時空のCaを測定する 2 +シグナル

サマリー

のCa ^{2 +}シグナル伝達は、植物において、多様な生物学的プロセスを調節する。ここでは、遺伝的にコード化されたのCa ^{2 +}指標エクオリンまたはCASE12を使用して、シロイヌナズナの細胞および組織内の空間的および時間的のCa ^{2 +}シグナルを誘発した非生物的ストレスを監視するためのアプローチを提示します。

要約

発生および環境信号は、植物細胞内のCa ^{2 +}の変動を誘発する。刺激固有の空間-時間のCa ^{2 +}のCa ^{2 +}のパターンは、シグナル伝達カスケードを開始し、携帯のCa ^{2 +}結合タンパク質によって感知される。しかし、私たちはまだ、特定のCa ^{2 +}シグナルが生成される刺激方法について少し知っている。のCa ^{2 +}シグナルの特異性は、与えられた刺激に応答してのCa ^{2 +}チャネルおよび/ ​​またはトランスポーターの活性の洗練されたレギュレーションに起因し得る。これらの細胞成分を同定し、その機能を理解するには、組織や細胞レベルの両方でのCa ^{2 +}シグナルの高感度かつ堅牢な記録を可能にするシステムを使用することが重要です。異なる細胞区画を標的とする遺伝的にコードされたのCa ^{2 +}指標は、携帯のCa ^{2 +}シグナルの生細胞の共焦点イメージングのためのプラットフォームを提供してきた。ここでは、命令を記述する2のCa ^{2 +}の検出システムを使用するためのsが：FAS（フィルム接着剤の苗）の発光のCa ^{2 +}イメージングおよびCASE12ベースの生細胞共焦点蛍光カルシウム^{2 +}イメージングベースのエクオリン。 CASE12を用いて生細胞の共焦点イメージングは、高解像度でのサイトゾルおよび核のCa ^{2 +}シグナルの同時検出を提供しながら、FASシステムを用いた発光イメージングは、組織レベルでの空間的および時間的のCa ^{2 +}シグナルの単純な堅牢かつ高感度な検出を提供する。

概要

植物細胞は、細胞の行動を調整するシグナリングを介して環境に応答する。環境刺激に応答してイベントをシグナリング初期の細胞は一過性のCa ^{2 +}の増加である。遊離Ca ^{2 +}濃度のパターン、または一過性の上昇の署名は、その振幅、周波数、および期間によって特徴付けられる。個別時空間のCa ^{2 +}署名は異なる細胞活性^1を調節する。例えば、熱、寒さ、塩、干ばつ、光、植物ホルモンなどの具体的な刺激は、微調整も膜局在のCa ^{2 +}チャネルおよび/ ​​またはトランスポーターの時空間的アクティビティを、特定のCa ^{2 +}の署名を得た。のCa ^{2 +}輸送体が十分に特徴付けされているが、ほとんどの植物¹におけるCa ^{2 +}チャネルの分子アイデンティティおよび機能についてはほとんど知られていない。ストレス刺激するために、変化したのCa ^{2 +}応答を持つ変異体についての遺伝子スクリーニングが効果的APPRかもしれのCa ^{2 +}の署名を構成するコンポーネントを識別するためのoach。最近、いくつかのイクオリンベースのCa ^{2 +}検出システムは、病原体の攻撃および非生物的ストレス^2-4に反応してCaのための遺伝子スクリーニング^{2 +}シグナル伝達成分を容易に....

プロトコル

FASシステムを用いた1イクオリンベースのCA ^{2 +}イメージング

1. 発光イメージングのための苗木を準備します。 0.01％のTriton-100を含有する10％漂白溶液でエクオリンを発現するArabidopsis植物の種子を滅菌する。フル強度MS（ムラシゲ·スクーグ基礎塩混合物）、1％スクロース、1.2％寒天を含む角板（グリッド10×10cmの正方形のペトリ皿）上で無菌種をまく。 2日間（ 図1A）、4℃で層別化した後、成長チャンバー内に垂直に配置し、プレート。
2. フィルム上に苗を移します。プレート上で生育7-10日齢の苗の上に接着フィルム（ 図1B）を配置します。ゆっくりと苗はフィルム（ 図1C）に準拠していることを確実にするために手でフィルムを押してください。苗がフィルムに付着したままになるように静かにフィルムをはがします（ 図1Dおよび1E）
3. 補因子と苗をインキュベートします。 Aを配置水の中に2μg/ mlののH-CTZ（セレンテラジン）の15ミリリットルを含む正方形のプレート上dhered苗（10×10センチ）。一晩に4時間（ 図1F）を、室温で苗をインキュベートする。
4. 発光イメージングのための準備をします。 H-CTZ溶液から....

結果

マンニトール、NaClおよびH ₂ O _2は、それぞれ、脱水、塩および酸化ストレス刺激のためのプロキシとして使用した。重金属イオンのCu ^{2 +は、}これら三つのストレス刺激のいずれかと相乗作用しているかどうかを確認するために、私たちは、Cu ^{2 +}の存在下または非存在下でそれぞれの刺激に対するCa ^{2 +}応答を比較した。 図2に示されるように、FASの発光イメージングはArabidoposis苗脱水、塩および酸化ストレスに対して異なって応答したことを明らかにした。 1 mMのH ₂ O _2が誘導しながら、私たちはこの研究で調べた刺激の濃度について、75のNaClは、露出（ 図2A中央のパネルおよび図2B）の最初の40秒の間に葉と根で最強のCa ^{2 +}応答を誘導した第一および第二40秒（ 図2A右パネル）の間に葉と根の両方で強いのC.......

ディスカッション

私たちは、シロイヌナズナの苗の時空間のCa ^{2 +}応答を記録するためのFASシステムを実証している。このFASのCa ^{2 +}記録方式がここに提示されている非生物的ストレス刺激に加えて、さまざまな刺激によって誘発のCa ^{2 +}動態を測定するために適合させることができる、単純な感度かつロバストな手法を提供する。このシステムを用いて、簡単に植物全体レベルでの組織または刺激特異的な時空間のCa ^{2 +}動態を比較することができます。 FASの高い感度は、高強度のストレスが使用される場合、細胞に物理的な損傷によって引き起こされるアーティファクトを回避するために重要でのCa ^{2 +}応答を検査するための低強度の刺激を使用することができる。異なる生理学的段階で苗が与えられた刺激に応じて異なる感度と特異性を持っているかもしれないが7〜10日齢のシロイヌナズナの苗は、組織または刺激特異的のCa ^{2 +}応答を示した。したがって、ある約100苗がフィルムの一枚の上に付着させることができたFAS測定のスループットを向上させるために7-.......

材料

この記事で使用された材料の一覧

名前	会社	カタログ番号	コメント
10 cm x 10 cm正方形のペトリ皿	VWR	60872-310
フィルム	VWR	60941-062
チューブPerkinElmer		9908265
1mlシリンジ	VWR	53548-000
グリース	ベックマン335148
2ウェルチャンバーカバーガラス	Nalge Nunc international	155379
8ウェルチャンバーカバーガラス	Nalge Nunc international	155409
Luminescence イメージングシステム	Princeton Instruments	N/A
倒立共焦点レーザー走査型顕微鏡	Nikon Instruments Inc.	N/A	ニコン A1R
イメージングソフト	ニコンインスツルメンツ株式会社	N/A	ニコンエレメント
DataGraph	Visual Data Tools Inc	N/A	DataGraph 3.1.1 最新バージョン
Coelenterazine	NanoLight Technolgies	#301B NF-BCTZ-FB
万能漂白剤	任意のローカル ストア	N/A
Triton X-100	フィッシャー	BP151500
MS 塩	Phytotechnology Labs	M524-50L
ショ糖	VWR	BDH8029-12KG
寒天		ΣA1296-5KG
フィタゲル	ΣP8169-1KG

接着ポリエチレンシリコーン