Eficiente iPS Generación Celular de sangre usando episomas y HDAC inhibidores

Resumen

Aquí se describe un protocolo para la generación de células madre pluripotentes inducidas humanas a partir de sangre periférica mediante una estrategia basada en la reprogramación episoma y los inhibidores de la histona deacetilasa.

Resumen

Este manuscrito ilustra un protocolo para la creación de células de manera eficiente a la integración libre inducidos por el hombre madre pluripotentes (iPSCs) a partir de sangre periférica utilizando plásmidos episomales e inhibidores de la histona deacetilasa (HDAC). Las ventajas de este enfoque incluyen: (1) el uso de una cantidad mínima de sangre periférica como un material de origen; (2) nonintegrating vectores de reprogramación; (3) un método rentable para la generación de vectores iPSCs libres; (4) una sola transfección; y (5) el uso de pequeñas moléculas para facilitar la reprogramación epigenética. Brevemente, las células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) se aislaron a partir de muestras de flebotomía de rutina y después se cultivaron en factores de crecimiento definidas para producir una población de células progenitoras de eritrocitos altamente proliferativa que es notablemente susceptibles de reprogramación. Nonintegrating, plásmidos episomales no transmisibles que expresan Oct4, Sox2, KLF4, MYCL, LIN28A, y un corto horquilla (sh) ARN p53 son introduced en los eritroblastos derivados través de un único nucleofection. La cotransfección de un episoma que expresa la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) permite una fácil identificación de las células transfectadas. Un plásmido de replicación deficiente separada expresar Epstein-Barr antígeno nuclear 1 (EBNA1) también se añade a la mezcla de reacción para aumentar la expresión de proteínas episomales. Las células transfectadas se sembraron sobre una capa de fibroblastos de embriones de ratón irradiados (iMEFs) para continuar la reprogramación. Tan pronto como colonias IPSC-como aparecen en aproximadamente doce días después de nucleofection, se añaden inhibidores de HDAC al medio para facilitar la remodelación epigenética. Hemos encontrado que la inclusión de los inhibidores de HDAC aumenta habitualmente la generación de colonias IPSC totalmente reprogramadas por 2 veces. Una vez que las colonias IPSC presentan la morfología típica de células madre embrionarias humanas (CMEH), se transfieren suavemente para placas de cultivo individuales recubiertos de tejido IMEF para el continuo crecimiento y expansión.

Introducción

iPSCs se derivan de tejidos somáticos a través de la expresión ectópica de un conjunto mínimo de genes pluripotencia. Esta técnica se demostró inicialmente por la transducción retroviral de los fibroblastos humanos con Oct4, Sox2, Klf4, y cMYC, que son altamente expresado en el estado pluripotente ^1. Estos transitoriamente expresadas "factores de reprogramación" alteran el perfil de expresión génica y epigenética paisaje de la célula diana análoga a las células madre de embriones humanos ^2. Una vez creado, iPSCs potencialmente puede diferenciarse en cualquier tipo de tejido para análisis adicionales. Por lo tanto, mantienen la ....

Protocolo

Consentimiento informado por escrito, según lo aprobado por las juntas de revisión institucional del Centro de Investigación del Cáncer Fred Hutchinson y los niños "s Hospital of Philadelphia, se obtuvo de los pacientes antes de la recogida de muestras de sangre periférica. Se observaron Todas las directrices institucionales. Todos los experimentos con animales, incluyendo la generación de MEF y formación de teratomas fueron aprobados por el Comité de Cuidado y Uso de Animales Institucional.

1. Ficoll separación de PBMC y Expansión de Eritroblastos - Día 0

1. Diluir la sangre periférica 1: 1 con tampón fosfato salino de Dulbecco (....

Resultados

Tres días después de nucleofection y de las placas, las células nucleofected en iMEFs, la eficiencia de nucleofection exitoso debe ser estimado por microscopía de fluorescencia para eGFP. La Figura 1 muestra un experimento de nucleofection típico con aproximadamente 5-10% de la población total de células que expresan eGFP.

Colonias reprogramado IPSC comenzarán a aparecer aproximadamente dos semanas después de nucleofection. Las colonias son generalmente circular con bordes b.......

Discusión

Para exitosa generación de IPSC cuando se utiliza este protocolo, hay varias advertencias importantes que deben ser considerados. Durante la fase de expansión eritroblasto, el programa de cambio de los medios de comunicación debe ser estrictamente seguida, como desviaciones pueden conducir a la estimulación ineficiente de la población de células progenitoras diana y una menor eficiencia de la generación de IPSC. Es importante hacer nuevo medio de expansión con dexametasona fresca con cada cambio de los medios de comunic.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	Almacene a 4 °C. Caliente a temperatura ambiente antes de usar.
DPBS	Life Technologies	14190-250	Tienda en 4 °C.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	Tienda en 4 °C.
suero fetal bovino (FBS)	Life Technologies	10437028	Tienda en -20 ° C hasta que sea necesario. Descongelar, alícuota, almacenar a 4 °C.
dimetilsulfóxido (DMSO)	Sigma-Aldrich 154938		Almacenar a temperatura ambiente.
QBSF-60 medio sin suero	Fisher Scientific	50-983-234	Almacene en 4 °C.
penicilina/estreptomicina	Life Technologies 15140122		Tienda en 4 °C.
Kit de nucleofactor de línea celular V	Lonza	VCA-1003	Tienda a 4 °C.
Solución de gelatina al 2%	Sigma-Aldrich	G1393	Almacenar a 4 & deg; C, licuar en 37 ° C Baño de agua antes de usar.
Hank's Balanced Saline Solution (HBSS)	Life Technologies	14175-103	Tienda en 4 °C.
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Life Technologies	11965-092	Tienda en 4 °C.
Iscove's Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Tienda en 4 °C.
L-glutamina, 200 mM	Life Technologies	25030-081	Alícuota, congelación a -20 °C.
aminoácidos no esenciales (NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	Tienda en 4 & deg; C, lejos de la luz.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	Tienda a 4 °C.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	Alícuota, congelar a -20 °C.
piruvato de sodio, 100 mM	Life Technologies	11360-070	Almacenar a 4 °C.
bicarbonato de sodio, 7.5%	Life Technologies	25080094	Tienda a 4 °C.
factor de crecimiento básico de fibroblastos (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	Hacer un caldo de 10 mg/ml en DPBS, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
butirato de sodio	Sigma-Aldrich	B5887-1G	Fabrica 2000x stock (400 mM) en DPBS, alícuota, congelación a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
Clonación de células hES & Suplemento de Recuperación	Stemgent	01-0014-500	Tienda en -20 ° C hasta que sea necesario. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
Matrigel BD calificado por ESC	BD Biosciences	35-4277	Descongele durante la noche en hielo a 4 & deg; C, alícuota en tubos preenfriados utilizando puntas de pipeta preenfriadas. Almacenar a -20 ° C hasta que sea necesario. Descongele a las 4 & grados; C, úselo inmediatamente.
StemSpan SFEM	STEMCELL Technologies	9650	Alícuota, congelación a -20 °C.
ácido ascórbico, en polvo	Sigma-Aldrich	A4403-100MG	Prepare un caldo de 5 mg/ml en DPBS, filtro estéril, almacene a 4 & C.
factor de células madre humanas recombinante (SCF)	R & D Sistemas	255-SC-010	Marca 100 μ g/m de existencias en SFEM, alícuota, congelación a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
interleucina humana recombinante 3 (IL-3)	R & D Sistemas	203-IL-010	Marca 100 μ g/ml de stock en SFEM, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
eritropoyetina (EPO)	R & D Systems	287-TC-500	Hacer 1000 U/ml de caldo en SFEM, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
factor de crecimiento similar a la insulina humana recombinante 1 (IGF-1)	R & D Sistemas	291-G1-200	Marca 100 μ g/ml de stock en SFEM, alícuota, congelar a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
β-mercaptoetanol	Sigma-Aldrich	M7522	Hacer 1000x stock (100 mM) en DPBS.
dexametasona	Sigma-Aldrich	D4902-25MG	Hacer 50x stock (50 μ M) en DPBS, filtro estéril, almacenar a 4 & °C.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	Fabrica 2.000 veces el stock (400 mM) en DPBS, alícuota, congela a -20 °C. Una vez descongelado, almacenar a 4 ° C.
placa de cultivo de tejidos de 12 pocillos	Fisher Scientific	08-772-29
tubo cónico de 15 ml	Sarstedt	62553002
tubo Eppendorf de 1,5 ml	Fisher Scientific	05-408-129
placa de cultivo de tejidos de 6 pocillos	Fisher Scientific	08-772-1B
placas de cultivo tisue de 35 mm	BD Biosciences	353001
Pipetas serológicas desechables de 10 ml	Fisher Scientific	13-675-20
Pipetas serológicas desechables de 5 ml	Fisher Scientific	13-675-22
Pipetas serológicas desechables de 2 ml	Fisher Scientific	13-675-17
20 μ l puntas de pipeta, puntas de barrera	Genessee	24-404
vidrio pipetas Pasteur	Fisher Scientific	13-678-20D
ayuda para pipeta	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	Addgene	27082
pCXWB-EBNA1	Addgene	37624