Summary
Modelli di coltura cellulare forniscono un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e quindi forniscono una potente piattaforma per chiarire numerosi aspetti della biologia delle cellule neuronali. Descriviamo un metodo rapido, economico e affidabile per isolare, dissociare, e la cultura neuroni sensoriali da embrioni di pollo. Sono forniti anche i dettagli di preparazione substrati e immunocitochimica.
Abstract
I neuroni sono cellule poliedriche che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, movimento del motore, l'apprendimento e la memoria. Studiare i neuroni in vivo può essere difficile a causa della loro complessità, i loro ambienti diversi e dinamici, e limitazioni tecniche. Per queste ragioni, studiando i neuroni in vitro può rivelarsi utile per svelare i complessi misteri di neuroni. Il carattere ben definito di modelli di coltura cellulare fornisce un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e variabili. Qui si descrive come isolare, dissociare, e la cultura neuroni primari di embrioni di pollo. Questa tecnica è rapido, poco costoso, e genera robusta crescita neuroni sensoriali. La procedura produce costantemente le culture che sono altamente arricchito per i neuroni e ha pochissime cellule non neuronali (meno del 5%). Neuroni primari non aderiscono bene al vetro non trattato o di un tessuto culturale di plastica, quindi le procedure dettagliate per la creazione di due distinct, ben definito substrati-laminina contenente per la placcatura neuronale sono descritti. Neuroni in coltura sono altamente suscettibili di molteplici tecniche cellulari e molecolari, tra cui co-immunoprecipitazione, immaginare cellule vive, RNAi, e immunocitochimica. Procedure per doppia immunocitochimica su questi neuroni in coltura sono state ottimizzate e qui descritto.
Introduction
I neuroni sono cellule complesse che portano le informazioni essenziali per una varietà di funzioni, tra cui la sensazione, visione, movimento del motore, l'apprendimento e la memoria. Unico da altri tipi di cellule, i neuroni si estendono i processi braccio-come, chiamate assoni, per formare autostrade neurali essenziali per la comunicazione. Durante lo sviluppo specializzata vani situati alle estremità degli assoni in crescita, chiamati coni di crescita, navigare attraverso un concerto di segnali extracellulari per condurre l'assone alla sua destinazione appropriata. I meccanismi molecolari complessi che sono alla base della crescita del cono di navigazione non sono pienamente compresi. Per comprendere meglio questi meccanismi, i ricercatori hanno utilizzato modelli di coltura cellulare per studiare i neuroni in vitro un ambiente definito e semplificato. Studiare i neuroni in coltura 1 ha portato a significativi progressi nella nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali tra cui: la differenziazione neuronale 2, la dinamica del citoscheletro, endocitosi e traffico, dendriteregolazione 3,4, la rigenerazione assonale 5, e delle condizioni cliniche, come neuropatie 6. Inoltre, i neuroni in coltura sono altamente suscettibili di una vasta gamma di tecniche di ricerca tra cui immunocitochimica, cellulare superficie co-immunoprecipitazione, Western blot, trasfezione, RNAi, e l'imaging dal vivo come l'analisi Timelapse del cono di crescita motilità. Così, coltura neuroni primari è un approccio potente per chiarire numerosi aspetti della biologia cellulare dei neuroni.
Il modello di coltura cellulare fornisce investigatori con un controllo dettagliato sulle condizioni ambientali e variabili. Ad esempio, il substrato su cui sono placcati neuroni (e crescono su) può essere facilmente manipolato. Qui, forniamo istruzioni dettagliate per la generazione di due substrati distinti, uno con una bassa concentrazione laminina-1 e l'altro con saturazione concentrazioni di laminina-1. Sorprendentemente, concentrazioni diverse di una stessa molecola può avere effetti drammaticisullo stato interno dei neuroni e la loro composizione superficie cellulare. Ad esempio, i livelli intracellulari di cAMP e superficiali livelli di integrine sono significativamente differenti nei neuroni placcato su questi due substrati 7,8. Ulteriori studi hanno dimostrato che altre molecole, comprese fibronectina e proteoglicani condroitin solfato, impatto l'espressione di molecole di superficie cellulare e motilità neuronale 7-11. Inoltre, molecole solubili quali neurotrofine e neurotropins concernono anche la composizione della membrana cellulare e motilità neuronale 12-16 e può essere facilmente e accuratamente manipolata in un modello di coltura cellulare.
Qui, descriviamo i metodi per isolare e cultura dissociate neuroni sensoriali provenienti da embrioni di pollo. Questa procedura è stata utilizzata per fare progressi significativi nella neurobiologia, tra cui l'estensione assonale 5,7,8,10,11,16-21 ed è stato modificato da una procedura volta a isolare le cellule gangliari 22. Ci sonodiversi vantaggi di questo approccio. In primo luogo, molte caratteristiche del pulcino ganglio della radice dorsale (DRG) sviluppo sono ben caratterizzati compreso il periodo di tempo per la nascita, l'estensione assonale, e profili di espressione proteica 2,23-28, fornendo così una base istruttivo su cui costruire informativo in esperimenti in vitro. In secondo luogo, dissociate colture neuronali consentono al ricercatore di studiare più direttamente i neuroni rispetto ad approcci alternativi utilizzando espianti intatti DRG (che contengono i neuroni e le cellule non neuronali) e / o colture miste contenenti sia i neuroni dissociati e le cellule non neuronali. In terzo luogo, la procedura qui descritta è semplice, poco costoso e suscettibile di studenti. Pertanto, questa tecnica può essere utilizzata per la ricerca e per scopi didattici. Inoltre, le variazioni minori di questo protocollo dovrebbe permettere di purificazione veloce, ad alto rendimento di neuroni da fonti diverse DRG. Ad esempio, questa procedura può essere modificata per fornire neuronally enrculture iched da altri tessuti come il prosencefalo embrionale o del midollo spinale.
Protocolli Immunocitochimica sono stati ottimizzati per queste colture neuronali dissociate e sono descritte in dettaglio qui. È prevista la procedura di doppia immunocitochimica contro la molecola di adesione neurale cellulare (NCAM) e integrine β1. I dati generati da questi metodi di immunocitochimica sono stati utilizzati per esaminare il patterning spaziale e l'intensità di diverse molecole nei neuroni in coltura 8,16.
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Protocol
1 Coverslip Preparazione: lavaggio acido e Bake
- Almeno 2 giorni prima della dissezione (punto 2), iniziare la seguente procedura per preparare vetrini. Eseguire la fase di lavaggio acido per rimuovere oli e coprioggetto accuratamente puliti.
- Coprioggetto carico di titolare di porcellana che posiziona verticalmente coprioggetto e impedisce loro di toccarsi. Immergere porta e coprioggetto in un contenitore di vetro riempito con istologia 2 M di acido cloridrico (HCl). In alternativa, se titolare di porcellana non è disponibile, si sviluppa ~ 20 coprioggetto orizzontalmente per coprire il fondo di 100 mm vetro piastra di Petri e immergere coprioggetto in 2 M HCl.
- Collocare recipiente di vetro (con coprioggetto sommerse in acido) sulla tabella rocker in cappa e permettere dolce dondolo per almeno 5 ore a temperatura ambiente. In alternativa, lavaggio acido coprioggetto durante la notte nelle stesse condizioni.
- Lavare coprioggetto con H 2 O distillata (dH 2 O) trasferendo titolare porcellana caricatocon coprioggetto da 2 M HCl a un contenitore di istologia di vetro pulito riempito con dH 2 O. In alternativa, decantare 2 M HCl da vetro piatto di Petri con coprioggetto e riempire con dH 2 O.
- Lavare per decantazione nuovo dH 2 O e ricarica vaso di vetro con fresca dH 2 O. Ripetere per un totale di 3 lavaggi rapidi.
- Inizia regime di lavaggio più restituendo recipiente di vetro (con coprioggetto e dH 2 O) sul bilanciere. Lasciare per agitazione per 10-30 minuti a temperatura ambiente. Poi, decantare dH 2 O e aggiungere dH fresco 2 O. Ripetere per un totale di almeno dieci lavaggi. In alternativa, continuare il lavaggio durante la notte.
- Mettere coprioggetto lavati in forno preriscaldato a 350 ° C. Se si utilizza supporto di porcellana, rimuovere il supporto da dH 2 O contenitore di vetro riempito e poi posto supporto con coprioggetti direttamente nel forno. Se si utilizza una capsula di Petri di vetro, decantare dH 2 O e posizionare il piatto di vetro con lamelle in furnace.
- Cuocere lamelle per almeno cinque ore o durante la notte a 350 ° C.
- Dopo la cottura, rimuovere coprioggetto dal supporto di porcellana con pinza sottile e riporre in sterile 100 millimetri di vetro piatto di Petri. Lascia coprioggetto che non sono stati originariamente inseriti nel supporto di porcellana nella scatola di Petri di vetro.
2. Chick Dissezione e isolamento dei DRG
- Rimuovere fertile, messo in scena Bianco Livorno pulcino uovo da incubatrice (tenutasi a 37-38,5 ° C con dolce dondolio).
NOTA: Studi precedenti hanno utilizzato il giorno embrionale 7-10 per l'isolamento di DRG 2,8,11-13,16. - Mettere l'uovo selezionato in cappa a flusso laminare. Condurre tutte le procedure elencate di seguito in condizioni asettiche in cappa a flusso laminare con soluzioni e strumenti sterili. Pre-caldo tutte le soluzioni in un bagno di 37 ° C Acque.
- Crack uovo e posizionare il contenuto in un 100 millimetri piastra di Petri di plastica. Utilizzare pinze standard per il trasferimento di embrioni in un altro piatto di Petri a 100 mm.
- Aggiungi F12HS10 caldo (F12 di Ham, HEPES 10 mM, 100 unità / ml di penicillina, 0,1 mg / 10% di siero fetale bovino ml streptomicina,) per Piatto con pipetta Pasteur per mantenere il tessuto umido. Utilizzare pinze per posizionare embrione sul suo lato dorsale (Figura 1A).
- Mettere 100 millimetri in plastica piastra di Petri contenente tessuto embrionale su un microscopio da dissezione stereovisione binoculare in cappa a flusso laminare. Utilizzare una pinza sottile per fare una incisione verticale mediana dalla coda alla nuca pizzicando il derma in via di sviluppo per esporre il cuore, polmoni e altri organi. In alternativa, fare una serie di piccoli strappi per esporre gli organi interni.
- Utilizzano delicatamente 2 set di sterili pinza sottile a: a) cogliere il collo e b) cogliere l'aorta o di altri tessuti immediatamente superiore al cuore e tirare verso la coda,sviscerare l'animale.
- Applicare F12HS10 caldo con pipetta Pasteur al tessuto. Usare pinze per rimuovere eventuali cardiovascolari, organi respiratori o digestivi rimanenti per esporre le costole in via di sviluppo, la colonna vertebrale e DRG (Figure 1B-1D).
- Sotto il microscopio da dissezione, utilizzare una pinza sottile per rimuovere ulteriormente gli organi e raccogliere DRG lungo entrambi i lati della colonna vertebrale lombare, inferiore alle costole. Raccogliere DRG pizzicando DRG intatti dall'embrione. Afferrare e recidere le radici che arrivano dalla DRG verso il midollo spinale e afferrare il nervo in via di sviluppo che arriva dal DRG verso la periferia o viceversa.
- Mettere DRG intatti in un piatto di cultura 35 millimetri pieno di F12HS10 caldo. Rimuovere qualsiasi tessuto in eccesso, come la dorsale o delle radici ventrali che possono aver aderito a DRG, dai DRG intatte in piastra da 35 mm da pizzicare con una pinza sottile.
- Per ottenere DRG superiori alla regione lombare, rimuovere la metà ventrale del torace e Cervical colonna vertebrale. Ciò avviene effettuando un taglio sulla colonna vertebrale sviluppo perpendicolare all'asse del midollo spinale nella regione cervicale superiore e un altro taglio nella regione lombare superiore. Quindi, fare tagli paralleli all'asse del midollo spinale lungo il lato destro e sinistro della colonna vertebrale. Sollevare la parte ventrale della colonna vertebrale dall'embrione, che espone i espone il midollo spinale (Figure 1E-1F).
- Per consentire un facile accesso ai DRG, rimuovere il midollo spinale toracico e cervicale afferrando il midollo spinale con una pinza sottile. Utilizzare le pinze per sollevare il midollo spinale dalla colonna vertebrale. In prima approssimazione, il midollo spinale toracico è a livello di nervature e la zona cervicale è superiore alle costole.
- Raccogliere toracica intatta e DRG cervicali con una pinza sottile e metterli in F12HS10 caldo con altri DRG. Rimuovere il tessuto in eccesso che possono aderire a DRG.
- Risciacquare interno di una nuova pipetta Pasteur di vetro con F12HS10 per aiutareimpedire DRG di attaccarsi alle pareti della pipetta. Utilizzare la pipetta sciacquati per trasferire tutti i DRG e F12HS10 dalla piccola scatola di Petri in un tubo da 15 ml sterile e procedere immediatamente al punto 3.
NOTA: Ulteriori embrioni possono essere sezionati per aumentare il numero di DRG. DRG devono essere tenuti in F12HS10 a 37 ° C fino al momento per il passo 3.
3 Dissociazione, Arricchimento, e Coltura DRG neuroni - Parte 1
- Luogo tubo conico con DRG intatti in centrifuga e delicatamente girare (200 xg) per 2-3 minuti. Verificare che DRG hanno affondato al fondo della provetta. In caso contrario, far girare nuovamente.
- Utilizzando una pipetta, rimuovere delicatamente F12HS10, lasciando DRG pellet indisturbati. Aggiungere 2 ml di 1x calcio e magnesio libero (CMF) PBS, staccare il pellet di DRG. Spin di nuovo e rimuovere CMF PBS lasciando intatto il pellet DRG. Ripetere questa operazione di lavaggio per un totale di tre lavaggi per rimuovere siero fetale bovino in F12HS10, che potrebbero interferire con la digestione tripsina in fase successiva.
- Aggiungere 2 ml di tripsina riscaldato a tubo da 15 ml contenente 2 ml di PBS CMF e DRG. Collocare il tubo nel 37 ° C bagnomaria per 10-15 minuti a digerire DRG in cellule dissociate.
- Durante l'incubazione, far F12H + supplemento contenente i media (F12 di Ham, 10 mM HEPES 100 unità / ml di penicillina, 0,1 mg / ml di streptomicina, 10 ng / ml NT3, 10 ng / ml NGF, 200 mm L-glutammina e N2) e caldo a 37 ° C bagnomaria. Tipicamente, 10 ml di media totale è sufficiente per 4-5 35 millimetri piatti di neuroni sensoriali primari. Anche cominciare scongelamento laminina-1 per coprioggetto rivestimento (punto 4).
- DRG delicatamente triturare in soluzione di tripsina con p1000 pipetta ed ispezionare visivamente l'assenza di DRG intatti. Continuare triturazione fino DRG intatti non sono più visti da occhi e / o consentire più a lungo di incubazione tripsina a 37 ° C fino a bagnomaria DRG intatti sono dissociate. Per proteggere i neuroni DRG da danni, evitare bolle d'aria durante la triturazione e limitare tripsina digestione a <30 min.
- Centrifuge provetta contenente DRG dissociate e tripsina a 200 xg per 3-5 minuti per formare pellet. Spin più a lungo se necessario fino a quando si forma pellet.
- Attenzione aspirare tripsina senza interrompere pellet. Aggiungere 2 ml di F12HS10 a pellet. Triturare delicatamente DRG con una punta p1000 pipetta.
- Trasferire tutti i contenuti di tubo da 15 ml in 100 mm piatto di cultura. Sciacquare il tubo con 8 ml F12HS10 e trasferirlo al piatto cultura, 2 ml alla volta per un totale di 10 ml. Questo passaggio risciacquo aiuta raccogliere cellule che possono essere rimaste aderito alle pareti del tubo.
- Mettere 100 mm piatto cultura (10 ml F12HS10 e dissociato cellule DRG) in un umidificata 37 ° C incubatore per 3 ore.
NOTA: CO 2 non è richiesto in incubatrice perché HEPES tampona il pH dei media, in assenza di CO 2. Durante l'incubazione, le cellule gliali si legano alla superficie del tessuto della cultura plastica e neuroni tendono ad aderire liberamente a letto gliale.
4 Acid Washed rivestimentoe vetrini al forno con laminina-1
- Scongelare aliquote sterili di laminina-1 congelato sul ghiaccio.
- In condizioni sterili, aggiungere 1 ml di PBS sterile 1x a 50 ml un'aliquota di laminina-1.
- Utilizzare uno spettrofotometro per ottenere un valore di assorbanza di laminina-1 a 280 nm. Utilizzare questo valore nella seguente equazione per determinare la concentrazione di laminina-1.
ABS 280 = (concentrazione mg / ml) * (coefficiente di estinzione di proteina)
Il coefficiente di estinzione per laminina-1 è 0.86.
- In condizioni sterili, diluire laminina-1 con PBS 1X per ottenere le concentrazioni di 1 mg / ml e 20 mg / ml. Utilizzare questi due concentrazioni di laminina-1 applicati per ottenere una differenza di dieci volte della laminina-1 legata alla coprioggetto (30 ng / cm 2 e 300 ng / cm 2, rispettivamente) dopo incubazione 7,8,10.
- In una cappa a flusso laminare, utilizzare una pinza sottile per posizionare una lavata con acido e al forno coverslip nel fondo di una piastra da 35 mm coltura. Ripetere se necessario per ottenere il numero di piatti necessari.
- Sottoporre i coprioggetti a luce UV per 20-30 minuti al fine di garantire ulteriormente la sterilizzazione. Tenere il coperchio piatto durante questa fase.
- Aggiungere 400 ml di laminina-1 preparato per ogni vetrino coprioggetto. Utilizzare la punta della pipetta per diffondere laminina-1 per garantire la piena copertura dei coprioggetto. Tensione superficiale consentirà laminina-1 per rimanere sul coprioggetto e si diffonde sul fondo del piatto di cultura, che è richiesto.
- Mettere il coperchio sul piatto e lasciare laminina-1 a incubare per 2-3 ore a temperatura ambiente (3 ore è ottimale).
- Dopo laminina-1 di incubazione, lavare coprioggetto utilizzando la tecnica asettica con PBS sterile in cappa a flusso laminare. Rimuovere soluzione sul coprioggetto e aggiungere 400 ml di PBS. Attendere 5-10 min. Ripetere per un totale di 3 risciacqui.
- Lascia PBS sul coprioggetto dopo l'ultimo risciacquo. Non rompere la tensione superficiale durante il risciacquo e non consentono coprioggetto si asciughino. Lecoperchio ave fino pronto al piatto neuroni dissociato sul coverlip.
5. Dissociazione, Arricchimento, e Coltura DRG neuroni - Parte 2
- Dopo l'incubazione, utilizzare una pipetta 10 ml sterile per sciacquare delicatamente la parte inferiore del piatto 100 millimetri contenente cellule DRG dissociate. Tenere piatto a ~ 45 °, tirare ~ 7 ml di F12HS10 con aiuti pipetta, poi delicatamente espellere 7 ml su circa un terzo del piatto. Ripetere 5x, rimuovendo delicatamente i neuroni.
- Ruotare piatto e ripetere il risciacquo procedura, per altri sei risciacqui, su un altro terzo del piatto. Ripetere la procedura per il restante terzo di nuovo di piatto. In questo modo, sciacquare delicatamente l'intero fondo del piatto con F12HS10 per rimuovere i neuroni.
- Utilizzando stessa pipetta, trasferire F12HS10 contenente neuroni da mm piatto 100 a 15 tubo conico. Centrifugare per 5-10 min a 200 g per far sedimentare le cellule.
- Rimuovere F12HS10, lasciando pellet indisturbati. Risospendere il pellet con 2 ml di F12H + supplementi riscaldato.
- Diluire le cellule, se necessario con integratori F12H + per determinare la concentrazione plating desiderato (120.000 cellule / ml per vetrini rivestiti con / ml laminina-1 e 40.000 cellule 1 mcg / ml per coprioggetto rivestiti con 20 mcg / ml laminina-1 8,16).
- Rimuovere PBS da coprioggetto laminina rivestite e collocare immediatamente 400 ml di cellule su vetrini. Trasferire accuratamente piatto per un umidificata, 37 ° C coltura cellulare incubatore. Lasciare incubare per almeno 1 ora e fino a 3 ore per consentire i neuroni di aderire alla laminina-1.
- In condizioni sterili, inondare delicatamente 35 millimetri piatti contenenti neuroni con 1,6 ml di F12H + supplementi.
NOTA: In questo momento, la tensione superficiale sul coprioggetto può essere rotto. I neuroni sono adeguatamente rispettate laminina-1 sul coprioggetto. - Cellule Torna a incubatore e incubare una notte. Eseguire esperimenti, quali immunocitochimica il giorno successivo.
6.mmunocytochemistry
- Prima di immunocitochimica, soluzione fissativa caldo (4% paraformaldeide, il 30% di saccarosio 2X PBS) a 37 ° C bagnomaria.
NOTA: Prima di fissare le cellule, trattare con i vari reagenti, come netrina-1, Mn 2 +, sonic hedgehog, semaphorin, e ephrin 16,29-31. - Rimuovere lentamente 1 ml di 2 ml di F12H + supplementi da piatto di cultura. Delicatamente aggiungere 1 ml di soluzione fissativa riscaldato. Lasciare incubare a temperatura ambiente per 10-15 minuti.
- Rimuovere con cautela la soluzione fissativa e aggiungere 2 ml di PBS. Applicare la soluzione verso il bordo del piatto, evitando possibili sloggiare delle cellule fisso a seguito di applicazione di PBS. Incubare a temperatura ambiente per 5 min.
- Ripetere lavaggio PBS per un totale di 5 lavaggi. Non permettere che le cellule si asciughino durante qualsiasi fase di immunocitochimica.
- Rimuovere PBS. Applicare 1 ml di soluzione bloccante (0,1% Triton-X, 1X PBS, siero di capra normale 5%). Incubare per 1 ora a temperatura ambiente. In alternativa, a macchia molecole di superficie, Non utilizzare Triton-X nel bloccare soluzione 8.
- Diluire gli anticorpi primari nella soluzione bloccante per la raccomandazione del produttore. Utilizzare 1: 500 per anticorpi contro NCAM e attivato β1 integrine 16. Rimuovere la soluzione bloccante, aggiungere 1 ml di soluzione di anticorpo primario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente o per una notte a 4 ° C.
- Rimuovere la soluzione anticorpo primario e aggiungere 2 ml di PBS 1X. Incubare per 5-10 minuti a temperatura ambiente. Ripetere per un totale di 4 lavaggi PBS. Lava può essere esteso, se necessario.
- Diluire l'anticorpo secondario 1: 1.000 nel bloccare soluzione. Rimuovere PBS, aggiungere 1 ml di soluzione di anticorpo secondario e incubare per 1 ora a temperatura ambiente.
NOTA: Gli anticorpi secondari sono sensibili alla luce. Mantenere soluzioni e cellule nel buio più possibile da questo punto in avanti. - Rimuovere la soluzione anticorpo secondario e risciacquare 5x con 1x PBS, come fatto in precedenza.
- Applicare ~ 60-80 ml di FluoromountG su un vetrino da microscopio. Utilizzando una pinza sottile, sollevare delicatamente il vetrino coprioggetto da piatto e basso coprioggetto in Fluoromount G su vetrino da microscopio. Evitare le bolle d'aria.
- Conservare scorre orizzontalmente a 4 ° C al buio. Dopo 12-24 ore, Fluormount G si polimerizza e coprioggetto sarà saldamente attaccato al vetrino da microscopio. Celle di immagine dopo questa fase di polimerizzazione è completa.
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Representative Results
Il protocollo qui descritto consente agli investigatori di cultura una popolazione arricchita di dissociate neuroni sensoriali embrionali con pochissime cellule (ad esempio, <5%) non neuronali 7,8,10,16. Numerosi DRG possono essere ottenuti dal lombosacrale, toracica e cervicale. A seconda delle esigenze del ricercatore, DRG di queste regioni anatomiche distinte possono essere facilmente isolate. Ad esempio, la figura 1 mostra le immagini del embrione di pollo attraverso varie fasi di dissezione con i DRG lombari evidenziate nelle figure 1C e 1D e DRG toracici nelle figure 1E e 1F.
Cellule coltivate vengono facilmente etichettati mediante immunocitochimica. Qui, cellule in coltura sono immunoistochimica con anticorpi contro integrina β1 e NCAM (Figura 2). Sorprendentemente, siamo stati in grado di visualizzare colorazione fluorescente per fino ad un anno dopo questiProcedure ICC, se i vetrini sono stati tenuti orizzontalmente a 4 ° C e al buio. Tuttavia, la longevità delle macchie ICC deve essere determinato utente e per l'anticorpo.
A seconda della densità di neuroni, coni di crescita alle punte dei neuriti che si estendono possono anche essere visualizzate (figure 2D-2F). I neuroni placcato a 40.000 e 120.000 cellule / ml su vetrini rivestiti con 20 mcg / ml e 1 mg / ml, rispettivamente, laminina-1, hanno numerosi neuriti gratuiti per postare placcatura 26 hr. Queste colture possono essere usati per analizzare specificamente coni di crescita oltre ad analizzare l'intero neurone. In precedenza, questa procedura è stata utilizzata per valutare cono velocità e comportamenti, come la crescita del cono crollo 8,9,11,13,16 crescita. Densità di placcatura inferiori su questi coprioggetto risultati in neuroni morti che non sono aderenti al substrato. La densità appropriata esatto necessario per ogni esperimento deve essere ottimizzata per ogni investigatore.
Figura 1 Fasi di embrionale pulcino dissezione per ottenere DRG. A) Pulcino embrione sdraiato sul suo lato dorsale. Il cuore (H), ali (W) e gambe (L) sono etichettati. La parte superiore dell'immagine è verso la testa, o superiore (S). La parte inferiore dell'immagine è verso la coda, o inferiore (I). R = destra di animale, S = lato sinistro di animali. Tutte le immagini successive sono lo stesso orientamento. B) Gli organi interni sono stati rimossi dalla embrione in A. La colonna vertebrale, costole e DRG sono visti. Per semplicità, una costola è etichettato, tre DRG rappresentativi sono identificate da cerchi neri e toracica e lombare della colonna vertebrale è etichettato. C) La stessa immagine embrione di pulcino come B con una casella grigia che identifica la regione mostrata a higil suo ingrandimento in D. D) ingrandimento Superiore di lombare della colonna vertebrale (VC) regione. Tre degli undici DRG in questa vista sono identificati dai cerchi tratteggiati. DRG sono rotonde e incapsulato. Queste caratteristiche lo rendono facile da ottenere DRG intatti con le pinze. E) un embrione pulcino dopo la rimozione degli organi interni e la metà ventrale toracica della colonna vertebrale. Casella grigia indica regione mostrato a più alto ingrandimento F. F) del midollo spinale (SC) è visto nella regione in cui la colonna vertebrale è stata eliminata. Verso la parte inferiore dell'immagine, la colonna vertebrale lombare (VC) è ancora intatta. 3 di 10 DRG sono identificati da cerchi tratteggiate. DRG si trovano tra ogni serie di costole.
Figura 2 colture di neuroni sensoriali primari immunolabeled per NCAM e β1 integrine. Neuroni DRG Chick coltivate sulle alte concentrazioni di laminina-1 sono immunopositive per NCAM (A) e β1 integrina (B). C) immagine unita di due macchie rivela la maggior parte delle cellule sono positive sia per NCAM e β1 integrina. Questi neuroni sensoriali aviaria sono immunopositive per entrambi questi marcatori. Tuttavia, vi è una cella, contrassegnato da un asterisco che è NCAM integrina β1 negativo e positivo, coerente con una cella non neuronali. DF) Maggiore ingrandimento di un neurone sensoriale colta mostra neuriti estendono dal corpo cellulare. D) Inserto in bianco scatola mostra maggiore ingrandimento di cono di crescita sulla punta di una neurite.
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Discussion
Qui vi presentiamo protocolli dettagliati per l'isolamento e la coltura dissociati neuroni sensoriali provenienti da un embrione di pulcino. Questa procedura genera una popolazione arricchita di neuroni robusta crescita in vitro 7,8,10,16. Numerose tecniche cellulari e molecolari possono essere applicati a questi neuroni in coltura, compreso immunocitochimica, descritto qui. Questo protocollo è stato recentemente utilizzato per valutare quantitativamente l'intensità delle integrine attivate immunolabeled in coni di crescita sensoriali 8,16. In questi studi precedenti, un programma software è stato usato per creare con precisione una descrizione dei distale 20 micron fine del cono di crescita. Il contorno è stata fatta sulla base di NCAM colorazione. L'espressione ubiquitaria di NCAM nei neuroni ha permesso al programma di software per identificare l'intero cono di crescita, piuttosto che una porzione limitata del cono di crescita. Questo schema cono di crescita è stato poi identificato come una regione di interesse e l'intensità di colorazione integrina all'interno di tale regisu di interessi è stata valutata dal software. In questo modo, l'intensità di una proteina di interesse può essere facilmente misurata in una regione specifica all'interno dei neuroni sensoriali in coltura.
Per ottenere risultati attendibili, sono fornite le seguenti raccomandazioni. In primo luogo, assicurarsi che coprioggetto sono ben lavati con acqua dopo HCl incubazione nei passaggi 1,4-1,6. In caso contrario, molecole quali la laminina-1 non disperdere bene sul vetrino. In secondo luogo, verificare che DRG siano adeguatamente dissociato (punto 3.5) dopo digestione con tripsina, altrimenti grumi di cellule formeranno e questo diminuirà purezza neuronale. In terzo luogo, è ottimale per incubare le cellule DRG in fase 3.9 per un completo 3 ore per ottenere una popolazione pura di neuroni. Se questo passaggio di incubazione si accorcia, per poi diminuire risciacquo passi 5.1 e 5.2 per limitare il numero di cellule non neuronali che vengano strappati dopo un tempo di incubazione più breve. In quarto luogo, in modo che la tensione superficiale è mantenuta durante l'applicazione di laminina-1 e dissoneuroni ad essa associate alle coprioggetti. Se la tensione superficiale si perde, la soluzione si estenderà oltre il vetrino e asciutto. Questo ucciderà i neuroni. In quinto luogo, la densità cellulare ottimale deve essere determinato da ciascun investigatore. Precedenti studi hanno placcato 120,00 neuroni / ml e 40.000 neuroni / ml su vetrini rivestiti di 1 mg / ml di laminina-1 e 20 mg / ml laminina-1, rispettivamente, 8,16. Questa concentrazione è sufficientemente bassa per permettere ai ricercatori di studiare le terminazioni degli assoni liberi (terminazioni che non erano ancora collegate con un altro neurone). Sesto, durante immunocitochimica, essere certi di lavare delicatamente le cellule. La rimozione o l'applicazione di soluzioni in grado di rimuovere i neuroni dal coprioggetto troppo in fretta.
Limitazioni di questa procedura includono la finestra di tempo alquanto limitata del pulcino DRG dissezione. DRG può essere facilmente ottenuto dal giorno embrionale (E) 7-10 embrioni di pollo. Mentre è possibile ottenere DRG prima di E7, che è un po 'impegnativo. Dopo E11, più cartilagine transmabili alle ossa e questo rende la dissezione più difficile. Così, gli studi che mirano a confrontare embrionale contro neuroni adulti non sarebbe l'ideale per questo modello pulcino, tuttavia, gli studi precedenti hanno utilizzato il modello di ratto di confronto dell'età in DRG 32. Va notato che ratto DRG dissezione è più costoso, meno robusto e tecnicamente più impegnativo di pulcino. Un altro punto da considerare è la capacità delle colture di neuroni DRG embrionali a cambiare nel tempo nella cultura. Ad esempio, questi neuroni sensoriali esprimono diversi livelli di recettori entro 48 ore a seconda della presenza di selezionare neurotrofine 2,30.
Due sottoclassi di neuroni DRG possono essere arricchiti mediante l'uso di neurotrofine selettivi nei media 2,12,30. Ad esempio, il fattore di crescita nervosa (NGF) e neurotrofina-3 (NT3) sostengono in primo luogo la sopravvivenza dei neuroni, rispettivamente 33 cutanee e propriocettive. I media utilizzati in questo esperimento ha sia NGF e NT3Tuttavia, questo può essere facilmente modificato per selezionare sia per i neuroni sensoriali cutanee o propriocettivi.
Neuroni dissociato sono suscettibili di numerose tecniche di imaging dal vivo tra cui Timelapse immaginazione del cono di crescita motilità e l'imaging del calcio. Il supporto utilizzato qui è vantaggioso per l'imaging cellulare dal vivo, perché non richiede di CO 2 per pH buffer dei media. Pertanto, l'acquisizione dei dati da cellule vive può essere eseguito su un microscopio con un palco riscaldato ma non richiede manutenzione di adeguati livelli di CO 2. Crescita velocità cono, collasso 8,16,30, e 17 livelli di calcio sono stati studiati in pulcino primaria neuroni sensoriali vive isolate con la tecnica qui descritta. Inoltre, RNAi può ridurre con successo i livelli di proteine nel pulcino colta neuroni DRG 34.
Conoscenze acquisite con ben definiti modelli in vitro possono essere utilizzati come un fondamento essenziale per progettare esperimentiin un modello più complesso in vivo. Ad esempio, diversi approcci sono stati usati in laboratorio Argento 35 per stimolare assonale in un modello in vitro della cicatrice gliale. Della varietà di reagenti testati in vitro, solo due (induzione infiammazione e la digestione dei proteoglicani condroitin solfato) potrebbero favorire la rigenerazione degli assoni. È interessante notare che una combinazione di questi due trattamenti in vivo stimola la rigenerazione assonale drammatica e funzionale nel midollo spinale 35. In questo caso, gli esperimenti in vitro hanno fornito un importante strumento per lo screening rapido per i reagenti che hanno aumentato l'estensione assonale. I reagenti che hanno promosso con successo la crescita degli assoni in vitro hanno anche dimostrato con successo in vivo, che supporta ulteriormente il valore degli esperimenti di coltura cellulare.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla da rivelare.
Acknowledgments
Vorremmo ringraziare Alison Philbrook, Belinda Barbagallo e Michael Francis per i commenti perspicaci su questo documento. La ricerca riportata in questa pubblicazione è stato sostenuto da un premio R15 AREA 1R15NS070172-01A1 assegnato a MLL.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sterile small culture dishes (35 mm) | Corning | 430165 | |
| Sterile large culture dishes (100 mm) | Falcon | 353003 | |
| Sterile large Petri dishes (100 mm) | VWR | 89000-302 | |
| Glass Petri dish (100 mm) | VWR | D108962 | |
| Fine forceps | Fine Science Tools | 11251-10 | |
| Standard forceps | Fine Science Tools | 1100-12 | |
| Coverslips (22 x 22 mm) | Fisher | 12 518 105K | 0.13-0.17 mm thickness is optimal for microscopy |
| Porcelin coverslip holder | Thomas scientific | 8542E40 | |
| Fetal Bovine serum | Gibco | 17502-048 | use 50 ml aliquots per 500 ml of Ham's F12 media |
| HCl | VWR | VW3204-1 | use at 2 M, can be used twice before discarding |
| NaCl | Sigma | S9888 | use 5 M NaCl solution for laminin-1 stock solution |
| Laminin-1 | Invitrogen | 23017-015 | Add 72 µl of sterile 5 M NaCl and aliquot into 50 µl |
| 15 ml Conical tube | cell treat | 229411 | |
| PBS CMF 10x | Gibco | 14200 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| PBS 10x | Gibco | 14080 | used at 1x, dilute with sterile Millipore filtered water |
| Ham's F12 | Lonza | 12-615F | |
| Fetal Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 10438 | use in F12HS20 at 10% |
| HEPES | Sigma | H3375 | make sterile 1 M solution in distilled water, dilute in F12 media to obtain final concentration of 10 mM |
| Penicillin/streptomyocin | Sigma | P0781 | use 5 ml in 500 ml of F12 media |
| NT3 | Millipore | GF031 | Add 1 ml of sterile Millipore water, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 10 ng/ml in F12H media, keep in -20 °C non-defrosting freezer |
| NGF | RnD systems | 256-GF | Add 1 ml of sterile 1x PBS with 0.1% BSA, aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, used at final concentration of 10 ng/ml in F12H media |
| L-Glutamine | Sigma | G7513 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C, use at final concentration of 200 mM in F12H media |
| Trypsin | Sigma | T4049 | aliquot under sterile conditions, store at -20 °C |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Gibco | 15260 | |
| Other items needed: general dissection instruments, including glass Pasteur pipettes, fertile white leghorn chicken eggs, check egg incubator (humidified, 37 °C), cell incubation chamber (humidified, 37 °C), laminar flow hood, binocular stereovision dissecting scope | |||
| Immunocytochemistry Reagents Table | |||
| Sucrose | Sigma | S9378 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Triton-X 100 | Sigma | T-8787 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | used in fixative solution (4% paraformaldehye, 30% sucrose, 2x PBS) |
| Fluoromount G | Southern Biotech | 0100-01 | |
| Normal goat serum | Life technologies | PCN500 | |
| Microscope slides | VWR | 16004-430 | |
| Primary Antibody Table | |||
| Antibody against NCAM | Millipore | AB5032 | polyclonal |
| Antibody against activated β1 ingegrin | Millipore | MAB19294 | monoclonal |
| Secondary Antibody Table | |||
| Goat anti-mouse IgG Alexa 488 | Life technologies | A11001 | |
| Goat anti-rabbit IgG Alexa 548 | Life technologies | A11036 | |
References
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