Sondagem de alta densidade microarrays proteína funcional para detectar interacções proteína-proteína

Resumo

Utilizando microarrays de proteína que contêm quase toda a S. cerevisiae proteoma é sondado para um rápido interrogatório imparcial de milhares de interações proteína-proteína em paralelo. Este método pode ser utilizado para a molécula de proteína-pequena, a modificação pós-traducional, e outros ensaios in high-throughput.

Resumo

Microarrays proteicos funcionais de alta densidade contendo ~ 4200 proteínas de levedura recombinantes são examinados para interacções proteína-proteína-quinase, utilizando uma proteína de fusão purificada por afinidade, de levedura de quinase contendo uma etiqueta de epitopo-V5 para read-out. Quinase purificada é obtida através da cultura de uma estirpe de levedura optimizado para a produção de proteínas de cópias elevado contendo um plasmídeo contendo uma fusão de quinase-V5 construir sob um promotor GAL indutível. A levedura é cultivada em meios restritiva com uma fonte de carbono neutro durante 6 horas, seguido por indução com galactose a 2%. Em seguida, a cultura é colhida e quinase é purificado usando técnicas cromatográficas padrão de afinidade para se obter uma proteína-quinase de elevada pureza para utilização no ensaio. A quinase purificada é diluída com tampão de quinase de um conjunto adequado para o ensaio e os microarrays da proteína estão bloqueados antes da hibridação com o microarray da proteína. Após a hibridação, as matrizes são sondados com V5 monoclonal ANTIBody para identificar proteínas ligadas pela proteína cinase-V5. Finalmente, as matrizes são digitalizados utilizando um scanner de microarray padrão, e os dados são extraídos para a análise informática jusante ^1,2 para determinar uma confiança elevada conjunto de interacções de proteínas a jusante para validação in vivo.

Introdução

A necessidade de se realizar análises globais de bioquímica de proteínas e actividade in vivo de ligação resultou no desenvolvimento de novos métodos para perfilar as interacções proteína-proteína (IBP) e as modificações pós-traducionais de proteomas inteiros ^1,3-8. Microarrays da proteína são fabricados como microarrays funcionais de proteínas utilizando proteínas funcionais full-length ^4-6,8,9, ou microarrays da proteína analíticas contendo anticorpos ^10,11. Eles foram concebidos para conter uma elevada densidade de proteínas dispostas em lâminas de microscópio com uma variedade de químicas de superfície para facilitar uma ....

Protocolo

1. Preparação Probe

1. Cultura e purificar as sondas V5-quinase de fusão usados ​​para examinar as interacções com outras proteínas, como segue:
   1. Use recém-riscado estirpe Y258 levedura (MATa pep4-3, his4-580, ura3-53, leu2-3,112) contendo proteína V5-fusão (expressa a partir pYES-DEST52 vetor gateway). Use a proteína isolada como sonda sobre os microarrays. A chapa completa de levedura-uracilo sintético (Sc-Ura) / 2% de dextrose / Agar e crescer a 30 ° C durante 3 dias de cultura congelada (-80 ° C em glicerol).
   2. Inocular culturas de arranque (5-20 ml) a partir de uma única colônia e crescer durante a noite em Sc-Ura / 2% de dextrose em plat....

Resultados

A actividade de interacção proteína-proteína foi observada usando um leitor de chip padrão para avaliar a Tda1-V5 proteína quinase construção de fusão como uma proteína de isco contra um microarray proteico funcional levedura contendo aproximadamente 4200 único S. proteínas de fusão com GST cerevisiae. Além disso interrogatório com o software GenePix revelou uma infinidade de eventos de diferentes intensidades de ligação. A afinidade foi medida a partir da intensidade do sinal graduada derivado de um a.......

Discussão

O protocolo apresentado foi inicialmente realizada usando 85 proteínas de fusão de cinase-V5 únicas proteínas de levedura para comparar a actividade de ligação entre as famílias distintas e relacionadas de proteína-quinases de levedura, resultando na identificação de novas redes de interacção quinase in vivo ^1. Como uma tecnologia de criação de perfil proteômica emergentes, o desenvolvimento de Alto Rendimento (HTP) rastreio de proteomas usando microarrays da proteína contavam com bibliotecas de pépt.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Placas de Petri	VWR	NC-10747	ou extrato de
levedura Bacto	Difco	0217-17
Bacto peptona	Difco	0118-17
Ágar Bacto	Difco	0140-01
Dextrose	Sigma	D9434
Rafinose	Sigma	R0514
Galactose	Sigma	G0750
Sc-Ura drop out media	MP Bio 114410622
Tubos de cultura pequenos	VWR/Fisher
Erlenmeyer grande Frasco	VWR/Fisher
Rotor JA-10
Tubos de centrífuga (500 ml)
Tubo Falcon (50 ml)	VWR/Fisher	21008-951
PBS Tablets	Sigma	P4417
FastPrep Tubes (tubo de tampa de rosca de 2 ml)
Máquina FastPrep	MP Biomedicals	116004500
Zircon Beads	BioSpec	11079105
Triton X100	Sigma	P4417
TDT	Sigma	D9779
MgCl2	Sigma	M8266
NaCl	Sigma	S3014
Imidazol (pH = 7,4)	Sigma	I5513
PMSF		Sigma 93482
(Livre de EDTA)	Coquetel Inibidor	Roche 11873580001
1	sigma	P2850
BSA	Sigma	A2153
Tween-20	Sigma	P1379
ATP	Sigma	A1852
Incubadora Agitada (30 ° C)
Resina de Afinidade de Níquel	Life Technologies	R901-01
G25 coluna	GE ciências da vida	27-5325-01
Nutator	VWR / Fisher
SDS-PAGE Gel (NuPage)	Life Technologies
Coomassie Blue Stain	Life Technologies
Anticorpo V5 monoclonal	Life Technologies	R960-25
Alexa647 Tagged anticorpo V5 monoclonal	Life Technologies	451098
Microarrays de proteínas Kit	Life Technologies	PAH0525013
Genepix Scanner	Molecular Devices
Lifter Slips	http://www.thomassci.com/Supplies/Microscope-Cover-Glass/_/LIFTER-SLIPS/	Thomas Scientific
: 0.1% Triton X-100, 0.5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 mM imidazole (pH 7.4), Coquetel completo de inibidor de protease – Inibidor de fosfatase sem EDTA Coquetel 1, 1 mM PMSF  (adicione antes de usar)			Adicione os reagentes a 1x PBS (tampão fosfato 0,01 M, cloreto de potássio 0,0027 M, cloreto de sódio 0,137 M; pH 7,4) para obter o volume desejado de solução de lise
Tampão de bloqueio: albumina de soro bovino (BSA) a 1%, Tween-20			Adicione os reagentes a 1x PBS para obter o volume desejado de tampão
de bloqueioTampão de sonda: 2 mM MgCl2, 0,5 mM DTT, 0,05% Triton X-100, 50 mM NaCl, 500 μ M ATP (para quinases), 1% BSA			Adicione o reagente a 1x PBS para obter o volume desejado de tampão de sonda
Tampão de lavagem: 0,1% Triton X-100, 500 mM NaCl, 0,5 mM DTT, 50 mM de imidazol (pH 7,4), 2 mM MgCl2			Adicione o reagente a 1x PBS para obter o volume desejado de tampão
de sondaTampão de eluição: 0,1% Triton X-100, 0,5 mM DTT, 2 mM MgCl2, 500 mM NaCl, 50 - ndash; 500 mM de imidazol (pH 7,4), coquetel completo de inibidores de protease – Coquetel 1, inibidor de fosfatase sem EDTA, 1 mM PMSF (adicione antes de usar)			Antes de começar, é importante observar o gradiente de concentração de imidazol (50 - 500 mM) e criar tubos separados para cada concentração (é aconselhável criar o intervalo usando incrementos de 50 mM). Adicione o reagente a 1x PBS para obter o volume desejado de tampão de sonda
3x YEP +6% galactose: Dissolva 30 g de extrato de levedura e 60 g de peptona em 700 ml de H2O, e autoclave. Adicione 300 ml de galactose 20% esterilizada por filtro (peso/vol)			A galactose não deve ser autoclavada

comparável Coquetel Inibidor Completo de Fosfatase Tampão Lisis a 0,1%