cellules dans 1 ml de suspension appropriés pour les échantillons et incuber pendant 20 min sur de la glace dans l'obscurité.
Remarque: APC et 488 sont les anticorps secondaires utilisés ici pour la coloration HNK-1 et p75, respectivement. - Laver les cellules dans 10 ml 1x PBS deux fois, remettre en suspension 10 millions de cellules dans 500 ul de2% de FBS / HBSS contenant DAPI (0,5 ng / ul) ou alternatif coloration de cellules vivantes appropriées d'exclure les cellules mortes de l'analyse FACS.
- Transférer les échantillons de s'approprier tubes FACS.
- Préparer des tubes FACS avec 0,5 ml de 2% de FBS / HBSS à la collecte de cellules.
Remarque: Les cellules et les tubes de prélèvement sont conservés sur de la glace dans l'obscurité pendant le temps de tri. - En utilisant une machine de tri cellulaire avec des lasers qui peuvent détecter DAPI, APC et 488 tri DAPI-/HNK-1 + / P75 + cellules doubles positives.
Note: Temps de préparation et de manipulation des cellules conduit à un faible pourcentage de la mort cellulaire, taches DAPI des cellules mortes permet seulement et donc pour ces cellules doivent être exclues de la population triée. Toute tache en direct / morts de remplacement fonctionne aussi bien à cette fin. DAPI lui-même ne provoque pas de cytotoxicité dans la population de cellules vivantes.
6. Replacage de cellules triées, NC Agrandissement et entretien
Remarque: les cellules triées par FACS doit être la mainconduit avec un soin particulier pour assurer la survie optimale. Gardez-les sur de la glace jusqu'à ce que leur réensemencement. Ne pas vortex ou la pipette avec dureté. Les cellules peuvent être remises en suspension par agitation du tube.
- Après tri FACS, compter les cellules NC, puis tournez-les vers le bas et remettre en suspension dans un milieu N2 différenciation complété avec 10 ng / ml FGF2, 20 ng / ml d'EGF et 10 uM Y-27632 dichlorhydrate dans le volume approprié de les Réensemencement à 30 000 cellules / 10 ul de gouttelettes.
- Bien sécher préalablement préparé PO / plaques Lam / FN et plaque environ 50-70 gouttes par boîte de 10 cm. Laissez les plats s'élèvent à température ambiante pendant 20-30 min.
- Ajouter très soigneusement 20 ml/10 cm plat de N2/FGF2/EGF/Y-27632 sans déranger les gouttelettes. Incuber les cellules à 37 ° C.
- Nourrir les cellules tous les 2-3 jours avec N2/FGF2/EGF.
Remarque: les cellules NC sont développés ou des passages environ tous les 4-5 jours ou quand ils commencent à s'accumuler dans les gouttelettes. - Pour le passage des cellules NC, supprimer le support, wash les cellules une fois avec PBS 1x et ajouter 8 ml accutase/10 cm plat. Incuber pendant 20 min à 37 ° C.
- Introduire à la pipette les cellules de la plaque à l'aide d'une pipette de 5 ml et transférer dans un tube de 15 ml. Ajouter 6 ml 1x PBS.
- Faites tourner les cellules pendant 5 min à 114 x g.
- Remettre en suspension les cellules dans un milieu N2-différenciation supplémenté avec 10 ng / ml de FGF2, 20 ng / ml d'EGF et 10 uM Y-27632, dichlorhydrate afin d'avoir 20 000 cellules/10 ul gouttelette.
- Réensemencement les cellules dans 10 gouttes de pi sur des plaques PO / Lam / FN secs. Laissez les plats s'élèvent à température ambiante pendant 20-30 min.
- Ajouter avec précaution 20 ml/10 cm plat de N2/FGF2/EGF/Y-27632. Incuber à 37 ° C.
Remarque: les cellules NC peuvent être maintenues ou développées pour 2 semaines en tant que population de progéniteurs relativement homogène. Culture plus peut les amener à se différencier en divers types de cellules de la descendance.
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Representative Results
Les deux améliorations les plus importantes du protocole R-NC-dessus du protocole MS5-R-CN 11 sont les conditions de différenciation, définies libre-desserte et le raccourcissement global de l'exigence de délai. MS5 cellules nourricières 13 sont des cellules murines de moelle osseuse provenant stromales qui ont été présentés à l'appui différenciation neurale de CSEh 14. HESCs cultivées sur des cellules nourricières MS5 à former des structures épithéliales de faible densité et des rosettes de neurones 15, à la périphérie de laquelle émergent des cellules NC 10, mimant ainsi le développement neuronal humain précoce. Cependant, il n'est pas clair quelles molécules et les facteurs de croissance de signalisation sont libérés de cellules nourricières MS5. Par conséquent, les conditions de différenciation sont mal définis, ce qui rend difficile de les reproduire dans des expériences récurrentes et à travers les lignes HPSC. Pour l'induction neurale adéquate, CSEh doivent être ensemencées à faible densité dans les petites colonies sur les cellules MS5 d'alimentation, complicationsting mise à l'échelle et d'atteindre des rendements élevés de cellules différenciées. En 2009, une méthode a été développée qui vise à neuralizing hPSCs très efficace 12. Dans ce procédé hPSCs sont ensemencées à une densité élevée, dans des monocouches en l'absence de cellules nourricières MS5, obtenir des rendements élevés de l'induction neurale en 10 jours. Nous avons suivi le schéma de cette méthode dans l'adaptation du protocole de différenciation MS5-R-NC (figure 1A). HPSCs cultivées dans les colonies sur les FAE (figure 1B) sont dispersés et ensemencées sur Matrigel comme des cellules individuelles dans une culture monocouche à haute densité (figure 1C). Au jour 11 de la différenciation, de la majorité des cellules ont Neuralized avec succès (pax6-positif, non représenté 12). Réensemencement des cellules à haute densité dans des gouttelettes permet la formation de rosettes de neurones condensés à l'intérieur de la gouttelette (figure 1D et la figure 2). Cellules NC émergent aux frontières de rosettes de neurones (figure 1D </ Strong>) et migrer hors de la goutte (figure 1E). Après 7 jours de culture les cellules en outre NC peuvent être isolés par tri FACS. HNK-1/p75 cellules doubles positives NC peuvent être isolés à l'efficacité de 20-40% (figure 1F). Ce protocole nécessite 18 jours, tandis que le protocole MS5-R-NC nécessite jusqu'à 35 jours, ce qui rend le protocole de cellule R-NC plus utile pour une variété d'applications en aval.
Le but de ce travail est de générer des cellules NC dans un protocole plus court, plus reproductible et moins cher, ce qui donne les mêmes cellules que l'ancien protocole NC. Nous avons utilisé ce nouveau protocole de différencier avec succès au moins 10 CSEh et hiPSC lignées dérivées de patients et les contrôles sains (données non présentées), montrant la reproductibilité solide du protocole entre les différentes lignes HPSC. Le nouveau protocole réduit les coûts liés à l'utilisation de LDN contre caboche, moins d'utilisation de SHH et l'absence de coûts de production MS5. Le nouveau protocole dure 18 jours, comparativement à 35 jourss dans l'ancien protocole, qui permet d'économiser environ 5 tétées et donc leurs coûts de médias associés. Afin de déterminer si les cellules produites avec les deux protocoles ont la même identité, nous montrons que le développement des cellules NC dans les deux protocoles suit le même schéma de différenciation (figure 2). Les cellules passent par un stade de la rosette de neurones et les cellules produisent CN avec la morphologie identique après tri FACS. La petite taille des rosettes de neurones dans le nouveau protocole par rapport à l'ancien protocole est due à la forte densité de cellule après réensemencement à jour 11. Par contre, dans les anciens rosettes de protocole former au sein des colonies HPSC, qui ne sont pas aussi concentrés. Cellules NC dérivés avec les deux protocoles expriment les mêmes marqueurs biologiques NC, comme HNK-1, AP2 et nestine. Nous avons analysé les cellules NC générés avec les deux protocoles sur un niveau d'expression génique globale (figure 3A) et constaté que les cellules NC générés avec les deux protocoles se regroupent en étroite collaboration. Cellules NC qui étaient genrested par l'activation de la voie de signalisation wnt (wnt-NC) et ont démontré qu'ils ont le potentiel de générer des mélanocytes grappe 16, lorsqu'il est analysé séparément par l'expression globale des gènes, ce qui indique qu'il peut s'agir d'une population différente NC. En effet, nous avons été en mesure de générer des cellules souches de mélanocytes in vitro à partir de cellules (données non présentées) R-NC ou MS5-R-NC. De même, les cellules neuro-épithéliales (LSB), différencié pendant 10 jours dans LDN193189 et SB431542 ne montrent un profil d'expression génique clairement distincts. Cellules neuro-épithéliales sont progéniteurs précoces du système nerveux, et donc sont moins différenciés par rapport aux cellules NC et sont inclus ici comme une population témoin négatif. Pour évaluer si les cellules R-NC générés ici sont similaires aux cellules faites avec l'ancien protocole, nous montrons leur capacité de migration dans un scratch test in vitro (figure 3B). 48 heures après grattage d'un puits de confluence des cellules R-NC triés, les cellules migrent dans le SCRAtch succès. Enfin, on montre que les cellules R-NC ont le potentiel de se différencier en cellules du système nerveux autonome. Les cellules ont été différenciées spontanément pendant 4 jours après HNK1 + / p75 + FACS et colorées pour Mash1 et Tuj1, les gènes qui sont exprimés dans les neurones autonomes (Figure 3C).
Figure 1. Des étapes critiques dans le protocole de différenciation R-NC. Un MS5-R-NC 10,11 et R-NC régime. Protocole de différenciation. Les étapes de différenciation spécifiques des deux protocoles sont présentés. MS5: cellules stromales de desserte, KSR: moyen KSR-différenciation, N2: milieu N2-différenciation, LDN: LDN193189, SB: SB431542, S: sonic hedgehog, 8: FGF8, A: acide ascorbique, B:. BDNF B. Affiche colonies indifférenciées HPSC colorées avec Oct-4 et DAPI avant l'induction de la différenciation. C. Montre la densité de cellules (90 à 100% de confluence) au jour 0 de la différenciation, généralement un jour après l'étalement hPSCs. D. Affiche rosettes de neurones colorés avec Pax6 et des cellules NC émergents colorées avec HNK-1 intérieur de la gouttelette. E. Affiche jour 13 cellules, réétalées à jour 11 en gouttelettes et des cellules NC émergents à partir du bord de la goutte. F. FACS représentatifs tri terrain, montrant HNK-1/p75 cellules doubles positives NC à 18 jours de différenciation. Les portes ont été choisis sur la base des contrôles colorées et non colorées simples (non représentés). FACS tri parcelles peuvent différer entre les expériences, les lignes HPSC et l'utilisation de l'ancien ou le nouveau protocole en termes de pourcentage de cellules positives positives et simples doubles. Ainsi, il est important d'isoler la population à double positif pour assurer les cellules appropriées NC sont extraits. Images C à F ont été générés en utilisant le nouveau protocole R-NC.= "Https://www.jove.com/files/ftp_upload/51609/51609fig1highres.jpg" target = "_blank"> S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 2. Comparable crête neurale cellule identité des cellules dérivées de la MS5-R-CN ou le protocole R-NC. Dans les deux protocoles les cellules passent par un stade de la rosette de neurones. Cellules NC Présentation semblent identiques par la morphologie et par l'expression de marqueurs tels que NC HNK-1 et AP2. Cellules NC sont nestine-positives, montrant qu'ils sont des cellules progénitrices. Barre d'échelle: 200 um. Toutes les images de fluorescence sont contre pour DAPI. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3. Cellules NC générés avec l'ancien et le nouveau protocole ont même identité. A. Classification non supervisée de puces Illumina expression génique données comparant des cellules NC dérivés avec le MS5-R-NC et le protocole R-NC. Cellules NC dérivés avec le MS5-R-NC ou le protocole R-NC à jour 35 ou 18 jours respectivement ont été analysés en triple par hybridation avec un oligonucléotide tableau Illumina humaine 12. L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel Suite Partek génomique. Des différences significatives ont été définis comme ceux ayant un facteur de variation supérieur à 2 et inférieur à 0,05 FDR. 1421 gènes ont été analysés. Les réglages par défaut, comme échantillon euclidienne dissemblance, la méthode de cluster de liaison moyenne et 25 pour la longueur de dendrogramme ont été utilisés. Cellules NC induits par l'activation de la signalisation Wnt (wnt-NC) ont été inclus (les cellules étaient différentiated à jour de LDN193189 0-3, jour de SB431542 0-4, 0-11 et CHIR99021 jour FACS triés au jour 11 pour SOX10) 16. Ces cellules se regroupent séparément à partir de cellules R-NC, indiquant que les cellules wnt-NC et les cellules R-NC sont les populations distinctes. Cellules différenciées pendant 11 jours dans LDN193189 et SB431542 ont été inclus comme un contrôle neuro (LSB). Des cellules NC-R et-R-MS5 NC regroupent étroitement ensemble par rapport aux cellules témoins. Données d'expression génique premières sont disponibles sur GEO (www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/) # adhésion:. GSE50643 B. essai de migration. HNK1 + / p75 + triées par FACS des cellules R-NC ont été étalées sur PO / Lam / FN dans 96 puits et rayés manuellement 24 heures plus tard. L'image 0 h a été prise immédiatement après grattage et après coloration au Hoechst. Les puits restants ont été autorisés à migrer pendant 48 heures avant la deuxième photo a été prise. Barre d'échelle: 200 um C. Cellules R-NC triées ont été autorisés à se différencier spontanément pendant 4 jours et ont été colorées pour MaSH1, Tuj1 et DAPI. Barre d'échelle:. 500 um S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Pour la différenciation réussie de cellules R-NC de CSEh / hiPSCs les considérations suivantes doivent être prises. Il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles à tout moment. En particulier, il est important de tester les cultures HPSC pour contamination par des mycoplasmes régulièrement, depuis cette contamination va entraver la différenciation réussie, mais ne peut pas être facilement détecté visuellement dans les cultures HPSC. La différenciation R-NC doit être instauré à la densité cellulaire 90-100%; densité cellulaire inférieure affecte la survie et l'efficacité de la différenciation R-NC cellule. Il est essentiel de valider empiriquement concentrations optimales et les numéros de lot de certains des réactifs, en particulier KSR pour soutenir la différenciation NC efficace. Lorsque les cellules sont à nouveau ensemencées à 11 jours dans des gouttelettes, la densité de cellules à l'intérieur de la gouttelette de 10 ul doit être élevée et meilleure est déterminé de manière empirique. Une bonne rosette et NC-formation dépend de la densité cellulaire appropriée dans la gouttelette. Nous empiriquement observationved a augmenté la survie des cellules lorsque les cellules sont lavées deux fois au moins après le traitement avec Accutase. Pour l'isolement réussi de cellules NC-R par FACS des contrôles expérimentaux appropriés, comme des cellules non colorées colorées seulement, d'anticorps et d'anticorps unique souillé secondaire sont cruciaux. Les cellules mortes peuvent être exclus par DAPI, 7-AAD ou l'iodure de propidium coloration. De plus, des dilutions d'anticorps doivent être déterminées de manière empirique pour chaque lot d'anticorps spécifique. Il est important de FACS purifier les cellules R-NC en double coloration avec HNK-1 et p75, puisque coloration unique peut conduire à une contamination de la population NC avec des types cellulaires indésirables, tels que les cellules du SNC p75 positif, mésoderme tôt ou placode. Dans nos pourcentages d'expérience de la double contre les populations colorées simples peuvent varier entre les lignes HPSC et expériences de différenciation. R-NC FACS la survie des cellules de poste peuvent être augmentées en évitant pipetage sévère des cellules, au lieu effleurant du tube pour remettre en suspension les cellules est souhaitable. En outre, le placage R-NC FACSa été montré que les cellules isolées en milieu conditionné (milieu filtré les cellules se sont développées avant FACS) pour améliorer la survie 11. Il est conseillé de procéder à une différenciation de plus petite échelle en parallèle qui peut être coloré avec le Pax6 marqueur épithélial de neurones à jour 11 et le jour 14 pour assurer une neutralisation efficace et la formation de rosette. NC marqueurs, tels que HNK-1 ou AP2 au stade de la rosette de la différenciation correcte NC doivent être évalués également. En outre, les cellules isolées R-CN devraient être validés par la morphologie et la coloration pour les marqueurs CN, tels que AP2, HNK-1 et de la nestine (Figure 2).
La dérivation de cellules MS5-R-NC de HPSC a été décrite en 2007 par Lee et al. 10. Il a été montré que cette population de précurseur peut être propagé et en outre différenciés in vitro en des dérivés de la lignée NC. Cellules MS5-R-NC peuvent être spontanément différenciées en utilisant la sphère de neurones méthode 10,17ou par une différenciation dirigée dans vitro. Il a été établi que les cellules MS5-R-CN peuvent donner lieu à des cellules du système nerveux périphérique (des neurones autonomes et sensorielles), la glie périphérique (cellules de Schwann), myofibroblastes, les cellules souches mésenchymateuses et de leur descendance et les muscles lisses 10. Transplantation en poussin et la souris ont montré que les cellules MS5-R-NC migrent et se différencient in vivo 10. Cellules MS5-R-NC ont en outre été mis en cause dans la modélisation des maladies humaines. Le phénotype caractéristique de la maladie génétique familiale Disautonomia (FD) a été modélisée in vitro en utilisant des cellules spécifiques du patient MS5-R-CN hiPSC dérivés 2. NC phénotypes caractéristiques, telles que le développement dysfonctionnel des cellules NC et la migration ont été présentés dans des cellules dérivées de patients FD mais pas dans les cellules témoins en bonne santé. Cellules MS5-R-NC ont également été utilisés pour établir des tests toxicologiques des composés qui affectent la migration de la crête neurale au cours embryonnaires humainesdéveloppement, avec la possibilité d'éviter le rejet de futurs médicaments qui pourraient affecter négativement le développement neurologique 5. Une application intéressante de la technologie est HPSC dépistage et les tests d'options de traitement pharmaceutiques pour les maladies humaines à haut débit. Cellules MS5-R-NC ont été utilisés pour accomplir le premier tel écran dans un modèle de maladie à base d'iPSC, c'est à dire la dysautonomie familiale 4. Cet écran a conduit à l'identification de nouveaux composés qui peuvent encore être évaluée dans des essais cliniques.
Pour toutes les applications du champ HPSC il est essentiel de disposer de données exactes, reproductible, défini et spécifique dans les protocoles de différenciation in vitro disponibles. Dans ce rapport, nous montrons l'adaptation d'un protocole in vitro de différenciation établie pour la dérivation de cellules R-NC de hPSCs. Le protocole rapporté donne les mêmes cellules que précédemment signalés dans 10 des conditions de culture plus définies et un Shorter de trame temporelle. Ce protocole peut être utilisé pour générer des cellules R-NC pour les maladies humaines affectant les cellules de la lignée NC, pour le criblage de composés, les tests de toxicologie et le développement de protocoles de différenciation dirigés vers des types cellulaires dérivées de la lignée NC.
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Disclosures
Les auteurs n'ont aucun intérêt à divulguer contradictoires.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par une bourse pour chercheurs avancés du Fonds national suisse de la science et par des subventions de NYSTEM (C026446; C026447) et l'initiative sur les cellules souches Tri-institutionnel (Fondation Starr).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | I2643 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5 U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10 cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipettes, pipette tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
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