Summary
Celkweekmodellen gedetailleerde controle milieuomstandigheden en dus een krachtig platform om verschillende aspecten van neuronale cel biologie. We beschrijven een snelle, goedkope en betrouwbare wijze te isoleren, dissociëren en cultuur sensorische neuronen van kippenembryo's. Details van de ondergrond voorbereiding en immuuncytochemie zijn ook aanwezig.
Abstract
Neuronen zijn veelzijdige cellen die informatie essentieel is voor een verscheidenheid aan functies, waaronder sensatie, motoriek, leren en geheugen uit te voeren. Studeren neuronen in vivo kan lastig zijn vanwege hun complexiteit, hun gevarieerde en dynamische omgevingen, en technische beperkingen. Daarom bestuderen neuronen in vitro gunstig kan blijken om de complexe geheimen van neuronen ontrafelen. De goed gedefinieerde aard van celcultuur modellen biedt gedetailleerde controle over de milieu-omstandigheden en variabelen. Hier beschrijven we hoe te isoleren, distantiëren, en cultuur primaire neuronen van kippenembryo's. Deze techniek is snel, goedkoop en genereert stevig groeiende sensorische neuronen. De procedure produceert vaste culturen die sterk verrijkt voor neuronen en heeft zeer weinig niet-neuronale cellen (minder dan 5%). Primaire neuronen niet goed aan onbehandelde glas of weefselkweek plastic derhalve gedetailleerde procedures twee Distin creërenct, goed gedefinieerde-laminin bevatten substrata voor neuronale plating worden beschreven. Gekweekte neuronen zijn zeer vatbaar voor meerdere cellulaire en moleculaire technieken, met inbegrip van co-immunoprecipitatie, live cell verbeelden, RNAi, en immunocytochemie. Procedures voor dubbel immunocytochemie volgende gekweekte neuronen werden geoptimaliseerd en beschreven.
Introduction
Neuronen zijn complexe cellen die informatie essentieel is voor een verscheidenheid aan functies, waaronder sensatie, visie, motoriek, leren en geheugen uit te voeren. Unieke van andere celtypen, neuronen verlengen arm-achtige processen axonen, essentiële neurale snelwegen communicatie vormen. Tijdens de ontwikkeling van gespecialiseerde compartimenten zich aan de uiteinden van de groeiende axonen, de zogenaamde groei kegels, navigeren door een concert van extracellulaire signalen naar de axon naar de juiste bestemming te leiden. De ingewikkelde moleculaire mechanismen die groeikegel navigatie grondslag liggen zijn niet volledig begrepen. Om beter te begrijpen van deze mechanismen, hebben de onderzoekers gebruikt celcultuur modellen voor neuronen in een gedefinieerde en vereenvoudigde in vitro-omgeving te bestuderen. Studeren neuronen in cultuur 1 heeft geleid tot aanzienlijke vooruitgang in ons begrip van de neuronale celbiologie waaronder: neuronale differentiatie 2, cytoskelet dynamiek, endocytose en mensenhandel, dendrietregulatie 3,4, axonale regeneratie 5, en klinische aandoeningen zoals neuropathieën 6. Bovendien gekweekte neuronen zeer vatbaar voor diverse onderzoekstechnieken zoals immunocytochemie, celoppervlak co-immunoprecipitatie, Western blot, transfectie, RNAi en levende imaging zoals timelapse analyse van groeikegel motiliteit. Aldus kweken van primaire neuronen is een krachtige aanpak talrijke aspecten van de celbiologie van neuronen helderen.
De celcultuur model biedt onderzoekers met gedetailleerde controle over de milieu-omstandigheden en variabelen. Bijvoorbeeld kan het substraat waarop neuronen uitgeplaat (en groeien op) gemakkelijk worden gemanipuleerd. Hier geven we gedetailleerde instructies voor het genereren van twee verschillende substraten, een met een lage concentratie laminine-1 en de andere met verzadigende concentraties van laminine-1. Verrassenderwijs kunnen verschillende concentraties van hetzelfde molecuul dramatische effectende interne toestand van neuronen en hun celoppervlak samenstelling. Bijvoorbeeld, intracellulaire niveaus van cAMP en maaivelden integrines significant verschillend in neuronen uitgeplaat op beide substraten 7,8. Aanvullende studies hebben aangetoond dat andere moleculen, waaronder fibronectine en chondroïtinesulfaat proteoglycanen, effect de expressie van celoppervlak moleculen en neuronale motiliteit 7-11. Bovendien oplosbare moleculen zoals neurotrofinen en neurotropins ook gevolgen celmembraan preparaat en neuronale beweeglijkheid 12-16 en kan gemakkelijk en nauwkeurig gemanipuleerd in een cel cultuurmodel.
Hier beschrijven we methoden om te isoleren en cultuur los sensorische neuronen van kippenembryo's. Deze procedure is gebruikt om belangrijke doorbraken in neurobiologie, inclusief axon uitgroei 5,7,8,10,11,16-21 maken en is een modificatie van een procedure die tot ganglioncellen 22 isoleren. Er zijnverscheidene voordelen aan deze aanpak. Ten eerste zijn veel kenmerken van chick dorsale wortel ganglion (DRG) ontwikkeling goed gekarakteriseerd, waaronder de termijn voor de geboorte, axon extensie, en eiwit expressie profielen 2,23-28, waardoor het een leerzame basis waarop te bouwen informatieve in vitro experimenten. Ten tweede, gedissocieerd neuronale kweken kan de onderzoeker directer bestuderen neuronen vergelijking met alternatieve benaderingen waarbij intacte DRG-explantaten (welke neuronen en niet-neuronale cellen bevatten) en / of gemengde kweken die zowel gedissocieerde neuronen en niet-neuronale cellen. Ten derde, de hier beschreven procedure is eenvoudig, goedkoop en vatbaar voor studenten. Daarom kan deze techniek worden gebruikt voor onderzoek en voor onderwijsdoeleinden. Bovendien moet kleine wijzigingen van dit protocol snelle, hoge opbrengst zuivering van neuronen uit andere dan DRGs bronnen toestaan. Bijvoorbeeld kan deze procedure worden aangepast om neuronaal verschaffen Enriched kweken van andere weefsels zoals embryonale voorhersenen of ruggenmerg.
Immunocytochemie protocollen zijn geoptimaliseerd voor deze gedissocieerde neuronale kweken en worden in detail beschreven hier. De procedure voor twee immunocytochemie tegen neurale cel adhesiemolecuul (NCAM) en β1 integrines voorzien. Het genereren van deze immunocytochemische werkwijzen zijn gebruikt om de ruimtelijke patronen en intensiteit van verscheidene moleculen in gekweekte neuronen 8,16 onderzoeken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1 Coverslip Voorbereiding: Acid Wash en Bake
- Minstens 2 dagen voor dissectie (stap 2), begint de volgende stappen uit om dekglaasjes bereiden. Voer de zure wasstap om oliën en grondig schoon dekglaasjes verwijderen.
- Load dekglaasjes in porseleinen houder die verticaal positioneert dekglaasjes en voorkomt dat ze elkaar raken. Dompel houder en dekglaasjes in glas histologie container gevuld met 2 M zoutzuur (HCl). Als alternatief, als porselein houder niet beschikbaar, verspreid ~ 20 dekglaasjes horizontaal onderaan 100 mm glazen petrischaal dekken en dompel dekglaasjes in 2 M HCl.
- Plaats glazen vat (met dekglaasjes ondergedompeld in zuur) op rocker tafel in zuurkast en laat zacht schommelen gedurende minstens 5 uur bij kamertemperatuur. Als alternatief, zure was coverslips nacht onder dezelfde voorwaarden.
- Was dekglaasjes met gedestilleerd H2 O (dH 2 O) door overdracht porseleinen houder loadedmet dekglaasjes van 2 M HCl om een schone glazen histologie bak met dH 2 O. Als alternatief, decanteren 2 M HCl van glas petrischaal met dekglaasjes en opnieuw vullen met dH 2 O.
- Was door decanteren dH 2 O opnieuw en opnieuw vullen glazen vat met verse dH 2 O. Herhaal dit voor een totaal van 3 snelle wasbeurten.
- Begin langer wassen regime door terug te keren glazen vat (met dekglaasjes en dH 2 O) op de wip. Zorg voor zacht schudden gedurende 10-30 minuten bij kamertemperatuur. Vervolgens giet dH 2 O en voeg verse dH 2 O. Herhaal voor een totaal van ten minste tien wassingen. Als alternatief blijven wassen 's nachts.
- Plaats gewassen dekglaasjes in oven voorverwarmd tot 350 ° C. Bij gebruik van porseleinen houder, verwijder de houder van dH 2 O-gevulde glazen container en plaats dan de houder met dekglaasjes direct in de oven. Bij gebruik van een glazen petrischaal, decanteren dH 2 O en plaats de glazen schaal met dekglaasjes in de furnace.
- Bak dekglaasjes gedurende ten minste vijf uur of overnacht bij 350 ° C.
- Na het bakken is voltooid, verwijdert dekglaasjes van porseleinen houder met fijn pincet en plaats in steriele 100 mm glazen petrischaal. Laat dekglaasjes die oorspronkelijk werden geplaatst in porseleinen houder in de glazen petrischaal.
2 Chick Dissection en Isolatie van DRG's
- Verwijder vruchtbare, geënsceneerd Witte Leghorn kuiken ei incubator (gehouden op 37-38,5 ° C met zachte wiegen).
OPMERKING: Eerdere studies hebben embryonale dag 7-10 gebruikt voor de isolatie van DRG's 2,8,11-13,16. - Plaats geselecteerde ei in laminaire stroming kap. Over tot alle hierna onder aseptische omstandigheden in de laminaire stroming kap met steriele oplossingen en instrumenten opgenomen procedures. Voorverwarmen alle oplossingen in een 37 ° C waterbad.
- Crack ei en plaats inhoud in een plastic 100 mm petrischaal. Gebruik standaard tang om embryo naar een andere 100 mm petrischaal.
- Voeg warm F12HS10 (Ham's F12, 10 mM HEPES, 100 eenheden / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine, 10% foetaal runderserum) om schotel met Pasteur pipet om weefsel nat te houden. Gebruik een tang om embryo positioneren op de dorsale zijde (figuur 1A).
- Plaats 100 mm plastic petrischaal met embryonaal weefsel op een verrekijker StereoVision dissectiemicroscoop in laminaire stroming kap. Gebruik fijne tang om een verticale middellijn incisie staart hals maken door afklemmen van de ontwikkeling dermis naar het hart, longen en andere organen bloot. Daarnaast kunt u een reeks van kleine scheurtjes aan de interne organen bloot.
- Gebruik voorzichtig 2 sets van steriele fijne tang om: a) grijpen de hals en b) grijpen de aorta of ander weefsel onmiddellijk boven het hart en trek naar de staart,uithalen van het dier.
- Solliciteer warm F12HS10 met Pasteur pipet om weefsel. Gebruik een tang om alle resterende cardiovasculaire, respiratoire of spijsverteringsorganen verwijderen om de ontwikkeling van ribben, wervelkolom en DRG's (figuren 1B-1D) bloot te leggen.
- Onder de microscoop ontleden Gebruik fijne tang organen verder te verwijderen en laat DRG langs beide zijden van de lumbale wervelkolom, inferieur aan de ribben. Verzamel DRG's door het plukken intact DRG's van het embryo. Knijp en scheiden de wortels die reiken van de DRG naar het ruggenmerg en grijpen het ontwikkelen zenuw die zich uitstrekt van de DRG naar de periferie of vice versa.
- Plaats intact DRG's in een 35 mm cultuur schotel gevuld met warm F12HS10. Verwijder overtollig weefsel, zoals de dorsale en ventrale wortels kan hebben gehouden DRG, uit de intacte DRG in 35 mm schaal door knijpen met fijne pincet.
- Om DRG's superieur aan de lumbale regio te verkrijgen, verwijder de ventrale helft van de thoracale en cervical wervelkolom. Dit gebeurt door een snede in de ontwikkeling wervelkolom loodrecht op het ruggenmerg as in het bovenste cervicale regio en een verlaging van de bovenste lumbale gebied. Maak dan evenwijdig met het ruggenmerg as langs de rechter en linkerzijde van de wervelkolom. Til de ventrale helft van de wervelkolom van het embryo, dat de bloot bloot het ruggenmerg (figuren 1E-1F).
- Om gemakkelijk toegang tot DRG's toe te staan, verwijder de thoracale en cervicale ruggenmerg door grijpen het ruggenmerg met een fijne tang. Gebruik de tang om het ruggenmerg te bevrijden van de wervelkolom. Bij benadering van de thoracale ruggenmerg op het niveau van ribben en het cervicale gebied is superieur aan de ribben.
- Verzamel intact thoracale en cervicale DRG's met fijn pincet en plaats ze in warm F12HS10 met andere DRG's. Verwijder overtollig weefsel dat kan voldoen aan DRG's.
- Spoel interieur van een nieuwe glazen Pasteur pipet met F12HS10 te helpenvoorkomen DRG's kleven aan de wanden van de pipet. Gebruik gespoeld pipet om alle DRG's en F12HS10 overbrengen van kleine petrischaal met een steriele 15 ml conische buis en meteen doorgaan naar stap 3.
LET OP: Extra embryo's kunnen worden ontleed om het aantal DRG's te verhogen. DRG moeten F12HS10 worden bewaard bij 37 ° C tot klaar voor stap 3.
3 Dissociatie, Verrijking, en het kweken van DRG neuronen - Deel 1
- Plaats conische buis met intacte DRG in centrifugebuis en voorzichtig centrifugeren (200 x g) gedurende 2-3 minuten. Bevestigen dat DRG gezonken naar onderkant van de buis. Zo niet, nogmaals spelen.
- Met behulp van een pipet, verwijder voorzichtig F12HS10, waardoor DRG pellet ongestoord. Voeg 2 ml 1x calcium en magnesium-gratis (CMF) PBS, loskomen van de pellet van DRG's. Spin opnieuw en verwijder CMF PBS terwijl de DRG pellet intact. Herhaal deze wasstap voor een totaal van drie wasbehandelingen met foetaal runderserum in F12HS10, die afbreuk doen aan trypsine digestie in de volgende stap verwijderen.
- Voeg 2 ml trypsine verwarmd tot 15 ml buis met 2 ml CMF PBS en DRG. Plaats tube 37 ° C waterbad gedurende 10-15 min DRG verteren in gedissocieerde cellen.
- Tijdens incubatie maken F12H + supplement bevattende media (Ham's F12, 10 mM HEPES 100 eenheden / ml penicilline, 0,1 mg / ml streptomycine, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mM L-glutamine en N2) en warm bij 37 ° C waterbad. Typisch, 10 ml totaal medium volstaat 4-5 35 mm schalen van primaire sensorische neuronen. Ook beginnen ontdooien laminine-1 voor coating dekglaasjes (stap 4).
- Zachtjes wrijf DRG's in trypsine-oplossing met p1000 pipet en visueel te inspecteren op de afwezigheid van intacte DRG's. Verder aanwrijven totdat intact DRG niet meer worden gezien op het oog en / of zorgen voor langere incubatie in trypsine 37 ° C waterbad intact DRG's worden gescheiden. Om DRG neuronen beschermen tegen schade tijdens tritureren luchtbellen te voorkomen en te beperken trypsine digestie tot <30 min.
- Centrifuge buis met gedissocieerd DRG en trypsine bij 200 xg gedurende 3-5 minuten tot pellet te vormen. Spin langer indien nodig tot pellet gevormd.
- Aspireren trypsine zorgvuldig zonder verstoring van pellet. Voeg 2 ml van F12HS10 om neer te slaan. Zachtjes vermaal DRG met een P1000 pipet tip.
- Breng alle inhoud van 15 ml conische buis in 100 mm cultuur schotel. Spoel de buis met 8 ml F12HS10 en overbrengen naar de kweekschaal, 2 ml per keer voor een totaal van 10 ml. Deze spoelen stap helpt verzamelen cellen die kunnen zijn gebleven gehandeld op de wanden van de buis.
- Breng 100 mm kweekschaal (met 10 ml F12HS10 en gedissocieerde cellen DRG) in een bevochtigde 37 ° C incubator gedurende 3 uur.
OPMERKING: CO 2 is niet vereist omdat incubator HEPES buffer pH media bij afwezigheid van CO 2. Tijdens incubatie gliacellen binden aan het oppervlak van weefselkweek plastic en neuronen vaak losjes houden aan gliale bed.
4 Coating Acid Washeden Gebakken Coverslips met Laminin-1
- Dooi steriele monsters van bevroren laminin-1 op het ijs.
- Onder steriele omstandigheden, voeg 1 ml steriele PBS tot 1 x 50 pl aliquot van laminine-1.
- Gebruik een spectrofotometer om een absorptiewaarde van laminine-1 verkregen bij 280 nm. Gebruik deze waarde in de volgende vergelijking om de concentratie van laminine-1 te bepalen.
ABS 280 = (concentratie mg / ml) * (extinctiecoëfficiënt eiwit)
De extinctiecoëfficiënt voor laminin-1 is 0,86.
- Onder steriele omstandigheden verdunnen laminine-1 met 1X PBS aan de concentratie 1 mg / ml en 20 mg / ml te verkrijgen. Gebruik beide toegepaste concentraties van laminine-1 een tienvoudige verschil van laminine-1 na incubatie 7,8,10 gebonden aan het dekglaasje (30 ng / cm 2 en 300 ng / cm 2, respectievelijk) verkrijgt.
- In een laminaire stroming kap, gebruik fijne tang om een zuur gewassen en gebakken c plaatsenoverslip in de bodem van een 35 mm kweekschaal. Herhaal deze stappen het aantal benodigde schotels verkrijgen.
- Onderwerpen de dekglaasjes aan UV-licht voor 20-30 min om verder te zorgen voor sterilisatie. Houd schotel deksel eraf tijdens deze stap.
- Voeg 400 ul van voorbereide laminin-1 aan elk glas dekglaasje. Gebruik pipet tip om laminin-1 uitbreiden tot een volledige dekking van het dekglaasje te garanderen. Oppervlaktespanning zal laminine-1 op dekglaasje blijven en niet uitgespreid op bodem van kweekschaal die nodig.
- Plaats deksel op schaal en laat laminine-1 geïncubeerd voor 2-3 uur bij kamertemperatuur (3 uur is optimaal).
- Na laminin-1 incubatie, spoel dekglaasjes op aseptische wijze met steriel PBS in laminaire stroming kap. Verwijder oplossing dekglaasje en voeg 400 ul van PBS. Wacht 5-10 min. Herhaal dit voor een totaal van 3 spoelingen.
- Laat PBS op dekglaasje na de laatste spoeling. Niet breken de oppervlaktespanning tijdens het spoelen en niet toestaan coverslips uitdrogen. Leave deksel op tot het moment van plaat los neuronen op de coverlip.
5 Dissociatie, Verrijking, en het kweken van DRG neuronen - Deel 2
- Na incubatie in een 10 ml steriele pipet zachtjes spoelen onderaan 100 mm schotel met gescheiden DRG cellen. Houd gerecht bij ~ 45 ° hoek, trek ~ 7 ml F12HS10 met pipet hulp, dan voorzichtig te verdrijven 7 ml op ongeveer 1/3 van de schotel. Herhaal 5x, zachtjes loskomen neuronen.
- Draai schotel en herhaal spoelen procedure, voor nog eens zes spoelingen, op een ander 1/3 van de schotel. Herhaal de procedure opnieuw voor de resterende 1/3 van de schotel. Zo voorzichtig spoel de gehele onderkant van de schaal met F12HS10 neuronen verwijderen.
- Met behulp van dezelfde pipet F12HS10 bevattende neuronen van 100 mm schaal tot 15 conische buis. Centrifugeer gedurende 5-10 minuten bij 200 g om cellen te pelleteren.
- Verwijder F12HS10, waardoor pellet ongestoord. Resuspendeer pellet met 2 ml opgewarmd F12H + supplementen.
- Verdun cellen nodig voorzien F12H + supplementen gewenste plating concentratie (120.000 cellen / ml voor dekglaasjes bekleed met 1 ug / ml laminine-1 en 40.000 cellen / ml voor dekglaasjes bekleed met 20 ug / ml laminine-1, 8,16) te verkrijgen.
- Verwijder de PBS uit laminine beklede dekglaasjes normaal en plaats 400 pl van cellen op dekglaasjes. Overdragen schotel voorzichtig een bevochtigde 37 ° C celkweek incubator. Laat incuberen gedurende ten minste 1 uur en tot 3 uur om neuronen te houden aan laminine-1.
- Onder steriele omstandigheden, zachtjes overspoelen 35 mm gerechten bevattende neuronen met 1,6 ml van F12H + supplementen.
Opmerking Momenteel oppervlaktespanning op dekglaasje kan worden ingeslagen. Neuronen hebben adequaat gehandeld op laminin-1 op dekglaasje. - Terugkeren cellen incubator en incubeer overnacht. Experimenten uitvoeren zoals immuuncytochemie de volgende dag.
6 Immunocytochemistry
- Vóór immunocytochemie, warm fixatief (4% paraformaldehyde, 30% sucrose 2X PBS) bij 37 ° C waterbad.
OPMERKING: Voor de vaststelling van de cellen, te behandelen met verschillende reagentia, zoals netrine-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaphorines en ephrin 16,29-31. - Verwijder langzaam 1 ml van de 2 ml F12H + supplementen van kweekschaal. Voeg voorzichtig 1 ml opgewarmd fixeeroplossing. Laat incuberen bij kamertemperatuur gedurende 10-15 minuten.
- Verwijder voorzichtig fixatief oplossing en voeg 2 ml PBS. Solliciteer oplossing richting de rand van de schaal, het vermijden van mogelijke loskomen van vaste cellen als gevolg van toepassing van PBS. Incubeer bij kamertemperatuur gedurende 5 minuten.
- Herhaal PBS wassen voor een totaal van 5 wasbeurten. Sta niet toe dat cellen drogen tijdens elke stap van immunocytochemie.
- Verwijder PBS. Breng 1 ml blokkeeroplossing (0,1% Triton-X, 1X PBS, 5% normaal geit serum). Incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd. U kunt ook aan de oppervlakte moleculen vlekken, Weet Triton-X niet in het blokkeren oplossing 8.
- Verdunnen primaire antilichamen in het blokkeren oplossing per aanbeveling fabrikant. Gebruik 1: 500 voor antilichamen tegen NCAM en geactiveerd β1 integrines 16. Verwijder de blokkerende oplossing, 1 ml primair antilichaam oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur of overnacht bij 4 ° C.
- Verwijder primaire antilichaam oplossing en 2 ml 1X PBS. Incubeer gedurende 5-10 minuten bij kamertemperatuur. Herhaal dit voor een totaal van 4 PBS wasbeurten. Wasbeurten kan worden verlengd, indien nodig.
- Verdun secundair antilichaam 1: 1000 in blokkeeroplossing. Verwijder PBS, 1 ml secundair antilichaam oplossing en incubeer gedurende 1 uur bij kamertemperatuur geroerd.
OPMERKING: secundaire antilichamen zijn lichtgevoelig. Een oplossing en cellen in het donker zoveel mogelijk vanaf dit moment. - Verwijder secundair antilichaam en spoel 5x met 1x PBS zoals eerder gedaan.
- Solliciteer ~ 60-80 pi FluoromountG op een microscoopglaasje. Met behulp van fijne tang, til dekglaasje uit schotel en lagere dekglaasje in Fluoromount G op objectglaasje. Vermijd luchtbellen.
- Bewaren schuift horizontaal bij 4 ° C in het donker. Na 12-24 uur, zal Fluormount G polymeriseren en dekglaasje zal stevig worden bevestigd aan de microscoop dia. Image cellen na deze polymerisatiestap is voltooid.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De hier beschreven protocol stelt onderzoekers cultuur een verrijkte populatie van gedissocieerde embryonale sensorische neuronen met zeer weinig (bijvoorbeeld <5%) van niet-neuronale cellen 7,8,10,16. Tal van DRG's kan worden verkregen bij de lumbosacrale, thoracale en cervicale regio. Afhankelijk van de behoeften van de onderzoeker, kunnen DRG's van deze verschillende anatomische gebieden gemakkelijk worden geïsoleerd. Bijvoorbeeld, Figuur 1 toont beelden van het kippenembryo via verschillende stadia van dissectie met de lumbale DRG gemarkeerd in Figuren 1C en 1D en thoracale DRG in figuren 1E en 1F.
Gekweekte cellen worden gemakkelijk gelabeld door immunocytochemie. Hier worden gekweekte cellen immunologisch met antilichamen tegen β1 integrine en NCAM (figuur 2). Verrassend genoeg hebben we in staat om fluorescentiekleuring visualiseren voor maximaal een jaar geweest na dezeICC procedures, als de horizontale objectglaasjes werden bewaard bij 4 ° C en in het donker. De levensduur van de ICC vlekken moet worden bepaald door de gebruiker en per antilichaam.
Afhankelijk van de dichtheid van neuronen kan groei kegels aan de uiteinden van neurieten uitbreiding worden gevisualiseerd (Figuren 2D-2F). Neuronen uitgeplaat bij 40.000 en 120.000 cellen / ml op dekglaasjes bekleed met 20 ug / ml en 1 ug / ml laminine-1 respectievelijk hebben talrijke vrij neurieten tot 26 uur na plating. Deze culturen kunnen worden gebruikt voor specifiek analyseren groei kegels naast analyse van de gehele neuron. Eerder werd deze procedure toegepast om de groei cone snelheid en gedrag, zoals groei cone instorten 8,9,11,13,16 evalueren. Lagere plating dichtheden op deze dekglaasjes resulteert in dode neuronen die niet worden gehouden aan de ondergrond. De exacte juiste dichtheid nodig is voor elk experiment moet worden geoptimaliseerd per onderzoeker.
Figuur 1 Fasen van embryonale kuiken dissectie aan DRG verkrijgen. A) kippenembryo liggend op de dorsale zijde. Het hart (H) vleugels (W) en benen (L) zijn voorzien. De bovenkant van het beeld naar het hoofd, of beter (S). De onderkant van het beeld naar de staart, of inferieur (I). R = rechts van dierlijke, L = links van dieren. Alle volgende afbeeldingen in dezelfde richting. B) De interne organen zijn verwijderd uit het embryo in A. De wervelkolom wordt ribben en DRG gezien. Voor de eenvoud, een rib is gelabeld, drie representatieve DRG's zijn image Zelfde kippenembryo geïdentificeerd door zwarte cirkels en de thoracale en lumbale wervelkolom wordt bestempeld. C) als B met een grijze doos identificeren van de regio getoond op highaar vergroting in D. D) Hogere vergroting van de lumbale wervelkolom (VC) regio. Drie van de elf DRG's in deze weergave worden aangeduid met gestippelde cirkels. DRG's zijn rond en ingekapseld. Deze functies maken het gemakkelijk om intact DRG's te verkrijgen met een pincet. E) een kippenembryo na het verwijderen van de inwendige organen en de ventrale helft van de thoracale wervelkolom. Grijs vakje geeft regio getoond bij hogere vergroting in F. F) Ruggenmerg (SC) is te zien in de regio waar de wervelkolom is verwijderd. Tegen de onderzijde van het beeld, de lumbale wervelkolom (VC) nog intact. 3 van 10 DRG's worden geïdentificeerd met onderbroken cirkels. DRG's worden gevonden tussen elke set van ribben.
Figuur 2 Gekweekte primaire sensorische neuronen immunolabeled voor NCAM en β1 integrines. Chick DRG neuronen gekweekt op hoge concentraties van laminine-1 zijn immunopositive voor NCAM (A) en β1 integrine (B). C) samengevoegd beeld van twee vlekken onthult meeste cellen zijn positief voor zowel NCAM en β1 integrine. Deze aviaire sensorische neuronen immunopositive voor beide markers. Er is een cel, aangegeven met een asterisk die NCAM negatieve en positieve β1 integrine, in overeenstemming met een niet-neuronale cel. DF) Hogere vergroting van gekweekte sensorisch neuron toont neurieten uitstrekken vanaf het cellichaam. D) Inzet in wit box toont een grotere vergroting van groeikegel aan het uiteinde van neurieten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Hier presenteren wij gedetailleerde protocollen voor het isoleren en kweken los sensorische neuronen van een kippenembryo. Deze procedure genereert een verrijkte populatie van stevig groeiende neuronen in vitro 7,8,10,16. Vele cellulaire en moleculaire technieken kunnen worden toegepast op deze gekweekte neuronen, waaronder immunocytochemie, die hier wordt beschreven. Dit protocol werd onlangs gebruikt om de intensiteit van immunologisch actieve integrinen sensorische groei kegels 8,16 kwantitatief beoordelen. In deze eerdere studies werd een programma waarmee een contour van het distale uiteinde 20 micron van de groeikegel nauwkeurig maken. De omtrek gemaakt, gebaseerd op NCAM kleuring. De alomtegenwoordige expressie van NCAM in neuronen kon de software de gehele groeikegel dan een beperkt deel van de groeikegel identificeren. Deze groei kegel schets werd vervolgens geïdentificeerd als een regio van belang en de integrine kleuringsintensiteit binnen die regiop plaats werd bepaald door de software. Op deze wijze kan de intensiteit van een eiwit van belang eenvoudig worden gemeten in een bepaald gebied in gekweekte sensorische neuronen.
Om betrouwbare resultaten te verkrijgen, worden de volgende aanbevelingen ontvangen. Controleer eerst of dekglaasjes goed worden gewassen met water na HCl incubatie in stappen 1,4-1,6. Anders zullen moleculen zoals laminine-1 niet goed dispergeren op het dekglaasje. Tweede, bevestigen dat DRG adequaat kunnen worden gescheiden (stap 3.5) na trypsine spijsvertering, anders klonten van cellen zal vormen en dit zal neuronale zuiverheid afnemen. Ten derde is het optimaal om DRG cellen in stap 3.9 incubeer volledige 3 uur tot een zuiverder populatie van neuronen te verkrijgen. Als dit incubatiestap wordt verkort, verlaag spoelstappen 5.1 en 5.2 het aantal niet-neuronale cellen die losgemaakt bij een kortere incubatietijd beperken. Vierde, ervoor zorgen dat de oppervlaktespanning wordt gehandhaafd, terwijl de toepassing laminin-1 en dissobehorende neuronen de dekglaasjes. Als oppervlaktespanning wordt verloren, zal de oplossing verder reiken dan het dekglaasje en droog. Dit zal de neuronen doodt. Vijfde, optimale celdichtheid dient te worden bepaald door elke onderzoeker. Eerdere studies hebben uitgeplaat 120,00 neuronen / ml en 40.000 neuronen / ml op dekglaasjes bedekt met 1 ug / ml laminine-1 en 20 ug / ml laminine-1, respectievelijk 8,16. Deze concentratie is laag genoeg om de onderzoekers vrije axon uiteinden (eindes die nog niet verbonden waren met een ander neuron) te bestuderen. Zesde, tijdens immunocytochemie, zeker om voorzichtig te spoelen cellen. Het verwijderen of het toepassen van oplossingen te snel kan neuronen van het dekglaasje te verjagen.
Beperkingen van deze procedure onder meer de wat-beperkt tijdvenster van chick DRG dissectie. DRG's kunnen eenvoudig worden verkregen uit embryonale dag (E) 7-10 kippenembryo's. Hoewel het mogelijk is DRG eerder dan E7 verkrijgen, is het enigszins moeilijk. Na E11, more kraakbeen transitions bot en dit maakt het moeilijker dissectie. Zo zou studies die gericht vergelijken embryonale versus volwassen neuronen niet ideaal voor deze chick model echter eerdere studies gebruikt de rat model voor leeftijd vergelijking in DRG 32. Opgemerkt zij dat rat DRG dissectie duurder, minder robuust en technisch moeilijker dan chick. Een ander punt van overweging is de mogelijkheid van gekweekte embryonale DRG neuronen overstappen tijd in cultuur. Bijvoorbeeld, deze sensorische neuronen tot expressie verschillende receptoren binnen 48 uur afhankelijk van de aanwezigheid van geselecteerde neurotrofinen 2,30.
Twee subklassen van DRG neuronen kunnen worden verrijkt met behulp van selectieve neurotrofinen in de media 2,12,30. Bijvoorbeeld, zenuwgroeifactor (NGF) en neurotrofine-3 (NT3) steunen vooral de overleving van cutane en proprioceptieve neuronen, respectievelijk 33. De media in dit experiment zowel NGF en NT3Echter kan gemakkelijk worden aangepast voor het selecteren van ofwel cutane of proprioceptieve sensorische neuronen.
Gedistantieerd neuronen zijn vatbaar voor tal van live-imaging technieken waaronder timelapse verbeelding van groeikegel beweeglijkheid en calcium beeldvorming. De media hier gebruikt is voordelig voor live cell imaging omdat zij geen CO2 gedurende pH buffering van het medium vereist. Aldus kunnen gegevensverzameling door levende cellen wordt uitgevoerd op een microscoop met verwarmde fase maar handhaving van voldoende CO 2 niveau vereisen. Groeikegel snelheid instorten 8,16,30 en calcium niveaus 17 werden onderzocht in levende kuiken primaire sensorische neuronen geïsoleerd met de hier beschreven techniek. Daarnaast kunnen RNAi succes eiwitniveaus in gekweekte chick DRG neuronen 34 verlagen.
Inzichten uit welomschreven in vitro modellen kunnen worden gebruikt als een essentiële basis om experimenten te ontwerpenin een in vivo model. bijvoorbeeld verschillende benaderingen werden toegepast in de Silver lab 35 axon uitgroei te stimuleren in een in vitro model van de gliale litteken. Van de verschillende reagentia in vitro getest kon slechts twee (ontsteking inductie en digestie van chondroïtinesulfaat proteoglycanen) axon regeneratie bevorderen. Interessant is dat een combinatie van deze twee behandelingen in vivo gestimuleerde dramatische en functionele axon regeneratie in het ruggenmerg 35. In dit geval, de in vitro experimenten leverden een belangrijk middel om snel te screenen op reagentia die axon uitgroei toegenomen. De reagentia die met succes gepromoot axon groei in vitro bleek ook succesvol in vivo, die verder ondersteunt de waarde van celcultuur experimenten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
We willen graag Alison Philbrook, Belinda Barbagallo en Michael Francis bedanken voor inzichtelijke reacties op dit papier. Onderzoek gemeld in deze publicatie werd ondersteund door een R15 AREA award 1R15NS070172-01A1 toegekend aan MLL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
References
- Millet, L. J., Gillette, M. U. Over a century of neuron culture: from the hanging drop to microfluidic devices. The Yale journal of biology and medicine. 85, 501-521 (2012).
- Guan, W., Puthenveedu, M. A., Condic, M. L. Sensory neuron subtypes have unique substratum preference and receptor expression before target innervation. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 23, 1781-1791 (2003).
- Kapitein, L. C., Hoogenraad, C. C. Which way to go? Cytoskeletal organization and polarized transport in neurons. Molecular and cellular neurosciences. 46, 9-20 (2011).
- Kapitein, L. C., Yau, K. W., Hoogenraad, C. C. Microtubule dynamics in dendritic spines. Methods in cell biology. 97, 111-132 (2010).
- Snow, D. M. Pioneering studies on the mechanisms of axonal regeneration. Developmental neurobiology. 71, 785-789 (2011).
- Melli, G., Hoke, A. Dorsal Root Ganglia Sensory Neuronal Cultures: a tool for drug discovery for peripheral neuropathies. Expert opinion on drug discovery. 4, 1035-1045 (2009).
- Condic, M. L., Letourneau, P. C. Ligand-induced changes in integrin expression regulate neuronal adhesion and neurite outgrowth. Nature. 389, 852-856 (1997).
- Lemons, M. L., Condic, M. L. Combined integrin activation and intracellular cAMP cause Rho GTPase dependent growth cone collapse on laminin-1. Experimental neurology. 202, 324-335 (2006).
- Beller, J. A., et al. Comparison of sensory neuron growth cone and filopodial responses to structurally diverse aggrecan variants, in vitro. Experimental neurology. 247, 143-157 (2013).
- Condic, M. L., Snow, D. M., Letourneau, P. C. Embryonic neurons adapt to the inhibitory proteoglycan aggrecan by increasing integrin expression. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 19, 10036-10043 (1999).
- Lemons, M. L., Barua, S., Abanto, M. L., Halfter, W., Condic, M. L. Adaptation of sensory neurons to hyalectin and decorin proteoglycans. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 4964-4973 (2005).
- Guan, W., Condic, M. L. Characterization of Netrin-1, Neogenin and cUNC-5H3 expression during chick dorsal root ganglia development. Gene Expr Patterns. 3, 369-373 (2003).
- Guan, W., Wang, G., Scott, S. A., Condic, M. L. Shh influences cell number and the distribution of neuronal subtypes in dorsal root ganglia. Developmental biology. 314, 317-328 (2008).
- Kolpak, A., Zhang, J., Bao, Z. Z. Sonic hedgehog has a dual effect on the growth of retinal ganglion axons depending on its concentration. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 3432-3441 (2005).
- Kolpak, A. L., et al. Negative guidance factor-induced macropinocytosis in the growth cone plays a critical role in repulsive axon turning. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 10488-10498 (2009).
- Lemons, M. L., et al. Integrins and cAMP mediate netrin-induced growth cone collapse. Brain research. 1537, 46-58 (2013).
- Snow, D. M., Atkinson, P. B., Hassinger, T. D., Letourneau, P. C., Kater, S. B. Chondroitin sulfate proteoglycan elevates cytoplasmic calcium in DRG neurons. Developmental biology. 166, 87-100 (1994).
- Snow, D. M., Brown, E. M., Letourneau, P. C. Growth cone behavior in the presence of soluble chondroitin sulfate proteoglycan (CSPG), compared to behavior on CSPG bound to laminin or fibronectin. Int J Dev Neurosci. 14, 331-349 (1996).
- Snow, D. M., Lemmon, V., Carrino, D. A., Caplan, A. I., Silver, J. Sulfated proteoglycans in astroglial barriers inhibit neurite outgrowth in vitro. Experimental neurology. 109, 111-130 (1990).
- Snow, D. M., Letourneau, P. C. Neurite outgrowth on a step gradient of chondroitin sulfate proteoglycan (CS-PG). Journal of neurobiology. 23, 322-336 (1992).
- Snow, D. M., Mullins, N., Hynds, D. L. Nervous system-derived chondroitin sulfate proteoglycans regulate growth cone morphology and inhibit neurite outgrowth: A light, epifluorescence, and electron microscopy study. Microsc Res Tech. 54, 273-286 (2001).
- Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning. Neuron. 1, 791-803 (1988).
- Firnhaber, C., Hammarlund, M. Neuron-specific feeding RNAi in C. elegans and its use in a screen for essential genes required for GABA neuron function. PLoS genetics. 9, e1003921 (2013).
- Hamburger, V., Hamilton, H. L. A series of normal stages in the development of the chick embryo. 1951. Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists. 195, 231-272 (1992).
- Hollyday, M. Chick wing innervation. I. Time course of innervation and early differentiation of the peripheral nerve pattern. The Journal of comparative neurology. 357, 242-253 (1995).
- Hollyday, M., Morgan-Carr, M. Chick wing innervation. II. Morphology of motor and sensory axons and their growth cones during early development. The Journal of comparative neurology. 357, 254-271 (1995).
- Honig, M. G., Kueter, J. The expression of cell adhesion molecules on the growth cones of chick cutaneous and muscle sensory neurons. Developmental biology. 167, 563-583 (1995).
- Tosney, K. W., Landmesser, L. T. Development of the major pathways for neurite outgrowth in the chick hindlimb. Developmental biology. 109, 193-214 (1985).
- Dontchev, V. D., Letourneau, P. C. Nerve growth factor and semaphorin 3A signaling pathways interact in regulating sensory neuronal growth cone motility. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 22, 6659-6669 (2002).
- Munoz, L. M., et al. Ephrin-A5 inhibits growth of embryonic sensory neurons. Developmental biology. 283, 397-408 (2005).
- Roche, F. K., Marsick, B. M., Letourneau, P. C. Protein synthesis in distal axons is not required for growth cone responses to guidance cues. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 29, 638-652 (2009).
- Condic, M. Adult neuronal regeneration induced by transgenic integrin expression. Journal of Neuroscience. 21, 4782-4788 (2001).
- Hory-Lee, F., Russell, M., Lindsay, R. M., Frank, E. Neurotrophin 3 supports the survival of developing muscle sensory neurons in culture. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 2613-2617 (1993).
- Toyofuku, T., et al. FARP2 triggers signals for Sema3A-mediated axonal repulsion. Nature neuroscience. 8, 1712-1719 (2005).
- Steinmetz, M. P., et al. Chronic enhancement of the intrinsic growth capacity of sensory neurons combined with the degradation of inhibitory proteoglycans allows functional regeneration of sensory axons through the dorsal root entry zone in the mammalian spinal cord. The Journal of neuroscience : the official journal of the Society for Neuroscience. 25, 8066-8076 (2005).
