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Summary
Microdisección se ha empleado ampliamente para el examen de ADN, ARN, y proteínas dentro del tejido. Microscopía de captura láser (LCM) es el método más comúnmente utilizado, pero una nueva técnica de fresado, mesodissection, es recientemente disponible. Demostramos la extracción de RNA de mesodissected formalina parafina fijo diapositivas de tejidos embebidos de granulomas de Mycobacterium tuberculosis.
Abstract
Microdissection se ha utilizado para el examen de los tejidos en el ADN, el ARN y los niveles de proteína durante más de una década. Microscopía de captura láser (LCM) es la técnica de microdisección más común usado hoy en día. En esta técnica, se utiliza un láser para fundir focalmente una membrana termoplástica que se superpone a una sección de tejido deshidratado 1. La sección de tejido de material compuesto entonces se levanta y se separa de la membrana. Aunque esta técnica puede utilizarse con éxito para el examen del tejido, que consume tiempo y es caro. Además, la finalización con éxito de los procedimientos que utilizan esta técnica requiere el uso de un láser, lo que limita su uso. Un nuevo enfoque de microdisección más asequible y práctica llamada mesodissection es una posible solución a las trampas de la LCM. Esta técnica emplea el sistema de MESO-1/MeSectr moler el tejido deseado a partir de una muestra de tejido montada deslizante, mientras que al mismo tiempo la dispensación y aspiración de fluido para recuperar la muestra de tejido deseada enun poco molino de consumible. Antes de que comience el proceso de disección, el usuario alinea la parafina fijado en formol incorporado (FFPE) deslice con hematoxilina y eosina manchado (H & E) Tobogán de referencia. A partir de entonces, el operador anota el área de la disección deseada y procede a diseccionar el segmento apropiado. El programa genera una imagen archivada de la disección. La principal ventaja de mesodissection es la corta duración necesaria para diseccionar una diapositiva, teniendo un promedio de diez minutos de configurar para probar la generación en este experimento. Además, el sistema es significativamente más rentable y fácil de usar. Una ligera desventaja es que no es tan precisa como la microscopía de captura por láser. En este artículo se demuestra cómo mesodissection puede utilizarse para extraer el ARN a partir de diapositivas de granulomas FFPE causadas por Mycobacterium tuberculosis (Mtb).
Introduction
Las muestras han sido tradicionalmente microdissected manualmente, ya sea todo el tejido o diapositivas utilizando una aguja y bisturí. Para ello se requiere una clara separación entre la sección de tejido de interés y los tejidos circundantes secciones 2. Con los avances actuales en la tecnología de perfil molecular, ha habido una creciente necesidad de evaluar tejido a nivel celular. Debido a las limitaciones de microdisección manual, incluyendo técnicas de LCM se establecieron para permitir una mayor precisión de aislamiento. Esta técnica permite al investigador para aislar poblaciones de células específicas de diversos tipos de células y de diapositivas, que luego se pueden utilizar para ensayos de aguas abajo, tales como perfiles de expresión génica. Aunque es muy eficaz para los ensayos posteriores, LCM no está exenta de limitaciones. En primer lugar, LCM es un proceso costoso y consume mucho tiempo. Además, debido a la naturaleza inestable de ARN, que es a menudo un reto para obtener ARN de alta calidad a partir de muestras LCM 2. Debido a la disadvantages de LCM, siguen siendo necesarios nuevos avances en la tecnología de microdisección para hacerlo más accesible a un mayor número de investigadores de una manera sensible asequible y tiempo.
Uno de estos avances en la tecnología de microdisección ahora disponible es una técnica conocida como mesodissection. En esta técnica se utiliza una máquina para moler la sección de tejido anotada de interés y aspira en una fresa de consumibles 3. A continuación, esta muestra puede ser aspirado por un tubo de recogida y se utiliza para aplicaciones posteriores. Las ventajas de este sistema son que es significativamente menos costoso y sensible al tiempo. En nuestra experiencia, el sistema permite la disección de una sección de tejido granuloma pulmonar en diez minutos. Por otro lado, LCM tradicional requeriría probablemente horas para completar el proceso. El sistema permite al operador cargar un portaobjetos de referencia a utilizar como una comparación, así como herramienta para la anotación. Además se genera un informe esbozando ªárea e de la diapositiva que se ha diseccionado. Hay dos desventajas principales de mesodissection. Aunque es eficaz en la extracción de varias celdas, es difícil aislar una sola célula. Además, la precisión de la imagen generada no es tan clara como si el uso de otros microscopios de imagen.
La tuberculosis (TB) es una importante causa de muerte de la enfermedad infecciosa de la humanidad en todo el mundo y es consecuencia de la infección por Mtb. En la mayoría de los individuos expuestos a aerosoles de Mtb, la infección está latente limitado. En por lo menos 10 millones de personas anualmente, da lugar a la enfermedad de la TB activa 4. Durante la infección latente, Mtb está contenida dentro de las lesiones pulmonares patológicos conocidos como granulomas. Por lo tanto, se ha argumentado que el resultado de la infección por Mtb se decide a nivel del granuloma 5.
Aquí demostramos cómo mesodissection se puede utilizar para microdissect granulomas causados por Mtb. Las diapositivas utilizadasson de FFPE tejido pulmonar de los macacos rhesus infectados. Para el propósito de esta demostración, vamos a diseccionar granulomas en su totalidad. También demuestran que el ARN se puede extraer de los tejidos recuperados. Esta técnica se puede aplicar a muestras de tejido de varios otros especímenes y luego se usa para una variedad de ensayos de aguas abajo.
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Protocol
1. Calibrar Instrumento Mesodissection con 2ID Imaging Software
El software de imágenes 2ID se conoce como el software o el programa para el resto de este artículo. Este paso es necesario para seguir correctamente la imagen, así como alinear varios marcos de diapositivas.
- Encienda el instrumento y el ordenador.
- Abra el software y seleccione "instrumento de calibración".
- Calibrar viajes etapa con el joystick. Mueva el escenario a la posición superior izquierda. Pulse el botón "set" en el paso 1 en el programa.
- Mueva el escenario para bajar la posición correcta. Pulse el botón "set" en el paso 2 en el programa.
- Calibrar la aspiración pulsando primero "Z-button" para recaudar conjunto de la cabeza. Pulse el botón "pulso aspirado" y el botón "disección" en la palanca de mando hasta que la varilla de control de émbolo alcanza la primera posición. Pulse el botón "set" en el paso 3 del programa.
- Pulse el botón "reinicio aspirado y# 8221; botón. Una vez que el émbolo se detiene en la posición de la prensa "conjunto" de abajo en el paso 4.
- Haga clic en la pestaña de "escala".
- Coloque la regla de calibración en el lado blanco.
- Centrarse microscopio si es necesario.
- Dibuja una línea entre las dos barras de escala a través del ratón.
- Introduzca la distancia en el recuadro paso 2 botón. Presione "compute" etiquetados.
- Haga clic en la pestaña de "punto de mira". Gire la velocidad del motor a 1.
- Inserte xScisor en el conjunto de cabeza. Conjunto de la cabeza inferior en el eje z posición lista pulsando el botón "eje Z". NOTA: El conjunto de la cabeza es la gran estructura en la parte superior del instrumento de disección. El xScisor se conoce como un poco molino de consumible para el resto de este artículo.
- Haga clic en el botón "disección de participar" en la palanca de mando. NOTA: Este botón se encuentra en la parte superior de la palanca de mando.
- Definir centro de rotación visual. Para ello, mueva centro del punto de mira sobre el centro de giro con definird parámetro en el paso 1 del programa. Use la flechas arriba y abajo en la "x" y los bares "eje y" para ajustar los píxeles para alinear en forma de cruz. Haga clic en la pestaña de "hecho".
- Haga clic en el icono de "casa". NOTA: Esto se representa una imagen de la casa ubicada en la esquina superior derecha cerca.
2. Crear Imagen de referencia
- Coloque H & E diapositivas en el escenario. Coloque la tapa opaca en la parte superior de la diapositiva. Conducir el instrumento moviendo el joystick hacia la zona deseada de la corredera H & E. Guarda la imagen generada. NOTA: Cualquiera de la pestaña "Referencia de captura" o pestaña "diseccionar" se puede utilizar para completar este paso.
3. Alinee Paño para Disección
- Haga clic en la opción "diseccionar tejido" en la pantalla principal.
- Rellene el "operador", "número de la disección de la adhesión", "el número de acceso de referencia", "número de código de barras xScisor," & #8220; disección número de lote fluida "," Tamaño xScisor "y" Descripción "en la pestaña" Configuración ".
- Haga clic en la pestaña de "encontrar el tejido".
- Importación de imágenes de referencia previamente guardados.
- Coloque una diapositiva FFPE sin manchas de 5 micras de espesor en el escenario. Mueva etapa a la misma zona que el representado en la imagen de referencia. Haga clic en la pestaña "Insertar imagen".
- Haga clic en la pestaña "align". Usa el ratón y las flechas asociadas para alinear la imagen de referencia a la imagen sin mancha.
4. Anotar Slide
- Haga clic en la pestaña de "anotar".
- Utilice el ratón para dibujar un círculo alrededor del área deseada de la diapositiva que se microdissected.
5. Cargue consumible Mill Bit
- Rellene consumible poco molino con tampón deseado, aquí búfer PKD, tirando del émbolo hacia arriba y hacia abajo en un movimiento fluido varias veces. Asegúrese de excluir el aireburbujas.
- Levante el eje Z por "botón del eje Z" presionando.
- Cargar consumible poco molino en la máquina. Para ello, deslizando la fresa de consumibles en la parte superior de la máquina para que la línea blanca en las líneas de instrumentos con la línea de negro en la fresa de los consumibles. Pulse el botón de "reinicio de aspiración" para permitir que el émbolo sea bajado a la posición correcta. NOTA: Debe ser fácil para deslizar la fresa de los consumibles. Si no es así, asegúrese de que los indicadores estén alineados correctamente.
- Bajo el eje Z pulsando de nuevo el botón "eje Z".
6. Disección de tejidos (Figura 4)
- Abra la pestaña "diseccionar".
- Gire a velocidades de motor y aspiración a 1.
- Marque la casilla "espectáculo de seguimiento". Nota: Esto permite al usuario visualizar el área diseccionado durante el proceso de disección.
- Una vez listo para diseccionar, continúe sosteniendo el botón "participar", así como "el aspirado y #8221; botón mientras se mueve la palanca de mando en una dirección en sentido antihorario para diseccionar el tejido.
- Continuar para diseccionar en una dirección hacia la izquierda hasta el aspirado es pestaña "lleno" se vuelve rojo.
7. Vaciar y quitar consumible Mill Bit
- Coloque un tubo de microcentrífuga de 0,5 l bajo la punta de la fresa de los consumibles.
- Varilla Press control "aspiración" rápidamente para expulsar la muestra en tubo de microcentrífuga.
- Pulse con el aumento de la fuerza para expulsar usado fresa de consumible.
- Enjuague fragmento de tejido tirando del émbolo hacia atrás. Empuje el émbolo hacia adelante para expresar la muestra restante en consumibles poco molino. El fragmento de tejido será ahora contenido dentro del tubo de microcentrífuga.
8. Muestra Lyse con proteinasa K digestión por un tratamiento térmico
- Añadir 70 l de TE pH 8,5 que contiene 5 g de proteinasa K a la muestra de tejido recuperada.
- Coloque la muestra en programable calentador de agitador.
- La digestión completa usando programable calentador-agitador a la siguiente configuración: 60 ˚ C durante 30 minutos a 1500 rpm; 82 ˚ C durante 15 min a 1500 rpm; y 25 ˚ C durante 1 minuto a 450 rpm. La muestra está ahora lista para aplicaciones posteriores.
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Representative Results
El protocolo mencionado se muestra cómo utilizar una nueva técnica mesodissection para extraer el ARN a partir de diapositivas de tejidos FFPE. La eficacia de este protocolo se muestra a través de diapositivas FFPE de granulomas pulmonares de NHP infectados con Mtb en varias fases infecciosas. Figuras 1-3 son imágenes del instrumento. Figura 4 representa cómo se produce el proceso de disección y la imagen resultante generada por el software. Tabla 1 muestra los resultados de la extracción de RNA con un granuloma de un NHP en cada estado infeccioso. ARN se amplificó y se purificó para permitir pruebas de RT-PCR de 16S (Tablas 2-4). Tabla 4 confirma la presencia de Mtb subunidad 16S ribosomal, y por lo tanto de Mtb, en las muestras microdissected.
Figura 1. Imagen de instrumento mesodissection incluyendo joystick. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. Vista más cercana del instrumento mesodissection. El botón "eje Z", la velocidad de "motor" y "aspiración" perillas de velocidad se muestran en la parte izquierda de la imagen. El "botón de reinicio del aspirador" y el botón "on / off" se muestran en el lado derecho de la imagen. La etapa de diapositivas se encuentra en la parte superior del instrumento. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Una vista más cercana de la palanca de mando. La palanca de mando, "pulso aspirado" y los botones de "velocidad de fase" que se muestran. Por favor, haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Informe de todo el granuloma mesodissected del NHP EB23. Los animales utilizados en este estudio estaban infectados con CDC1551 MTb a través de aerosol. La imagen de referencia de la izquierda muestra un granuloma H & E manchadas de un macaco rhesus infectados activamente. El área de interés deseado para ser diseccionado se resume en verde. La imagen en el sho mediows correspondiente diapositiva FFPE sin manchas de 5 micras de espesor antes de la disección. Las áreas fueron alineados utilizando el software y el área de la correlación de interés se describen en verde. La imagen de la derecha muestra la misma disección sin teñir mensaje diapositiva FFPE. El área diseccionada se representa en azul. Un 400 mm 2 consumible poco molino fue utilizado para la disección, el cual está diseñado para la disección transversal de tamaño mediano a grande área de la disección. Amplia zona de disección se describe como menos de 100 mm 2. Tamaños diseñados para este tipo de otras áreas / disección están disponibles. Aunque el informe describe el área anotada como 0 mm 2, esto es inexacto. Cuando eliminamos la diapositiva microdissected de la máquina y mirar físicamente en el área de interés en sí, podemos ver el área correspondiente en la diapositiva que ya no tiene el tejido y por lo tanto ha sido diseccionado. Cabe señalar que los autores son el alquiler del instrumento y este problema se ha solucionado en otro instruments. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| Primate | Infecciosa Estado | Concentración de ARN en ng / l | El ARN total en ng | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | Activo | 48.3 | 724.5 | 1.71 | 1.59 |
| HB12 | Latente | 61.4 | 921 | 1.7 | 1.86 |
| HP41 | Reactivada mediante coinfección con SIV | 22.3 | 334.5 | 1.9 | 2.18 |
Tabla 1. Concentraciones de ARN publicar extracción. La muestra se DNased y la extracción de ARN se realizó utilizando el kit Qiagen RNAeasy FFPE. ARN estafaconcentración se obtuvo utilizando un NanoDrop. También se representan las etapas infectivas PHN. RNA se eluyó en 15 l de agua libre de ARNasa.
| Primate | Infecciosa Estado | concentración de cDNA en ng / l | ADNc total en ng | 260/280 | 260/230 |
| EB23 | Activo | 31.7 | 951 | 2.08 | 2.37 |
| HB12 | Latente | 156.5 | 4695 | 1.94 | 4.4 |
| HP41 | Reactivada mediante coinfección con SIV | 41.7 | 1251 | 2.19 | 3.44 |
Tabla 2. Concentraciones de cDNA publicar amplificación y purificación. Fases infecciosas NHP también se representan. ARN se amplificó utilizando Ovation Sistema FFPE RNA-Seq (parte no. 7150) y la consiguiente cDNA amplificado se purificó utilizando el kit de purificación QIAGEN QIAquick PCR como sugiere Nugen en la página 26 de la guía del usuario del sistema de amplificación. ADNc se eluyó en 30 l de tampón TE.
| Bien | Reportero | Connecticut | Valor Tm |
| 16S 10-1 | Estándar | 12.35138 | 79.4 |
| 16S 10-2 | Estándar | 16.144611 | 79.4 |
| 16S 10-3 | Estándar | 17.911345 | 79.4 |
| 16S 10-4 | Estándar | 21.762596 | 79.4 |
| 16S 10-5 | Estándar | 25.746624 | 79.4 |
| 16S 10-6 | Estándar | 28.505266 | 79.1 |
| HB12 | Desconocido 25.771492 | 77.8 | |
| HP41 | Desconocido | 17.760149 | 78 |
| EB23 | Desconocido | 24.754618 | 78.2 |
| Control negativo | NTC | 33.544422 | 79.7 |
Tabla 3. RT-PCR resultados con respecto a la subunidad ribosómica 16S. Amplificación apropiada observado demostrando así la presencia de Mtb en muestras. El ADN genómico de la cepa CDC1551 Mtb se utilizó como un estándar.
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Discussion
Mesodissection es una técnica que puede aplicarse a la extracción de RNA a partir de diapositivas de las lesiones patológicas causadas por una amplia gama de patógenos. Es una necesidad que el usuario sigue el imagen y se alinea la imagen correctamente. Para lograr esto, el instrumento debe ser calibrado siguiendo las instrucciones en el software de imágenes. Cuando la disección, si la diapositiva y área de interés siendo diseccionado no se alinean, el usuario debe volver a calibrar el instrumento. Otro paso crítico en el proceso de disección es cargar el bit molino de consumible de tal manera que está desprovista de burbujas antes de la disección (paso 5.1). Hemos encontrado que la presencia de burbujas disminuye el rendimiento de la disección. Para corregir este problema, se recomienda impulsar y expresar el émbolo varias veces. El usuario puede practicar este mediante la adición de colorante de alimentos a un búfer de la práctica de visualizar burbujas, tal como se recomienda por el fabricante. Una vez efectiva, el usuario debe entonces proceder con la disección normal. El laer paso crítico es diseccionar la muestra en una dirección hacia la izquierda. Los molinos de la máquina en sentido contrario; Por lo tanto, hemos encontrado que mover la palanca de mando en un movimiento circular en una manera a la izquierda aumenta el rendimiento de tejido como los recortes del borde de ataque más limpiamente que el borde de salida 6. Otra manera de mejorar el rendimiento del tejido es disminuir la velocidad del proceso de disección. Hemos encontrado que la fijación de la velocidad de aspiración y la velocidad del motor en la velocidad más baja durante el ajuste al mismo tiempo la velocidad de fase a "bajo" producir el rendimiento más alto de tejido. Hay dos limitaciones principales de este enfoque microdisección. La primera limitación es que hemos encontrado una disección punto muy difícil debido a la necesidad de impulsar el joystick en círculos en sentido antihorario en el proceso de disección. La segunda limitación es que la cámara en el instrumento genera una imagen que carece el detalle celular de una imagen generada a partir de un microscopio avanzado.
Mtb. La formación de granulomas es una característica de la infección y los resultados de los intentos del ejército para contener el patógeno dentro de una zona confinada de pulmón 5 TB. Por el contrario, se ha propuesto que Mtb ha evolucionado para permitir su persistencia en lesiones granulomatosas 7. Mtb se somete a diferentes tensiones en función de la etapa de la infección. Algunas de estas tensiones incluyen pero no se limitan a estrés redox, pH bajo, daño de la membrana, la hipoxia, falta de nutrición, etc 7-13. A lo largo de las distintas etapas, Mtb todavía puede sobrevivir en una forma latente e incluso reactivar. Esto significa que los diferentes genes se upregulated y downregulated en diferentes fases infecciosas. Por ejemplo, Mtb codifica para más de 200 factores de transcripción 4. Además, se ha demostrado que el equilibrio entre la expresión de diferentes quimiocinas, such como α y β quimiocinas, dentro del granuloma puede ser marcadores importantes de protección 8. Evaluación de la transcriptómica micobacterias en tejido granulomatoso podría reforzar nuestra comprensión de los mecanismos implicados en su formación y mantenimiento, así como los genes que se expresan en cada estado de la infección. Esto nos permitirá evaluar la transcriptómica de micobacterias en varias etapas infectivas de TB, incluyendo la enfermedad activa, latente y reactivarse, así como diversas regiones dentro de la propia granuloma. Además de que nos permite evaluar aún más la transcriptómica micobacterias, el procedimiento anterior también permite la evaluación de la transcriptómica acogida en los mismos estados infecciosos. Por otra parte, este enfoque se puede utilizar para comparar, contrastar y analizar la relación entre anfitrión y bacterias.
Aunque una herramienta importante en la investigación de la tuberculosis, el protocolo antes mencionado se puede aplicar a otros agentes patógenos así. Lo anteriorprotocolo utiliza diapositivas FFPE a partir de muestras pulmonares infectados, pero también puede aplicarse a las lesiones de otros órganos. Se demuestra cómo utilizar el sistema para extraer el ARN, pero en teoría puede ser utilizado para la extracción de ADN y de proteínas de una manera sensible igualmente eficaces y tiempo. FFPE bloques están disponibles en la mayoría de los departamentos de histología de laboratorio; Por lo tanto, la técnica descrita aquí tiene la posibilidad de aumentar exponencialmente el conocimiento obtenido a partir de estas muestras en la actualidad no se utilizan.
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Disclosures
Los autores dan a conocer que no hay intereses financieros en competencia.
Acknowledgments
Los autores desean agradecer a las siguientes NIH premios / sub-premios para el apoyo de esta investigación: R01HL106790, R01HL106790-S1, R01HL106786, R01AI089323, R21AI091457, R21RR026006, P20RR020159, C06RR017563, 8T32OD011124-08, y P51OD011104.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| MeSectr | AvanSci Bio | Mesodissector | |
| 400 nm xScisors | AvanSci Bio | Other sizes available | |
| THOR | AvanSci Bio | Programmable Heater-Shaker | |
| NanoDrop2000 | ThermoScientific | ND-2000 | |
| RNeasy FFPE extraction kit | Qiagen | 73504 | |
| Ovation RNA-Seq FFPE System | Nugen | 7150 | |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 |
References
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Inmunología Número 88 Microdissection mesodissection fijado en formol en parafina,Erratum
Formal Correction: Erratum: A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas
Posted by JoVE Editors on 07/01/2014.
Citeable Link.
The corresponding author was changed for the article, A Novel Microdissection Approach to Recovering Mycobacterium tuberculosis Specific Transcripts from Formalin Fixed Paraffin Embedded Lung Granulomas. The corresponding author was changed from:
Teresa A. Hudock
to:
Deepak Kaushal
