Implantation de veine cave inférieure interposition de greffe en modèle de souris

Résumé

Pour améliorer notre connaissance de la formation néo-tissu cellulaire et moléculaire, un modèle murin de la TEVG a été récemment mis au point. Les greffons ont été implantés en sous-rénaux des greffes de la veine cave d'interposition de souris C57BL / 6. Ce modèle permet d'obtenir des résultats similaires à ceux obtenus dans notre étude clinique, mais sur un temps bien sûr beaucoup plus courte.

Résumé

Échafaudages biodégradables ensemencées avec des cellules mononucléées de la moelle osseuse (BMC) sont souvent utilisés pour la chirurgie reconstructive pour traiter les anomalies cardiaques congénitales. Les résultats cliniques à long terme ont montré d'excellents taux de perméabilité, cependant, avec une incidence significative de la sténose. Pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu vasculaire et de prévenir le développement de la sténose dans l'ingénierie tissulaire greffons vasculaires (TEVGs), nous avons développé un modèle de souris de la greffe d'environ 1 mm de diamètre intérieur. Tout d'abord, les TEVGs ont été assemblés à partir d'échafaudages tubulaires biodégradables fabriqués à partir d'un non-tissé d'acide glycolique sentir maille enduit de copolymère ε-caprolactone et L-lactide. Les échafaudages ont ensuite été placés dans un lyophilisateur, l'aspirateur pendant 24 heures, et stockés dans un dessiccateur jusqu'à ce que l'ensemencement des cellules. Deuxièmement, la moelle osseuse a été recueillie à partir de souris donneuses et des cellules mononucléées ont été isolées par centrifugation en gradient de densité. Troisièmement, environ un million de cellules ont étéensemencées sur un échafaudage et incubées O / N. Enfin, les échafaudages graines ont ensuite été implantés en sous-rénaux greffes veine cave d'interposition dans C57BL / 6. Les greffons implantés démontré une excellente perméabilité (> 90%) sans preuve de complications thrombo-emboliques ou la formation d'anévrisme. Ce modèle murin nous aidera à comprendre et quantifier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu dans le TEVG.

Introduction

Les malformations cardiaques congénitales sont des affections graves qui touchent près de 8% des naissances vivantes aux États-Unis. Environ 25% de ces enfants atteints de malformations cardiaques congénitales ou 2,4 pour 1 000 naissances vivantes, nécessitent un traitement invasif dans la première année de leur vie ^1. Le traitement le plus efficace pour une maladie cardiaque congénitale est la chirurgie reconstructive. Malheureusement, les complications résultant de l'utilisation de conduits vasculaires actuellement disponibles sont la cause la plus importante de la morbidité et de la mortalité post-opératoire.

Pour résoudre ce problème, nous avons développé les premiers ingénierie tissulaire greffons vasculaires (TEVGs) pour une utilisation clinique ^2. TEVGs ont été construits à partir de tubes de polyester biodégradables ensemencées avec des cellules dérivées de l'mononucléaires autologues de moelle osseuse (BM-MNC) et implantés comme des conduits veineux en chirurgie cardiaque congénitale. Les résultats ont montré d'excellents taux de perméabilité à 1-3 ans de suivi, mais avec une incidence significative de la sténose 3,4. Il était clair qu'une meilleure compréhension de la formation de néo-tissu vasculaire et le mécanisme sous-jacent au développement de TEVG sténose était nécessaire. Afin de mieux comprendre le développement de TEVGs et le mécanisme de développement d'une sténose, un modèle ovin a été créé ^5,6. Dans ce modèle, les TEVGs transformées avec succès dans les vaisseaux vivants et étaient similaires dans les deux morphologie et la fonction des veines indigènes. Cette utilisation d'un modèle de grand animal était une première étape importante dans la fourniture de l'information pré-clinique qui a facilité l'utilisation clinique de TEVGs. Cependant, la pleine compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu vasculaire dans TEVGs utilisant de grandes modèles animaux est limitée en raison des limitations dans la caractérisation moléculaire des phénotypes cellulaires vasculaires dues au manque d'espèces outils moléculaires spécifiques. Pour combler ces lacunes, un modèle murin de TEVGs a été développé en raison de l'avancement rapide de la génétique de la souris et leur vaste molecular caractérisation avec l'avantage supplémentaire d'une échelle de temps plus courte.

Le murin IVC modèle d'interposition fidèlement récapitulé le processus de néovaisseaux formation qui se produit dans les grands animaux et les humains, mais sur un parcours de temps beaucoup plus court ^6-9. Ici, un protocole détaillé pour la fabrication de la greffe à petite échelle en utilisant des échafaudages biodégradables, BM-MNC récolte et l'isolement, BM-MNC semis sur l'échafaudage, et implantation du greffon dans un modèle murin ont été décrits.

Protocole

NOTE: Toutes les procédures d'animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel Hôpital soin et l'utilisation des animaux de la Nationwide Children.

1. Fabrication de greffe

1. Ajoutez la solution de ε-caprolactone et de L-lactide copolymère P (LA / CL) en ajoutant 100 mg de P (LA / CL) dans 2 ml de dioxane sous une hotte de laboratoire. Placer la solution sur un vortex et mélanger pendant 1-1,5 heures pour dissoudre complètement.
2. Dans le même temps, retirer une feuille de l'acide glycolique (PGA) estime du congélateur et découpez plusieurs sections 5 x 8 mm. Également couper la pointe d'un pi pipette 0,1-10 juste au-dessus du filtre.
3. Insérez une aiguille 19 G (1,5 de longueur) dans l'extrémité distale d'une pointe de pipette et envelopper le PGA estimé autour de l'aiguille à l'aide de micro pince.
4. Poussez délicatement le feutre à l'extrémité distale de la pointe de la pipette, où la lumière est plus droit que la partie proximale, en utilisant une aiguille 18 G émoussée, tandis que l'aiguille 19 G est inséré.
5. Pipette40 pl P (CL / LA) solution dans la pointe de la pipette à partir du haut. Saturer la PGA sentir avec la solution. Puis pousser les bulles d'air à l'aide d'un distributeur de pipette. Répétez cette procédure si nécessaire.
6. La place des greffes dans un tube de 50 ml et le placer dans un congélateur à -80 ° C pendant 20 min. Assurez-vous que la tête des aiguilles face à la baisse.
7. Transférer le tube dans un lyophilisateur et le vide pendant 24 heures. Assurez-vous d'ouvrir le couvercle du tube d'avoir le flux d'air.
8. Sortez les greffes et les retirer des aiguilles. Couper les deux extrémités de la greffe en laissant une section ~ 5 mm et les remettre sur les aiguilles à maintenir leur forme. Gardez les greffons dans un dessiccateur.
9. Placez l'échafaud sous la lumière UV dans un biosécurité capot O / N avant l'ensemencement des cellules.

2. Moelle osseuse mononucléaires récolte des cellules et isolement

1. Euthanasier les souris avec une surdose de kétamine / xylazine (kétamine, 200 mg / kg et de xylazine, 20 mg / kg).
2. Supprimer os (fémur uned tibias) de 3 souris pour 10 implantations de greffe et les placer dans une boîte de Pétri avec 10 cc RPMI. Couper les deux extrémités des os et de la moelle osseuse de chasse à l'aide d'une seringue avec une aiguille 25 G dans une nouvelle boîte de Pétri avec 3 cc RPMI. Recueillir os solution RPMI osseuse et dans un tube de 15 cc et laver la boîte de Pétri avec 2 cc supplémentaires RPMI pour recueillir le reste de BM.
3. Prendre l'échantillon (5 à 10 pi) et compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé ou hémocytomètre. Notez le résultat.
4. Mettre 5 cc Ficoll dans un tube de 15 cm de centrifugeuse et ajouter os solution RPMI osseuse et. Ajouter la solution très lentement pour éviter qu'il se mélange avec le Ficoll.
5. Centrifuger à 528 g pendant 30 min avec "pas de frein" à 24 ° C.
6. Enlever la couche supérieure de rose. Recueillir le moyen clair couche Figure 1, qui est la couche MNC, et diluer avec du PBS 1:1.
7. Centrifuger la solution diluée de MNC à 528 g pendant 10 min à 24 ° C.
8. Enlever le surnageant et diluth le culot avec 5 ml de PBS.
9. Centrifuger la solution de granulés à 528 g pendant 10 min à 24 ° C.
10. Retirer le surnageant. On dilue le culot avec le volume approprié de milieu RPMI (~ 200 ul).
11. Prélever un échantillon de pl 5-10 et compter les cellules en utilisant un compteur de cellules automatisé ou hématimètre. Notez le résultat. Répétez la cellule compter une fois de plus et de calculer le nombre de cellules moyenne.
12. Diluer la concentration des cellules à l'aide d'un million cellules/10 ul de RPMI.

3. Portable semis

1. Échafaudage pré-imbibé en ajoutant 5 ul RPMI luminale pendant 5 min, puis retirez RPMI.
2. Ajouter 10 ul cellules nucléaires de moelle osseuse provenant de mono dans RPMI de l'étape 2.12 de lumière d'échafaudage et attendre 10 min pour permettre aux cellules de se fixer sur l'échafaud.
3. Couper une aiguille 19 G de 1 cm de longueur et mettre l'aiguille dans la lumière de l'échafaudage pour garder la forme de l'échafaud. Placer l'échantillon dans une plaque de 24 puits.
4. Ajouter 1000 pi de RPMI à chaque puits et incuber O / N dans un incubateur.

4. Implantation du greffon

1. Autoclave tous les outils chirurgicaux avant la chirurgie: 1x ciseaux fins, micro pince 3x, micro pinces vasculaires 2x, 1x pince forceps applicables, titulaire de la micro-aiguille 1x, ciseaux à ressort 1x, 1x enrouleur.
2. 6-8 semaines femelle C57BL / 6 sont utilisés comme vasculaires receveurs de greffe de l'ingénierie tissulaire. Débranchez la souris de sa cage et le peser, alors anesthésier par une injection intrapéritonéale dans le quadrant inférieur droit de l'abdomen avec un cocktail de kétamine / xylazine (kétamine, 100 mg / kg et de xylazine, 10 mg / kg). Le kétoprofène (5 mg / kg, IP) est utilisé comme analgésique pré-anesthésie.
3. Vérifiez le niveau de sédation par pincement conte, puis couper les poils abdominale. Lubrifier les yeux avec pommade ophtalmique stérile, et placer la souris dans une position de décubitus dorsal sur un tapis. Désinfecter l'abdomen avec des tampons de bétadine et alcool. Cover la souris avec un champ stérile et d'exposer la zone d'incision seulement.
4. Faire une laparotomie médiane incision du dessous de la xiphoïde à la région sus-pubienne, et insérer un écarteur auto-statique. Envelopper les intestins dans une solution saline humidifié gaze. Définir carrément l'aorte et la veine cave.
5. Placez deux clamps vasculaires micro sur les deux côtés proximal et distal de l'aorte et la veine cave, puis carrément séparer l'aorte de la veine cave transect de la veine cave. Si nécessaire, ligaturer les branches de l'aorte abdominale avec un 10-0 sutures monofilament les aiguilles coniques.
6. Implanter une veine cave inférieure avec interposition greffe extrémité proximale et distale de mettre fin à l'aide d'un anastomoses 10-0 suture stérile. Couper le greffon, habituellement de 1 à 2 mm, en fonction de l'anatomie de la souris. Fixer la greffe avec une maille sur les deux extrémités proximale et distale et commencer à suturer de façon continue avec 4-5 points de suture à partir de l'autre côté de la greffe. Après avoir terminé la face avant, retournez les pinces et les greffesde l'autre côté et de suturer le côté arrière de la greffe. Pendant l'implantation, rincer la greffe avec une solution d'héparine fréquemment pour prévenir la thrombose aiguë.
7. Retirer la pince proximale et contrôler l'hémorragie en appliquant un agent hémostatique résorbable stérile d'actualité. Lorsque l'hémorragie s'arrête complètement, retirez la pince distale et contrôler l'hémorragie de la même façon. Assurez-vous que le sang coule à travers le greffon.
8. Fermez la musculature abdominale et la peau en deux couches à l'aide d'un monofil 6-0 polyamide noir avec aiguille fileté inclus.
9. Injecter 0,5 ml de solution saline sous-cutanée et placer la souris dans une cage de récupération sur un coussin chauffant jusqu'à ce que la souris est entièrement mobile. Lors de la récupération, le retour de la souris dans une nouvelle cage avec une literie de papier. Donner des médicaments de la douleur (ibuprofène, 30 mg / kg, eau potable) pendant 48 heures.

Résultats

Un schéma de TEVG implantation est représenté sur la figure 1. Moelle osseuse a été récoltée à partir d'une souris donneuse et des cellules mononucléaires ont été isolées par centrifugation de densité, puis ensemencées sur un échafaudage biodégradable. Les échafaudages ensemencées ont été incubées O / N et implantés à une souris receveuse comme une cave greffe d'interposition de la veine cave inférieure.

La figure 2 illustre la microscopie électroniq...

Discussion

Le modèle de souris de TEVG est un outil précieux pour étudier les mécanismes cellulaires et moléculaires de la formation néo-tissu et le développement de la sténose. La tête de série BM-MNC a été montré dans les deux images histologiques et SEM des cellules ensemencées sur la greffe ^11. Efficacité cellule de semis a également été démontré en utilisant un test d'ADN ^7. L'utilisation de ce système modèle, nous avons montré que l'ensemencement de cellules réduit l'incidence du dévelop...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Feutre d’acide polyglycolique (PGA)	Structures biomédicales Pointe		pipette commandée sur mesure
, 0,1-10 &mu ; l  ;	Fisher Sientific	02-707-456
Lyophilisateur  ;	Labconco	7070020
RPMI medium 1604	Gibco	11875-093
Boîte de Pétri	BD	353003
plaque 24 puits	Corning	3526
15 cc tube  ;	BD	352096
Ficoll	Sigma	10831-100ml	Aussi appelé 'Histopaque’DPBS
	Gibco	14190-144
Coupe-os Littauer 4.5 » Straight	Roboz	RS-8480	Pour pince de récolte BM
4.5"	Roboz	RS-8120	Pour Ciseaux de récolte BM
4.5"	Roboz	RS-5912	Pour la récolte BM
Microscope	Leica	M80
C57BL/6J (H-2b), Female	Jackson Laboratories	664	8-12 semaines Injection de
chlorhydrate de kétamine	Hospira Inc.	NDC 0409-2053
Solution stérile de xylazine	Akorn Inc.	NADA# 139-236
Kétoprofène	Fort Dodge Santé animale	NDC 0856-4396-01
Ibuprofène	PrecisionDose	NDC 68094-494-59
Héparine	sodique Sagent Pharmaceticals	NDC 25021-400
Solution saline (chlorure de sodium stérile à 0,9 %)	Hospira Inc.	NDC 0409-0138-22
Chlorure de sodium injectable à 0,9 %	Hospira Inc.	NDC 0409-4888-10
Pommade ophtalmique à la vaseline	Dechra Veterinary Products	NDC 17033-211-38
Tampons de préparation à l’iode	Triad Disposables, Inc.	NDC 50730-3201-1
Tampons de préparation à l’alcool	McKesson Corp.	NDC 68599-5805-1
Applicateurs à embout en coton	Fisher Scientific	23-400-118
Ciseaux fins	FST	14028-10
Pince à micro-adson	FST	11018-12
Pince à pince	FST	00072-14
S& T Pince vasculaire	FST	00396-01
Ciseaux à ressort	FST	15008-08
Écarteurs Colibri FST		17000-04
Dumont #5 pince	FST	11251-20
Dumont #7 - pince fine	FST	11274-20
Dumont #5/45 pince	FST	11251-35
Porte-aiguille Tish/ Pince	Micrins	MI1540
Suture monofilament polyamide noir, 10-0	AROSurgical Instruments Corporation	TI638402	Pour suturer le greffon
Suture monofilament polyamide noir, 6-0	AROSurgical Instruments	SN-1956	Pour la musculature et la fermeture de la peau
Éponges non tissées	McKesson Corp.	94442000
Hémostat résorbable	Ethicon	1961
ml Seringue	BD	309659
3 ml Seringue	BD	309657
10 ml 309604
18 G 1,5 po, Aiguille	BD	305190
25 G 1 po, Aiguille	BD	305125
30 G 1 po, Aiguille	BD	305106
Recirculateur d’eau chaude	Gaymar	TP-700
Coussin chauffant	Gaymar	TP-22G
Tondeuse	Wahl	9854-500

de 1