Real-Time Impedans Baserade Cell Analyzer som verktyg att avgränsa Molecular involverade i neurotoxicitet och Neuroprotektion i en neuronal cellinje

Abstract

Många hjärnrelaterade sjukdomar har neuronal celldöd medverka i patofysiologi. Förbättrad in vitro-modeller för att studera nervskyddande eller neurotoxiska effekter av läkemedel och nedströmsvägar involverade skulle hjälpa få insikt i de molekylära mekanismerna bakom neuro / neurotoxicitet och skulle kunna underlätta läkemedelsutveckling. Men många befintliga analyser toxicitet in vitro har stora begränsningar - de flesta bedöma neurotoxicitet och neuroprotektion vid en enda tidpunkt, inte gör det möjligt att observera tidsförloppet och kinetik effekten. Vidare skulle möjligheten att samla in information om nedströms signalvägar som är involverade i neuroskydd i realtid vara av stor betydelse. I det nuvarande protokollet beskriver vi användning av ett realtids impedans baserade cell analysator för att bestämma nervskyddande effekter av serotonin 2A (5-HT _2A) receptoragonister i en neuronal cellinje enligt etikettfria och realtids conditjoner med hjälp av impedans mätningar. Dessutom visar vi att inhibitorer av second messenger banor kan användas för att beskriva molekyler nedströms involverade i neuroskyddande effekt. Vi beskriver också användbarheten av denna teknik för att bestämma om en effekt på cellproliferation bidrar till en observerad neuroprotektiv effekt. Systemet utnyttjar speciella mikroplattor kallade E-Plattor som innehåller alternerande guld mikroelektroduppsättningar på undersidan av brunnarna, som används som cellsensorer. Impedansen avläsning modifieras genom att antalet vidhäftande celler, cellviabilitet, morfologi och vidhäftning. En dimensions parameter som kallas Cell Indexet härrör från de elektriska mätningarna impedans och används för att representera cellstatus. Sammantaget ger realtids impedans-baserade cell analysator för realtid, etikett-fri bedömning av neuroprotektion och neurotoxicitet, och utvärdering av andra budbärare vägar engagemang, bidrar till merdetaljerad och hög genomströmning bedömning av potentiella nervskyddande föreningar in vitro, för val av terapeutiska kandidater.

Introduction

Neuronal celldöd spelar en avgörande roll i patofysiologin för många hjärnrelaterade sjukdomar ^1. Tillgången på tillförlitlig och hög genomströmning in vitro toxicitetsanalyser är avgörande för att få bättre insikt i de mekanismer för neurotoxicitet och att hjälpa till att välja nervskyddande molekyler som terapeutiska kandidater i läkemedelsutveckling ^2. Men det finns många begränsningar för att mest använda in vitro neuro assays.They bedöma neurotoxicitet / neuroprotektion vid en enda tidspunkten inte tillåta kinetisk upplösning; ofta använder etikett eller sond som kan störa signalvägar och begränsa ytterligare studier i samma cell population, och är ofta arbetskrävande, och i många fall inte ger mekanistiska insikter. I föreliggande studie visar vi användbarheten av ett realtids impedans-baserade cell analysator för att bestämma neurotoxicitet och neuroprotektion i en neuronal cellinje i realtid och under etikett-friförhållanden och att ge insikt i mekanismerna nedströms genom analys av andra budbärare involverade i effekten.

Tidigare studier har bekräftat giltigheten av realtidscell analysator för att fastställa cytotoxicitet och effekter på celltillväxt i cellinjer jämfört med standardtekniker ^3,4,5,6. Till exempel var en god korrelation observerats mellan avläsning av standard cellviabiliteten WST-1-analysen och Cell Index värden vid flera tidpunkter under basala spridande förhållanden och efter två olika giftiga paradigm i HeLa-celler ^3. I A549 och MDA-MB-231 celler spridning och cytotoxicitet provocerade med mikrotubuli stabiliserings paklitaxel visade mycket likartade värden när bedöms av Cell Index mätningar och standardmässigt används sulforodamin B (SRB) analys ^4. I neuronal cellinje av odödliggjorda hippocampusneuroner HT-22 Cellindex mätningar har validerats för sin förmåga to detektera cellproliferation, glutamat cytotoxicitet och cytoprotektion mot den allmänt använda 3-(4,5-dimetyltiazol-2-yl) -2,5-difenyltetrazolium-bromid (MTT)-analys ^5. I samma studie MTT analysresultat och Cell Index mätningar korrelerade också väl mäta neuronala progenitorceller spridning, cytotoxicitet efter tillväxtfaktorer berövande och räddning av cytotoxicitet av den pan-caspase hämmare QVD ^5. Cytotoxicitet induceras i NIH 3T3-celler från Vandetanib (vascular endothelial growth factor receptor och epidermal tillväxtfaktorreceptor-hämmare) visade liknande resultat som mäts med Cell Index värden eller upptag av neutralrött analys ^6.

Vi har nyligen använt realtidscellanalyssystem för att bedöma neuroprotektiva effekterna av serotonin 2A _(5-HT2A) receptoragonist (±) -2,5-dimetoxi-4-iodoamphetamine klorid (DOI) i en neuronal cellinje ( SK-N-SH-celler) och screenas för medverkan av second messenger vägar genom att övervaka effekten av deras kemiska inhibition på den observerade neuro ^7. Intressant, har _{5-HT2A-receptorn} både hallucinogena och nonhallucinogenic agonister (som DOI och lisurid, respektive), som kan aktivera både gemensamma och skilda andra budbärare vägar ^8.

Fördelarna med den presenterade tekniken är att den gör det möjligt att samla in information i realtid om cellöverlevnad under dagarna, för att beskriva andra messenger vägar involverade, för att bedöma eventuella bidrag spridningseffekterna till neuroprotektion, och för att välja en optimal tid för ytterligare slutpunkts studier på samma cellpopulation. Ett schematiskt diagram av arbetsflödet i det nuvarande protokollet presenteras i Figur 1.

Protocol

1 Förberedelser

1. Placera realtidscell analysatorn station i en vävnadskultur inkubator inställd på 37 ° C och med 5% _CO2. Utför alla cellodlings hantering och farmakologiska behandlingar i en vävnadskultur huva under sterila betingelser.
2. OBS: Neuronal cellinjer som kräver olika temperaturinställningar jämfört med standardvillkor för kultur, bör justeras i enlighet därmed. För svagt vidhäftande cellinjer, använd beläggningsmedel för att underlätta samspelet mellan celler med guldmikroelektroder i botten av brunnarna i E-Plate 96.
3. Bered 1,000X stamlösningar av de farmakologiska föreningarna för cellodling behandling (neuroprotektiva medel eller second messenger vägar inhibitorer i lämpligt lösningsmedel - dimetylsulfoxid eller sterilt vatten) och lagra dem vid -20 ° C. Använd lösningsmedel som fordonet i följande behandlingar.
4. Kultur human neuroblastom SK-N-SH-celler i DMEM / F12-medium kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) (spridningsmedium) i cellodlingsflaskor med 175 cm ² yta till en densitet av ca 75%. Håll cellpassage nummer inom ett område (ca 10 passager) för att fastställa överensstämmelse mellan experiment när det gäller graden av celltillväxt och svar på cytotoxicitet. Lägre passagenummer föredras.
5. Tvätta den vidhäftande SK-N-SH cellagret med PBS och trypsinize med 0,05% trypsin-EDTA-lösning under 5 min vid 37 C. Centrifugera cellerna vid 170 x g under 5 min för att avlägsna trypsin. Resuspendera cellerna i 10 ml spridningsmedium. Räkna celler med Scepter cellräknare och justera cellnummer till 300.000 celler / ml genom späd celler med spridningsmedium.

2. Plätering och proliferation av SK-N-SH-celler

1. Tillsätt 100 l spridning medium till varje brunn på E-Plate 96 och låt den stå 30 minuter i vävnadsodling huva vid RT till jämvikt. Sätt i E-Plate 96 i realtid cell analysator station i _CO2 inkubator vid 37 ° C.
2. Starta realtidscell analysator programvara. På layoutsidan väljer brunnarna ingår i experimentet och ange i redigeringsrutorna information om celltyp, mobilnummer, namn och koncentrationer av kemiska föreningar som används för cellbehandling.
   OBS: I detta protokoll minst fyra replikat rekommenderas för varje behandling.
3. På Schedule mjukvarusidan bestämmer "steg" som ingår i försöket, genom att välja antal svep som mäter cell Index och mellan svepen för varje steg. Eftersom steg 1 är förutbestämd för bakgrundsmätning, välj "Lägg till ett steg" och ställ in steg 2 för att mäta Cell Index var 15 min till 96 timmar.
   OBS: För behandlingar, där effekter med snabb kinetik förväntas, ställ svep med kortare intervaller.
4. Klicka på Start för att initiera automatiskt förutbestämda steg 1och mät bakgrunds impedans medierna. Detta värde subtraheras automatiskt av mjukvaran vid varje datapunkt när cellerna tillsätts till brunnarna.
5. Använd den tidigare beredda i steg 1,5) cellsuspension på 300.000 celler / ml i spridningsmedium. 30.000 celler / brunn för celltoxicitet / neuroprotektion studier och 15.000 celler / brunn för cellproliferationsstudier. Ta ut E-Plate och tillsätt 100 l cellsuspension per bra för toxicitet cell / neuroprotektion studier och tillsätt 50 l cellsuspension och 50 ^ proliferation mediet per brunn för cellproliferationsstudier. Antalet celler utstrukna per brunn måste optimeras för varje cellinje empiriskt.
6. Snurra försiktigt på E-Plate 96 för ännu plätering av cellerna. Låt E-Plate 96 i 30 minuter i vävnadsodling huva vid RT för att låta cellerna bosätta jämnt till botten av brunnarna.
7. Sätt i E-Plate 96 i realtid cell analysator station och börja steg 2 på schemat pålder. Övervaka Cell Indexvärden hela experimentet genom att visa cell kurvorna på Rita och få rå Cell Index data på Cell Index av programvaran.

3 serumdeprivation

1. 24 h efter plätering av cellerna, pausa experimentet, och ta bort e-Plate 96 från realtidscell analysator station. Späd second messenger-inhibitorer från 1,000X lagren med DMEM / F12 serumfritt medium - till 200 gånger den slutliga koncentrationen. Behandla celler med en il hämmare av andra budbärare vägar som skall testas för sin inblandning i neurotoxicitet / neuro 30 min innan behandling cytotoxicitet, att hämma respektive vägar. Returnera E-Plate 96 till stationen och återuppta experimentella mätningar Cell Index.
2. Efter 30 min pausa experimentet igen. Ta försiktigt bort spridningsmediet helt från E-Plate 96 brunnar med en pipett (eller flerkanalig pipett), se till att inte störa den vidhäftande cellagretgenom att styra kanten av pipettspetsen till hörnet av brunnen. Lägg 200 | il / brunn av serumfritt DMEM / F12-medium (serumbrist-medium). Säkerställa snabbt utbyte av cellodlingsmedium för att minimera mekanisk omröring av cellerna.
3. Späd föreningar som skall testas för att de nervskyddande effekter från 1,000X lager med serumfritt DMEM / F12 medium till 200 × slutkoncentrationen. Tillsätt 1 l föreningar som skall testas för att de nervskyddande effekter och en il hämmare av andra budbärare vägar i de enskilda brunnarna enligt försöksplanen.
4. I celler för spridningsstudier ändrar inte medium. Späd föreningar som skall testas från 1,000X lager till 200 × den slutliga koncentrationen i spridningsmedium, behandla med 1 fil per brunn och fortsätter att kultur i spridningsmedium.
5. Återuppta försöket att fortsätta med Cell Index mätningar var 15 min för 96 timmar som tidigare.

4 Data ANALYS

1. För neurotoxicitet / neuroprotektion uppgifter normalisera Cell index till den sista tidpunkten innan farmakologisk behandling eller medelförändring för att minska variationen mellan experiment genom att välja "normaliserad Cell Index" och "normalisera Time" på Plot sidan.
2. Markera brunnarna på Plot sida för de experimentella förhållanden av intresse och klicka på "Lägg till" för att rita de normaliserade Cell Index kurvor. Beakta kinetiken för den neurotoxiska / neuroprotektiv verkan, eller av andra budbärare hämning som normaliserade Cellindex kurvor som en funktion av tiden.
3. Observera Cell Index kurvorna för de testade läkemedelsbehandlingar i spridningsmediet som en funktion av tid för att bedöma om en effekt på spridningen är involverad i nervskyddande / neurotoxiska effekt.
4. Exportera den experimentella information för alla Cell Index tidpunkter från Cell Index programvara i en Excel-fil för att initiera statistisk utvärdering av resultaten
   
5. För statistisk analys av skillnader i Cell indexvärden under olika behandlingsförhållanden vid specifika tidpunkter väljer Cell Index värden vid respektive tidpunkter från den exporterade Excel-fil. Analysera Cellindex-värdena för de valda tidpunkter med en-vägs eller tvåvägs variansanalys (ANOVA) följt av en post-hoc-test med användning av statistisk programvara.

Representative Results

Serum deprivation leder till en minskning i Cell indexvärden, som kan övervakas kontinuerligt med realtidscell analysator

Neurotoxiska stimuli till cellerna leder till en minskning av cellindexvärden, som kan övervakas i realtid med den presenterade tekniken och dynamiken av som är beroende av den specifika neurotoxiska stimulus och celltypen studeras. Figur 2 visar ökningen i Cell Index när SK-N-SH-celler odlas i spridningsmediet tills den når en platå (grön linje) och minskningen i cell Index följt av en stabilisering på de nya lägre nivåer efter byte av cellerna till serum deprivation medium (röd linje). Denna nedgång kan utgöra en förändring i cellulär adhesion grund av utsättning av serumet.

Nervskyddande effekter av läkemedelsbehandling kan övervakas kontinuerligt med realtidscell analysator

"> Den nervskyddande effekten av föreningar tillsatta före (förbehandling), samtidigt (samtidig behandling) eller efter neurotoxisk stimulans (vilket tyder på cellåtervinning) kan också följas kontinuerligt med realtidscell analysator, vilket ger information om . hastigheten och varaktigheten av den neuroprotektiva effekten Figur 3 visar representativa resultat av dynamiken i neuroprotektion av två _{5-HT2A-agonister} - 5 uM DOI (Figur 3A) och 20 | iM lisurid (Figur 3B) tillsatt vid tidpunkten för omkoppling celler in serumdeprivation medium.

Realtids cell analysator medger att skilja mellan effekter på cellöverlevnad och cellproliferation

En viktig fråga i neuroprotektion studier i neuronala cellinjer är om en effekt på celltillväxt bidrar till den observerade föreningen effekt på cellöverlevnad. Med realtidscell analYzer effekten på proliferation kan testas på samma e-Plate 96 bedöma neurotoxicitet. Figur 4 visar den bristande effekten av 5 iM DOI behandling på SK-N-SH-celler spridning, vilket antyder en effekt på proliferation bidrar inte till den observerade neuroskyddande effekt.

Realtids cell analysator kan för att bestämma vilka andra budbärarsystem vägar är involverade i nervskyddande / neurotoxiska effekter

Receptoraktivering initierar en kaskad av sekundära budbärare effekter. Det nuvarande protokollet medger att screena för medverkan av ett antal andra budbärare i en nervskyddande / neurotoxisk effekt i realtid genom förbehandling med sina hämmare. Eftersom effekten av andra budbärare hämmare på cellöverlevnad kan uttalas, och är i många fall inte linjär med tiden, efter dess kinetik är mycket informativ. Figur 5 visar effekten av 10 ^ M phosphatidylinositol 3-kinas (PI3-K) inhibitor LY294002 på cellöverlevnad och DOI neuroprotektion i serum-berövat SK-N-SH-celler. I den presenterade graf, 10 | iM LY294002 förhindrade den neuroprotektiva effekten av DOI i serumbrist, men hade också några toxiska effekten av sina egna.

Relevanta andra budbärare vägar och inhibitor koncentrationer för varje testad förening kan bestämmas genom litteratursökning. Koncentrationer lämplighet andra budbärare hämmare har skall kontrolleras och vid behov optimeras experimentellt. Målet med optimeringen är att välja en koncentration som har en minimal effekt på cell Index värden av sig själv, samtidigt hämma effektivt respektive andra budbärare. Som ett exempel, vissa second messenger vägar inhibitorer, som kan vara relevant för _{5-HT2A-receptorn,} presenteras i tabell 1. Dessa inhibitorer har tidigare använts för att bedöma nedströms mål involverade i serotonerg ökning av extracellular signal-reglerat kinas fosforylering ^9. Vi har visat sin användbarhet för att bedöma nedströms involverade i neuro med _{5-HT2A-receptoragonister} efter bekräftar och i vissa fall optimera deras koncentrationer för vår experimentella paradigm ^7.

Figur 1 Schematisk beskrivning av arbetsflödet som presenteras i det nuvarande protokollet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 2 Effekt av serumbrist på cell Index. Serum deprivation (röd linje) inducerar en snabb minskning av Cell Index, jämfört med en gradvis ökning av Cell Index värden i spridningsmedium (grön linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3 Effekt av _{5-HT2A-agonister} på Cell Index efter serumdeprivation. Behandling med cellskyddande läkemedel (i detta experiment _{5-HT2A-agonister} DOI (5 M) (A) (magentafärgade linjen) och lisurid (20 M) (B ) (mörk magentafärgad linje) delvis åter Cell Index värden minskade med serumdeprivation (röd linje). Klickahär för att se en större version av denna siffra.

Figur 4 Cellindexvärden under loppet av celltillväxt. Behandling med läkemedel i spridningsmediet (i det aktuella experimentet 5 iM DOI) (magenta linje) gör det möjligt att bedöma effekten på proliferation jämfört med fordonsbehandling (grön linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 5. andra budbärare hämmare kan påverka cellöverlevnad på egen hand och kan användas för att skärmen för effekten av andra budbärare vägar på observed neuroprotektion. I detta experiment cellerna utsattes för serumdeprivation behandlas med fordon (röd linje), 1 ^ M DOI (magentafärgad linje), förbehandlats med 10 ^ M PI3-K-hämmare LY294002 och behandlades med 1 ^ M DOI (blå linje) eller förbehandlade med 10 ^ M LY294002 och behandlades med bil (svart linje). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Tabell 1: Exempel på andra budbärare hämmare, som kan vara relevanta för _{5-HT2A-receptor} nedströms vägar och deras koncentrationer som används av oss i realtid cell analysator experiment.

Discussion

Den nuvarande protokollet visar nyttan av en realtidscell analysator för att kontinuerligt och under etikettfria förhållanden bedöma nervskyddande / neurotoxiska effekter av föreningar i neuronala cellinjer och få inblick i den andra budbärare involverade i effekten.

Även om realtidscell analysatorn verktyg för att studera cytotoxicitet och effekter av droger på celltillväxt är allmänt erkänt, har endast ett fåtal studier som använt den i neuronala relaterade celltyper. Vi har tidigare visat användbarheten av realtidscellanalysatom för att övervaka neuroprotektion av en _{5-HT2A-receptoragonist} i human neuroblastoma SK-N-SH-celler, medan Galante et al. Har visat att den kan användas för att bedöma neurotoxiciteten hos beta-amyloid peptider i mänskligt neuroblastom SH-SY5Y celler ^7,10. En ny studie har föreslagit att även realtidscell analysator tillförlitligt celldelning och celldöd i eneuronal cellinjen och neuronala föregångarceller, dess precision vid bedömningen celldöd i primära neuroner beroende på svårighetsgraden av den insult ^5. Viktigt är växelströmmen som används för realtidscellanalyssystem av mycket låg omfattning, genererar mikroampere strömmar. Dessa strömmar är väl under tröskelpotentialen i exciterbara celler som nervceller. Realtidscell analysator systemet bygger på impedansmätningar från bottenytan av E-Plate 96 brunnar, alltså graden av cell vidhäftning är av avgörande betydelse. Det är möjligt att ytterligare optimera beläggning av E-Plate brunnar med extracellulära matrixproteiner för bättre följsamhet kan förbättra resultat som erhållits med primära neuroner.

Den nuvarande manuskriptet visar ett nytt tillvägagångssätt för att använda realtidscellanalyssystem att avgränsa second messenger vägar involverade i neuroprotektion. Vår protokoll förlitar sig på kemiska hämning av andra messengrar hypotetiska vara inblandade i verkan av ett neuroskyddande medel. Tabell 1 visar några vanliga second messenger vägar hämmare, som kan vara relevanta för _{5-HT2A-receptorn} som ett exempel, och deras koncentrationer lämpliga för den presenterade experimentella paradigm. Denna experimentella designen möjliggör snabb screening av potentiellt relevanta sekundära budbärare vägar, för att välja mål nedströms för mer detaljerade studier genom kompletterande strategier.

En viktig fördel med realtidscell Analysatorn är också förmågan att bedöma om en effekt på spridningen är en del av en observerad neuroskyddande effekt. Med hjälp av neuronala cellinjer i stället för primära nervceller i toxicitetsanalyser ger vissa fördelar, som lägre kostnad, enkel åtkomst och inget behov av djurförsök. Men på grund av det faktum att neuronala cellinjer i motsats till primära neuroner föröka behöver potentiella inverkan på spridning som skall regleras ineuro analyser. Möjligheten realtidscell analysator erbjuder sig att utföra denna kontroll i samma experimentella E-plattan 96, underlättar experimentell design.

Flera tekniska parametrar måste beaktas i experiment med realtidscell analysator. Antalet celler som skall pläteras per brunn bör bestämmas empiriskt genom titrering experiment för varje testad celltyp. Cytotoxicitet och spridning behandling hela började efter 24 h om inledande av cellodling, för att tillåta fullständig vidhäftning av cellerna. Optimala resultat i cytotoxicitet experiment börjar när cellerna har nått 65-70% sammanflödet erhölls i det nuvarande protokollet. För proliferationsexperiment lägre cellsammanflöde är föredraget (20-30%) för att följa effekten av ett läkemedel på en spridningskurva.

I det nuvarande protokollet serumdeprivation neuro paradigm presenteras på grund av dess robusthet, till användarvänlighet och användbarhet närmatrofisk deprivation medierad neuronal död, vilket är viktigt under utvecklingen, akut hjärnan eller nervtrauma, och neurodegenerering ^11. Emellertid kan ett brett spektrum av neuro paradigmer användas med realtidscellanalyssystem. Här sam-behandling med ett cellskyddande medel vid tidpunkten för cytotoxicitet presenteras. Däremot kan förbehandling eller behandling efter den giftiga händelsen (bedömning av cellåtervinning) också användas beroende på vilka föreningar som testas.

Sammantaget pekar det nuvarande protokollet nyttan av ett realtidscellanalyssystem för att utvärdera neurotoxicitet och neuro i neuronala cellinjer kontinuerligt och etikett-fri och att få inblick i nedströms involverade i dessa effekter.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
xCELLigence  RTCA SP system bundle	ACEA Biosciences	No: 00380601030	Consists of RTCA Analyzer, RTCA SP Station and RTCA Control Unit
E-plate 96	ACEA Biosciences	No: 05232368001	For culturing the cells, inserted in the RTCA SP Station
SK-N-SH cells	ATCC (in partnership with LGC Standards)	HTB-11	Can be replaced by another adherent neuronal cell line of interest
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D8437	Cell culture medium
Fetal bovine serum	Life Technologies	16140-063	Supplements proliferation, but not serum deprivation medium
Tissue culture flask T175	Sarstedt	83.1812.302	For culturing cells, which will be later plated on the E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054	For trypsinization of cells cultured in tissue culture flasks
Scepter 2.0 cell counter	Merck Millipore	PHCC20060	Automated cell counter
Phosphate-buffered saline	Life Technologies	10010-015	For washing the cells
(±)-DOI hydrochloride	Sigma-Aldrich	D101	5-HT2A agonist for cell culture treatment
LY-294002 hydrochloride	Sigma-Aldrich	L9908	PI3-K inhibitor for cell culture treatment
Lisuride maleate	Tocris Bioscience	4052	Compound with 5-HT2A agonistic activity for cell culture treatment
Dimethyl sulfoxide	Sigma-Aldrich	D4540	For dissolving LY-294002 and lisuride maleate