Summary
שמרים, שמר האפייה, כבר אורגניזם מודל מפתח כדי לזהות וללמוד גנים המסדירים את קיום החיים ופונקציות של מערכת endosomal. כאן אנו מציגים פרוטוקול מפורט לתיוג הספציפי של תאי endosomal ללימודי ultrastructural.
Abstract
Endosomes אחד של הקרום הגדול מיון מחסומים בתאי אוקריוטים והם מווסתים מחזור או הרס של חלבונים בעיקר מקרום הפלזמה וGolgi. כתוצאה מכך מערכת endosomal ממלאת תפקיד מרכזי בשמירה על הומיאוסטאזיס, ומוטציות בגנים השייכים לרשת זו של האברונים מחוברים על ידי תחבורת ועי, לגרום לפתולוגיות חמורות, כולל סרטן והפרעות הנוירוביולוגי. לכן זה רלוונטי ראש כדי להבין את המנגנונים העומדים בבסיס קיום החיים והארגון של מערכת endosomal. שמרי Saccharomyces cerevisiae היה מרכזי במשימה זו. לתייג באופן ספציפי ולנתח ברמת ultrastructural מערכת endosomal של אורגניזם מודל זה, אנו מציגים כאן פרוטוקול מפורט לספיגת nanogold הטעונה חיובי על ידי spheroplasts אחריו ההדמיה של חלקיקים אלה באמצעות תגובת שיפור כסף. שיטה זו מדי יקר היא גםl לבחינה מורפולוגית של מוטציות עם מומים בסחר endosomal. יתר על כן, זה לא ישים רק לבחינות ultrastructural אבל זה גם יכול להיות משולב עם labelings immunogold לחקירות לוקליזציה חלבון.
Introduction
מערכת endosomal היא מנגנון קרום גדול שמיון משחק תפקידים סלולריים חיוניים רבים, כולל סחר בקולטנים מיון אנזים lysosomal והמחזור של קרום פלזמה (PM) קולטניים 1,2. Endosomes מחולקת בשלושה תאים שונים, כלומר. endosomes המוקדמת (EE), endosomes המאוחרת (LE) וendosomes המיחזור. סיווג זה מבוסס על המשך הזמן שלוקח לחומר endocytosed להגיע אליהם, על חלבוני סמן ספציפיים ועל המורפולוגיה שלהם. ממברנות, כלומר bilayers חלבונים ושומנים בדם, הפנימו מPM יכולים להיות מועברות לlysosomes באמצעות endosomes לשפלה או להיות ממוחזרות בחזרה. ממברנות גם מועברים לendosomes מGolgi ובאופן דומה, או להמשיך lysosomes או להאסף בחזרה לGolgi. יתר על כן, ניתן למיין חלבונים לתוך שלפוחית luminal ניצנים פנימה מן קרום endosomal מגביל, תהליך שמוביל להיווצרות שלקטגוריית משנה של LE, גופי multivesicular.
מערכת endosomal השמרים היא יחסית פחות מורכב מזו של תאי אוקריוטים גבוהים. endosomes שמרים מחולקות לEE ו LE. בניגוד לתאי יונקים הם אינם מכילים endosomes מחזור אלא גם אברונים הקשורות לליזוזום רקמות ספציפיות. כתוצאה מכך שיש להם רשת פחות מורכבת של נתיבי סחר endosomal 3,4. לכן שמרים ייצג ועדיין מייצג את מערכת ניסיונית יתרון ללמוד חלק מתנועת הממברנה הבסיסית העקרונות במערכת endosomal. יתרון זה מודגש על ידי העובדה כי גנים רבים המעורבים במסלולי endosomal היו מבודדים בתחילה עם מסכי גנטיים בשמרים 5. בעוד מערכת endosomal השמרים בסוג בר ותאים שעברו מוטציה, נחקרה בהרחבה שימוש בגישות מיקרוסקופית ביוכימי וקרינה, את חקירתה ברמת ultrastructural כבר רקמינימאלי. ניתוחים מורפולוגיים הם רלוונטיים במיוחד בשמרים, כי רוב האברונים endosomal מזוהים כמו מבני פיסוק על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי, אשר הופכים קשה זיהוי חד משמעי שלהם 6. למרבה הצער רק מספר מוגבל של נסיובי הכרת סמני חלבון השמרים endosomal הוא עובד באימונו אלקטרון מיקרוסקופיה הכנות (IEM) 7-10. לחלבונים מסוימים, בעיה זו כבר לעקוף על ידי התיוג אנדוגני של הגן של עניין והשימוש בנוגדן הכרת התג לזהות אותו 7,11,12. לעתים קרובות, לעומת זאת, חלבונים הם לגילוי על ידי IEM בגלל רמות הביטוי הנמוכה שלהם. ביטוי היתר שלהם הוא לא פתרון, כי גישה זו יכולה לגרום לאי - מגוירת ו / או שינויים במורפולוגיה / פונקציות אברון. כך התיוג של תאי endocytic עם בדיקה לזיהוי על ידי EM במיקרוסקופ אלקטרונים הוא אפשרות יעילה. זה פתרון אופטימלי במיוחד אם יחסי הציבורOBE הוא להיכנס למסלול endocytic באופן תלוי בזמן, המאפשר לדעת מתי זה יהיה סימן אברון ספציפי 6.
הספיגה של nanogold הטעון חיובי על ידי spheroplasts שמרים (כלומר. שמרים שבו תא הקיר הוסר אנזימים) בהצלחה נעשתה שימוש כדי לזהות את שמרי endosomal מלתחות 10. חלקיקים אלה מאוד להיקשר לשומנים טעונים השלילי המרכיבים את הקרומים הביולוגיים. כך מקורבי nanogold הטעונים חיובי עם ראש הממשלה, חודרים את התא על ידי אנדוציטוזה ועוברים דרך EE וLE לפני שהגיע לvacuole. חלקיקי זהב הקטנים אלה, עם זאת, אין לי גודל מתאים כדי להיראות על ידי EM. כדי להבהיר להם גלויים, הגודל שלהם יכול להיות מוגדל על ידי תגובות כימיות שיובילו לתצהיר של כסף או זהב סביב חללית זהב 13-15. פיתחנו ויישמו בהצלחה גישת IEM מבוססים על שיטת Tokuyasu לבצע subcellularלוקליזציה לומדת 8,16. שיטה זו מאפשרת ביצוע תיוג immunogold על שמרי הכנות עם רזולוציה מצוינת של המורפולוגיה 8,17-24. יש לנו גם הקימו הליך שילוב פרוטוקול IEM זה עם תיוג nanogold של מערכת השמרים endosomal מלתחות 6. שימוש בגישה זו יש לי מורפולוגית מאופיינת subclasses שונה של endosomes וultrastructurally בדקה מוטנטים עם סחר endosomal פגם 6,25. יתר על כן, אנו מראים כי תיוג nanogold זה יכול להיות משולב עם labelings immunogold מתן האפשרות לחקור את ההפצה של חלבון של עניין באוכלוסיות endosome השונות. כאן אנו מציגים כיצד התיוג של מערכת השמרים endosomal עם nanogold מטען החשמלי חיובי מבוצע כמעט.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Spheroplast הכנה
- דגירה הלילה בשעה השמרים 30 מעלות צלזיוס ב10 מיליליטר של המדיום המתאים נקבע על ידי העיצוב של הניסוי.
- היום אחרי, למדוד את הצפיפות האופטית של התרבות ב 600 ננומטר (OD 600) באמצעות פוטומטר, לדלל תאים באותו מדיום תרבות 600 OD של 0.2-0.4 ולגדל אותם לשלב גידול מעריכי, אלא אם כן את העיצוב של ניסוי דורש תנאים שונים. תאים נמצאים בשלב מעריכי כאשר התרבות יש OD 600 של 1-2.
- לאסוף 10 OD 600 שווה של תאים על ידי צנטריפוגה ב3,500 XG במשך 5 דקות בצינור 50 מיליליטר. לאחר צנטריפוגה, לבטל את supernatant.
- Resuspend התא גלולה ב 5 מיליליטר של 100 צינורות מ"מ (pH 9.6), 10 dithiothreitol מ"מ וטופחו ב30 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
- לאסוף שוב את התאים על ידי צנטריפוגה ב3,500 XG במשך 5 דקות. בטל supernatant.
- Resuspend התאים in 5 מיליליטר של מדיום (שנקבע על ידי העיצוב של הניסוי) המכיל 1 M סורביטול ו5 מ"ג של אנזים ממס, ודגירה את התערובת על 30 ° C עם הרעד עדין למשך 30 דקות.
- צנטריפוגה ההשעיה תא XG 300 5 דקות כדי לאסוף את החלק יחסי גלולה, אשר תואם את spheroplasts. בטל supernatant.
- Resuspend spheroplasts ב960 μl של תקשורת קרה כקרח (נקבע בינוני על ידי העיצוב של הניסוי) המכיל סורביטול 1 M ולהעביר את התערובת לקרה כקרח 2 מיליליטר צינור microcentrifuge.
2. Nanogold ספיגה
- בעזרת פיפטה, לערבב בעדינות spheroplast עם 4 nmol של חלקיקים בעלי מטען חשמלי חיוביים nanogold resuspended ב40 μl מים. הנפח הסופי של התערובת צריך להיות של 1 מיליליטר.
- מניחים את ההשעיה התא שהושגה על קרח במשך 15 דקות.
- מעביר את ההשעיה בטמפרטורת חדר והדגירה אותו לזמן הנדרש כדי לאפשר הפנמת nanogold באמצעות דוארndocytosis.
הערה: ספיגת 5 דקות בעיקר תוביל לתיוג של שלפוחית endocytic ומדורי endosomal מוקדם, תוך ספיגת 15 דקות תאפשר לסמן את מערכת כולה endosomal (מוקדם וendosomes המאוחרת). פעמים דגירה ארוכות יותר (יותר מ 30 דקות) גם תאפשר לתייג vacuole.
הערה: לא ניתן לבצע ניסויי תיוג Pulse-מרדף עם שיטה זו. לכן, כאשר התיוג לניתוח של LE, nanogold יהיה נמצא גם באתר ראש הממשלה וinEE.
3. קיבוע וחתך
- לעצור את ספיגת nanogold על ידי הוספת 1 מיליליטר של מקבע כפול כוח [paraformaldehyde 4% (PFA), glutaraldehyde 0.4% (GA) במאגר M 0.1 PHEM (20 צינורות מ"מ, 50 HEPES מ"מ, pH 6.9, 20 מ"מ EGTA, 4 מ"מ MgCl 2)] המכיל סורביטול M 1 עד ההשעיה התא. שמר את הצינור בטמפרטורת חדר.
- בעדינות להפוך ידני את צינורות micocentrifuge מספר פעמים במהלך 30 דקות (זה יאפשר לשמור spheroplasts בהשעיה) ואז צנטריפוגות אותו פעמיים ב1,700 XG במשך 25 שניות.
- החלף את מקבע על ידי השלכת supernatant ועל ידי הוספת 1 מיליליטר של מקבע כוח סטנדרטי טרי (2% PFA, 0.2% GA במאגר M 0.1 PHEM) מכיל 1 סורביטול M ו דגירה עבור 2 שעות בטמפרטורת חדר על גלגל מסתובב באיטיות.
- לעבד את התאים לcryo-חתך כפי שתואר לעיל 6. הערה: לקבלת נהלי שיפור ספיגת nanogold וכסף, הטיפול בחומצה התקופתית שתוארה בפרוטוקול שצוין לא שיש לבצע. הטיפול בחומצה התקופתית הוא permeabilize דופן תא 26 טוב יותר אבל המבנה הזה כבר בוטל בדור של spheroplasts.
- חותכים 50 cryosections הדק ננומטר ב-C ° -120 עם סכין יהלום יבש באמצעות ultramicrotome UCT כפי שתואר בעבר 8 ומניח אותם על פחמן Formvar המצופה 50 משתלב רשתות ניקל.
4. כסף שיפור לNanogold החלקיקים visualization
הערה: ההליך להכנת תערובות התגובה הוא בעצם אחד שצוין על ידי היצרן. עיבודים מעשיים באמצעות פרוטוקול זה, הופך את הליך שיפור הכסף יעיל ואמין על cryosections.
- הסר את ערכת שיפור כסף מהמקפיא ולהפשיר אותו ב37 מעלות צלזיוס חממה או אמבט מים. כשהפשיר, הנח את הערכה בחממה 24 ° C להציב לתוך חדר חשוך עד לשימוש (ראה 4.7).
- מניחים את צלחת החימום בחדר החשוך ולחמם אותו לטמפרטורה הסופית של 24 ° C.
- מכסה את החלק העליון של צלחת חימום עם מגן פני השטח, צד מבריק, ולאבטח אותו עם קלטת.
- הנח את Parafilm על Benchkote ולסמן את הקצוות עם טוש שחור כדי להיות מסוגל לראות את קצות Parafilm בחושך.
- קלטת מדחום בחלק העליון של Benchkote לנטר את הטמפרטורה של פלטת החימום. בהדרגה להתאים את הטמפרטורה אם לא 24 ° C.
- Plaלסה"נ צינור 50 מיליליטר עם מים מזוקקים כפולים וערכת שיפור כסף בפנים.
- למלא את צלחות פטרי קטנות עם מים מזוקקים פעמיים, חימם מראש על 37 ° C. הנח את הרשתות במים, הדגימה צד למטה, ל30 דקות.
- חזור על פעולה עוד פעם אחת 4.7 שלב זה.
- העבר את הרשתות בקופסא האחסון ולהביא אותם לחדר החשוך.
- יש לשטוף את הרשתות שוב על ידי עובר אותם (עם צד הדגימה למטה) על כמה טיפות של מים מזוקקים פעמיים ב24 ° C מונחות על Parafilm שתוקן על צלחת החימום.
- ודא כי 9 טיפות מים נוספות מזוקקים כפולות מוכנות בParafilm, לשטיפה לאחר תגובת שיפור כסף.
- כבה את האור ולוודא שכל האורות כבויים. כבה את האור האדום על.
- קח את פתרונות A ו-B של ערכת שיפור כסף מן החממה 24 מעלות צלזיוס.
- שים 6 טיפות הראשונות של הפתרון ולאחר מכן 6 טיפות של תמיסת B ב1.5 מ 'צינור l microcentrifuge, ולערבב היטב עם זכוכית פיפטה פסטר הימנעות לעשות בועות. הפתרון הוא די עבה ויש לו להיות מעורב באופן ידני עם טפטפת לפני סוף סוף vortexing את זה בקצרה.
- שים את פתרונות A ו-B בחזרה בחממת 24 ° C ולהוציא את פתרון C.
- הוסף 6 טיפות של תמיסת C ל/ B התערובת. אז לערבב שוב ראשון עם פיפטה פסטר ולאחר מכן על ידי vortexing, להימנע בועות.
- השתמש באופן מיידי את התערובת הסופית על ידי הצבת טיפות (~ 20 μl / ירידה) על Parafilm.
- עם פינצטה נקייה, אנטי מגנטית, הנח את הרשתות על התערובת (לדוגמא., תגובת כסף שיפור) במשך 6 עד 15 דקות בהתאם לשיפור (כלומר. הגודל של חלקיקי זהב) ביקש להתקבל.
- הסר את הרשתות מהתערובת ולהעביר אותם בחלק העליון של המים מזוקקים פעמיים טיפות ב24 מעלות צלזיוס במשך שוטף. ראשית, להשתמש במהירות רצף טיפות 6 ולאחר מכן 3 טיפות עם 7 דקות זמן דגירה לכל טיפה, לפני שמפנה את האורות הדולקים.
- המשך לשלב הבא, בין אם תיוג חיסוני זהב או מכתים קרום 27 כדי להמחיש את התוצאה לחקירת EM.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
על פי הפרוטוקול שהוצג, את המורפולוגיה של מערכת השמרים endosome יכולה להיות גישה על ידי א.מ. שידור. איור 1 מציג סוגים שונים של תאי endosomal שכבר הגיעו ולכן כותרתו עם nanogold. Nanogold משופר הכסף ניתן לראות באופן ברור כחלקיקים צפופים אלקטרונים. ההגדרות אופטימליות שהוקמו לשיפור תגובת הכסף מאפשרת שיש חלקיקי זהב בטווח גודל אחיד בין 5 ל -15 ננומטר, שאינו מפריע לultrastructure של תא השמרים. קרום פלזמה, כמו גם תאי endosomal המוקדמים נגישים לnanogold לאחר דגירה 5 דקות ב24 ° C (איור 1 א) תוך LE, בגופי multivesicular מקרה שהוצג, הם להשגה על ידי חלקיקים אלה אחרי לפחות 30 דקות של הספיגה (איור 1 ב '). הכוח ברזולוציה של שילוב הליך IEM 8 עם פרוטוקול שיפור nanogold / כסף שתואר כאן הוא בלתיderlined על ידי השימור ואיכות המורפולוגיה של האברונים הראו, בפרט שלפוחית הפנימית של גופי multivesicular (איור 1).
איור 1. ניתוח Ultrastructural של תאי השמרים endosomal nanogold שכותרתו. Spheroplasts התקבלו מזן הפראי סוג SEY6210 (MATalpha URA3-52 LEU2-3, 112 his3-Δ200 trp1-Δ901 lys2 -801 suc2-Δ9 מל GAL) כפי שמתואר בפרוטוקול שהוצג. Spheroplasts אז הודגרו עם 4 nmol של nanogold הטעון חיובי ב-C ° 4 ל15 דקות לפני שהועבר לטמפרטורת חדר למשך 10 (פנל) או 30 דקות (לוח ב '). תאים היו קבועים לאחר מכן, מעובד לcryosectioning 8 לפני ביצוע תגובת הגברת כסף על ההכנה כמתוארבפרוטוקול שהוצג. תאים מוקדמים א של מערכת השמרים endosomal. בנוסף לקרום הפלזמה, ספיגה קצרה של nanogold (5 דק ') מאפשרת התיוג של שלפוחית בודדת (ראשי חץ), שלפוחית אולי endocytic, ומבנים צינוריים (חץ), סביר מאוד endosomes המוקדמת. ultrastructure גוף multivesicular שמרים ב. דגירה דקות 30 מובילה לתיוג של LE / גופי multivesicular (כוכביות), אלא גם endosomes המוקדמת ובוקואולות חלק (לא מוצגת). M, מיטוכונדריה; N, גרעין; בערב, קרום פלזמה; V, vacuole. בר = 200 ננומטר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
חיסוני אלקטרונים מיקרוסקופית הוא טכניקה המאפשרת שילוב של לוקליזציה של חלבונים עם הרזולוציה ultrastructural של הנשאים ואברונים שבו חלבונים אלה מתגוררים. זה חיוני במיוחד כאשר לומד את מערכת השמרים endosomal כי התאים שלה מופיעים מבני פיסוק כמו במיקרוסקופ פלואורסצנטי. לכן קשה להבחין בהם. מסיבה זו השימוש בבדיקה לזיהוי על ידי EM ונכנסים למסלול endocytic באופן תלוי זמן הוא קריטי לאופן ספציפי לסמן endosomes השונות. סוג זה של בדיקה הוא בעל ערך על מנת להעריך את הפונקציונליות של אנדוציטוזה 6 וזה מהווה חלופה לחוסר סמני חלבון נסיובי איתור.
ההליך המתואר כאן לנצל טעון nanogold חיובי כמו בדיקה לתייג תאי endosomal. בעוד cryosectioning דורש ציוד מיוחד ומיומנות, הפרוטוקול שהוצג הוא קל מבחינה טכנית ולא מחדשמקהלת מכונות מיוחדות. לכן הוא נגיש לכל מעבדה שתרצה להשתמש בו למחקר שלה. עם זאת, כמה אמצעי זהירות שיש לנקוט במהלך השלב הקריטי של הליך זה, כלומר תגובת שיפור כסף. תגובה זו היא רגישה מאוד לאור ולכן כל האורות (מלבד אחת האדום) בחדר צריכה להיות כבויים ו / או מכוסה. כפי שכל התגובות כימיות, מהירות תגובת שיפור כסף מושפעת מהטמפרטורה. כדי להשיג תוצאות עקביות לשחזור באמצעות אותם הפרמטרים, את כל הפתרונות והכלים צריכים להיות preincubated זהירות ב24 ° C. זה חיוני כדי לבסס את זמן הדגירה להגברת הכסף בחדר שבי תגובה זו תבוצע באופן שיגרתי בצורה מדויקת. הרחבת nanogold צריכה להיות ארוך מספיק כדי להיות מסוגל לזהות באופן חזותי חלקיקי זהב על ידי EM וצריכה להיות קצר מספיק כדי למנוע את הדור של חלקיקים גדולים, שיכול לכסות את הפרטים מורפולוגיים. מסיבה זו, הוא הציע בחום לבצע ניסוי פיילוט בעת הגדרת טכניקה זו במעבדה. במהלך בדיקת חלקיקי nanogold צריכים להיות כסף משופר עבור בזמנים שונים כדי לקבוע את הזמן האופטימלי לתגובה. ראוי לציין, את הממדים של החלקיקים המתקבלים לא יכולים להיות בגודל אחיד; תהיה תמיד חלק מההטרוגניות אבל זה צריך להיות כל הזמן מינימאלי ככל האפשר, בטווח שבין 5 - 15 ננומטר. הדבר חשוב במיוחד אם הליך ספיגת nanogold יהיה בשילוב עם labelings חיסוני זהב. היבט נוסף שיש לזכור בעת לפרש את התוצאות הוא שניסויי תיוג דופק מרדף אינם אפשריים בשיטה זו. כתוצאה מכך בערב וא 'א' יהיו גם כותרת בספיגת nanogold נועדה כדי להמחיש LE.
כמו כן ניתן לראות יישומים נוספים של הפרוטוקול שהוצג כאן. אופציה יכולה להיות, כדי לקשר בין נתוני EM של ספיגת nanogold עם microscop הניאוןy. FM4-64 הוא צבע סמן פלואורסצנטי lipophilic שמקורבים לראש הממשלה ו, בדרכה לvacuole, עוברים דרך תאי endosomal באופן תלוי בזמן. שני FM4-64 וnanogold להיכנס לתא בשיתוף עם שומנים ויש להם כנראה קינטיקה הפנמה דומה מאוד 28,29. כתוצאה מכך יוכל לשמש את שני הצבעים בו זמנית באור EM גומל גישות כדי לחקור בו זמנית הדינמי וultrastructure של endocytic compartments.The הוצג גם שיטה יכולה לשמש לסחר בקולטן בתיווך באמצעות מערכת endocytic 30. נגזרי Monomaleido ומונה sulfo-N-הידרוקסי-succinimido של nanogold יכולים לשמש כדי להיקשר קוולנטית חלקיקים אלה לחלבונים 6. לדוגמא cross-linking עם או α-factor יכול להרשות הבא אנדוציטוזה של שני פרומונים אלה על ידי קולטנים הספציפיים שלהם.
בסך הכל, הפרוטוקול המתואר מאפשר לspecifically לתייג את האברונים של מערכת השמרים endosomal באמצעות בדיקה endocytosed, בם ניתן לבצע זיהוי על ידי EM. כלי ניסיוני זוהי גישה רבת ערך כדי ללמוד את קיום החיים וארגון של תאי השמרים endosomal ברמת ultrastructural.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
המחברים מודים רנה Scriwanek לסיוע בהכנה של איור. FR נתמך על ידי ECHO (700.59.003), תכנית alw הפתוחה (821.02.017 ו822.02.014), שיתוף הפעולה DFG-NWO (DN82-303) וZonMW VICI (016.130.606) מענקים.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| PIPES (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, Germany | 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2·6H2O | Merck, Darmstadt, Germany | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| Positively charged Nanogold | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2022 | store at -20 °C |
| HQ-silver™ enhancement kit | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | store at -20 °C |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| Glutaraldehyde 8% EM grade | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | store at -20 °C |
| Lytic enzyme | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | store at -20 °C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | G209N | |
| Cryo-immuno diamond knife 35° | Diatome AG, Biel, Switzerland | N.A. | |
| UCT ultramicrotome | Leica, Solms, Germany | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | Electron Microscopy Sciences, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 meshes nickel grids | Agar Scientific, Stansted, United Kingdom | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| Grids storage box | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml microcentrifuge | Sarstedt, Nümbrecht, Germany | 72690001 | |
| 50 ml tube | Bio-one, Alphen aan den Rijn, The Netherlands | 210296 | |
| Benchkote surface protector | Whatman, Maidstone, United Kingdom | 1159201 |
References
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol. 117, 91-104 (2002).
- Luzio, J. P., Pryor, P. R., Bright, N. A. Lysosomes: fusion and function. Nature Rev Mol Cell Biol. 8, 622-632 (2007).
- Meel, E., Klumperman, J. Imaging and imagination: understanding the endo-lysosomal system. Histochem Cell Biol. 129, 253-266 (2008).
- Bonangelino, C. J., Chavez, E. M., Bonifacino, J. S. Genomic screen for vacuolar protein sorting genes in Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 13, 2486-2501 (2002).
- Griffith, J., Reggiori, F. Ultrastructural analysis of nanogold-labeled endocytic compartments of yeast Saccharomyces cerevisiae using a cryosectioning procedure. J Histochem Cytochem. 57, 801-809 (2009).
- Babst, M., Katzmann, D. J., Estepa-Sabal, E. J., Meerloo, T., Emr, S. D. ESCRT-III: an endosome-associated heterooligomeric protein complex required for MVB sorting. Dev Cell. 3, 271-282 (2002).
- Griffith, J., Mari, M., De Maziere, A., Reggiori, F. A cryosectioning procedure for the ultrastructural analysis and the immunogold labelling of yeast Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 9, 1060-1072 (2008).
- Lewis, M. J., Nichols, B. J., Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H., Pelham, H. R. Specific retrieval of the exocytic SNARE Snc1p from early yeast endosomes. Mol Biol Cell. 11, 23-38 (2000).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Ordering of compartments in the yeast endocytic pathway. Traffic. 3, 37-49 (2002).
- Odorizzi, G., Babst, M., Emr, S. D. Fab1p PtdIns(3)P 5-kinase function essential for protein sorting in the multivesicular body. Cell. 95 (3), 847-858 (1998).
- Donselaar, E., Posthuma, G., Zeuschner, D., Humbel, B. M., Slot, J. W. Immunogold labeling of cryosections from high-pressure frozen cells. Traffic. 8, 471-485 (2007).
- Lah, J. J., Hayes, D. M., Burry, R. W. A neutral pH silver development method for the visualization of 1-nanometer gold particles in pre-embedding electron microscopic immunocytochemistry. J Histochem Cytochem. 38, 503-508 (1990).
- Shah, N., Zhang, S., Harada, S., Smith, R. M., Jarett, L. Electron microscopic visualization of insulin translocation into the cytoplasm and nuclei of intact H35 hepatoma cells using covalently linked Nanogold-insulin. Endocrinol. 136, 2825-2835 (1995).
- Weipoltshammer, K., Schofer, C., Almeder, M., Wachtler, F. Signal enhancement at the electron microscopic level using Nanogold and gold-based autometallography. Histochem Cell Biol. 114, 489-495 (2000).
- Tokuyasu, K. T. A technique for ultracryotomy of cell suspensions and tissues. J Cell Biol. 57, 551-565 (1973).
- Cabrera, M., et al. Phosphorylation of a membrane curvature-sensing motif switches function of the HOPS subunit Vps41 in membrane tethering. J Cell Biol. 191, 845-859 (2010).
- Harner, M., et al. The mitochondrial contact site complex, a determinant of mitochondrial architecture. EMBO J. 30, 4356-4370 (2011).
- Nair, U., et al. SNARE proteins are required for macroautophagy. Cell. 146, 290-302 (2011).
- Jacquier, N., et al. Lipid droplets are functionally connected to the endoplasmic reticulum in Saccharomyces cerevisiae. J Cell Sci. 124, 2424-2437 (2011).
- Karanasios, E., et al. Regulation of lipid droplet and membrane biogenesis by the acidic tail of the phosphatidate phosphatase Pah1p. Mol Biol Cell. 24, 2124-2133 (2013).
- Mari, M., et al. An Atg9-containing compartment that functions in the early steps of autophagosome biogenesis. J Cell Biol. 190, 1005-1022 (2010).
- Nair, U., et al. A role for Atg8-PE deconjugation in autophagosome biogenesis. Autophagy. 8, 780-793 (2012).
- Vaart, A., Griffith, J., Reggiori, F. Exit from the Golgi is required for the expansion of the autophagosomal phagophore in yeast Saccharomyces cerevisiae. Mol Biol Cell. 21, 2270-2284 (2010).
- Erpapazoglou, Z., et al. A dual role for K63-linked ubiquitin chains in multivesicular body biogenesis and cargo sorting. Mol Biol Cell. 23, 2170-2183 (2012).
- Tuinen, E., Riezman, H. Immunolocalization of glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, hexokinase, and carboxypeptidase Y in yeast cells at the ultrastructural level. J Histochem Cytochem. 35, 327-333 (1987).
- Slot, J. W., Geuze, H. J. Cryosectioning and immunolabeling. Nat Protoc. 2, 2480-2491 (2007).
- Prescianotto-Baschong, C., Riezman, H. Morphology of the yeast endocytic pathway. Mol Biol Cell. 9, 173-189 (1998).
- Vida, T. A., Emr, S. D. A new vital stain for visualizing vacuolar membrane dynamics and endocytosis in yeast. J Cell Biol. 128, 779-792 (1995).
- Hainfeld, J. F., Powell, R. D. New frontiers in gold labeling. J Histochem Cytochem. 48, 471-480 (2000).
