لا يمكن اكتشاف العديد من المؤشرات الحيوية المرضية بسهولة بواسطة التقنيات الحالية بسبب تركيزها المنخفض في السوائل البيولوجية ، ووجود الإنزيمات المهينة ، والكميات الكبيرة من البروتينات ذات الوزن الجزيئي المرتفع. يمكن لجزيئات الهيدروجيل النانوية الوظيفية كيميائيا حصاد البروتينات منخفضة الوفرة والحفاظ عليها وتركيزها مما يتيح اكتشاف المؤشرات الحيوية التي لم يكن من الممكن اكتشافها سابقا.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
هيدروجيل الجسيمات النانوية حصاد البلازما أو البول للكشف عن وفرة البروتينات منخفضة
* These authors contributed equally
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
اكتشاف العلامات البيولوجية رواية يلعب دورا حاسما في توفير أكثر حساسية ومحددة كشف المرض. للأسف كثير من المؤشرات الحيوية منخفضة الوفرة التي توجد في السوائل البيولوجية لا يمكن الكشف عنها بسهولة مع مطياف الكتلة أو المناعية لأنها موجودة في تركيز منخفض جدا، هي عطوب، وغالبا ما يخفيها وفرة البروتينات عالية مثل الألبومين أو المناعي. الطعم تحتوي على بولي (N-isopropylacrylamide) (NIPAm) النانوية استنادا قادرة على التغلب على هذه الحواجز الفسيولوجية. في خطوة واحدة أنها قادرة على التقاط، والتركيز والحفاظ على المؤشرات الحيوية من سوائل الجسم. منخفضة الوزن الجزيئي التحاليل تدخل جوهر جسيمات متناهية الصغر وأسرت من قبل مختلف الأصباغ الكيميائية العضوية، والتي تكون بمثابة الطعم تقارب عالية البروتين. النانوية قادرة على تركيز البروتينات من الاهتمام من قبل عدة أوامر من حجمها. هذا العامل هو تركيز كاف لزيادة مستوى البروتين مثل أن البروتينات هي ضمنحد الكشف من الطيف الحالية الكتلة، النشاف الغربي، والمناعية. يمكن تحضين النانوية مع مجموعة كبيرة من السوائل البيولوجية وأنها قادرة على تخصيب كثيرا من تركيز البروتينات منخفضة الوزن الجزيئي والببتيدات مع استبعاد الزلال وغيرها من البروتينات عالية الوزن الجزيئي. تظهر بياناتنا أن 10،000 التضخيم أضعاف في تركيز الحليلة معين لا يمكن أن يتحقق، مما الطيفي والمناعية للكشف عن المؤشرات الحيوية لا يمكن الكشف عنها سابقا.
المقدمة
على الرغم من الانتهاء من تسلسل الجينوم البشري، لم يتم إحراز تقدم كبير في تحديد المؤشرات الحيوية التنبؤية المرض مرحلة مبكرة، أو التي ترتبط مع نتائج علاجية، أو التكهن 1. وأحد أسباب ذلك عدم إحراز تقدم هو أن العديد من المؤشرات الحيوية الهامة المحتملة توجد بتركيز أقل من حد الكشف عن مطياف الكتلة التقليدية وغيرها من منصات اكتشاف العلامات البيولوجية. مطياف الكتلة (MS) ومتعددة رصد رد الفعل (MRM) لديهم حساسية الكشف عادة أكبر من 50 نانوغرام / مل في حين أن الغالبية العظمى من التحاليل المناعية تقاس في سقوط المختبر السريري في نطاق بين 50 جزء من الغرام / مل و 10 نانوغرام / مل . وهذا يعني أن العديد من المؤشرات الحيوية، وخاصة في المر....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
البروتوكول
وقد تم جمع البلازما البشرية والبول من المانحين المتطوعين صحية، مع الموافقة المسبقة الخطية، بعد الموافقة عليها جامعة جورج ميسون مجلس المراجعة المؤسسية البروتوكولات. تم توزيع المانحين بالتساوي بين الذكور والإناث القوقاز الذين تتراوح أعمارهم بين 25 و 42. عينات تم تحليلها بشكل فردي، ولم تجميع.
1. جسيمات متناهية الصغر تجهيز المصل أو البلازما عينات
يتم التقاط المؤشرات الحيوية المحتملة وفيرة منخفضة في البلازما، في الحل، مع الجسيمات النانوية هيدروجيل. تضاف الجزيئات إلى البلازما، والمحتضنة، مفصولة الطرد....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
النتائج
هيدروجيل الجسيمات النانوية الحجم والتوحيد
وقد تم إنتاج بولي (NIPAm-AAC) الجسيمات مع ارتفاع العائد للغاية والتكاثر بين وداخل دفعات. الجسيمات الغروية لها الاستقرار جيدة جدا في RT خلال الوقت اللازم لالتقاط وتخزين وشطف من البروتينات (لا يقل عن 48 ساعة)، ولم يلاحظ هطول جسيمات متناهية الصغر (الشكل 1) 11. قد يكون الاستقرار الغروية مهم جدا لسرعة امتصاص بروتين / الببتيد بواسطة .......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
الصلة السريرية
ويعتقد أن المصل أو البلازما عينة لاحتواء منخفضة وفرة البروتينات والببتيدات المنتشرة التي يمكن أن توفر مصدرا غنيا للمعلومات عن حالة الكائن الحي ككل. على الرغم من الوعد البروتينات في الدم، وهناك ثلاثة حواجز الفسيولوجية الأساسية والخطيرة إحباط اكتشاف العلامات البيولوجية والترجمة لفائدة سريرية 10، 11، 16، 25.
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
بنيامين إسبينا هو موظف في شركة Ceres Nanosciences، Inc. التي تنتج الكواشف المستخدمة في هذه المقالة. يمتلك كل من لانس ليوتا وأليساندرا لوتشيني وفيرجينيا إسبينا براءات اختراع (براءة اختراع أمريكية 7،935،518 و / أو 8،497،137) على تقنية الجسيمات النانوية المستخدمة في هذه المقالة. بصفتهم موظفين جامعيين ، يحق لهم الحصول على إتاوة من براءات الاختراع هذه وفقا لسياسة الجامعة. لانس ليوتا وأليساندرا لوتشيني مساهمان في Ceres Nanosciences ويعملان في المجلس الاستشاري العلمي.
شكر وتقدير
مايكل هنري، جامعة مدينة دبلن، يرجى المساعدة في جمع البيانات وتحليلها هو مبين في الشكل 5. وأيد هذا العمل جزئيا من قبل (1) جامعة جورج ماسون، (2) الإيطالية IstitutoSuperiore دي سانيتا "في إطار ايطاليا / الولايات المتحدة الأمريكية اتفاقية تعاون بين وزارة الصحة والخدمات الإنسانية، جامعة جورج ماسون، والوزارة الإيطالية للصحة العامة، (3) NIH، برنامج المنح IMAT 1R21CA137706-01 و1R33CA173359-01 إلى LAL، و (4) سيريس العلوم النانوية، وشركة .
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| جسيمات هيدروجيل نانوية | Ceres Nanoscience | CS003 | NanoTrap ESP جزيئات |
| 18 M & Omega ؛ - سم ماء | نوع 1 كاشف درجة الماء | ||
| Tris HCl ، 50 ملي مولار درجة الحموضة 7.0 | VWR | IC816116 | 50 ملي مولار ، درجة الحموضة 7 |
| أسيتونيتريل | BDH | BDH1103-4LP | متوفر من VWR |
| هيدروكسيد الأمونيوم NH4< / sub>OH | BDH | BDH3014 | متوفر من VWR ، تم فحصه عند 28-30٪ NH3< / sub> |
| ثيوسيانات الصوديوم 25 ملي مولار | Acros Organics | 419675000 | لعينات المصل / البلازما |
| شرائط كاشف البول متعددة التحليلات | Siemens | 2161 | لعينات البول |
| Tris-Glycine SDS Sample Buffer (2X) | Life Technologies | LC2676 | استخدم في RT لمنع ترسيب SDS |
| حاضنة حمام جاف (100 o< / sup>C) مع كتلة تسخين | Barnstead | 11-715-125DQ | لا تستبدل حمام الماء المغلي |
| مشعب مبخر النيتروجين | Organomation Associates | Microvap118 | لعينات المصل / البلازما |
| جهاز الطرد المركزي ، الدوار المتأرجح | من سلسلة Sorvall | Legend | سعة الأنبوب 50 مل ، جهاز طرد مركزي RCF 3،700 × جم |
| ، دوار بزاوية | ثابتة Eppendorf | 5424 | سعة أجهزة الطرد المركزي الدقيقة 1.7 مل ، RCF 16,000 × جم |
| 50 مل من أجهزة الطرد المركزي المخروطية ؛ أنابيب | فيشر ساينتفيك | 14-432-22 | مع أغطية لولبية لعينات البول |
| 1.5 مل أنابيب الطرد المركزي الدقيقة | Eppendorf | 22363204 | |
| خلاط دوامة | فيشر Scientific | 50-949-755 | |
| مؤقت | فيشر Scientific | S04782 | ثانية / دقيقة |
المراجع
- Aebersold, R., Mann, M. Mass spectrometry-based proteomics. Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).
- Gerszten, R. E., et al. Challenges in translating plasma proteomics from bench to bedside: update from the NHLBI Clinical Proteomics Programs.<....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
