Recapitulation of the organ-specific microenvironment, which stimulates local angiogenesis, is indispensable for successful regeneration of damaged tissues. This report demonstrates a novel method to implant fibrin gels on the lung surface of living mouse in order to explore how the lung-specific microenvironment modulates angiogenesis and alveolar regeneration in adult mouse.
התקדמות משמעותית האחרונה בטכניקות מחקר בתאי גזע וביו-הנדסה עשו התקדמות גדולה בניצול ביו-חומרים להתחדש ולתקן את הנזק ברקמות פשוטות בתחומי האורתופדים וחניכיים. עם זאת, הניסיונות לחדש את המבנה ותפקוד של איברים מורכבים יותר תלת ממדי (3D) כגון ריאות לא היה מוצלח מאוד בגלל התהליכים הביולוגיים של התחדשות איבר לא נחקרו היטב. זה הופך להיות ברור שאנגיוגנזה, היווצרותם של כלי דם חדשים, ממלאת תפקידי מפתח בהתחדשות איבר. שהוקם זה עתה vasculatures לספק לא רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להתחדשות איבר אלא גם לספק אותות מאלפות לרקמות המקומיות ההתחדשות. לכן, כדי להתחדש בהצלחה ריאות במבוגרים, יש צורך לשחזר את microenvironments הריאות ספציפיות שבי אנגיוגנזה התחדשות של רקמות ריאה כוננים מקומיות. למרות שיתוףnventional in vivo מבחני אנגיוגנזה, כגון השתלה תת-עורית של מטריצה תאית (ECM) -rich הידרוג (למשל, ג'לים הפיברין או קולגן או Matrigel – תערובת חלבוני ECM מופרש על ידי תאי סרקומה עכבר Engelbreth-הולם-נחיל), באופן נרחב מנוצל כדי לחקור את מנגנונים כלליים של אנגיוגנזה, אנגיוגנזה ריאות ספציפיות לא מאופיין היטב כי שיטות להשתלת orthotopic של ביו-חומרים בריאות לא היו מבוססות היטב. המטרה של פרוטוקול זה היא להציג את שיטה ייחודית להשתלת ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר חיים, המאפשרת לסיכום המוצלח של אנגיוגנזה-נגזר ריאות המארח בתוך הג'ל. גישה זו מאפשרת לחוקרים לחקור את המנגנונים שבאמצעותם מייקרו-סביבת הריאות ספציפיות שולט אנגיוגנזה והתחדשות alveolar בשני תנאים נורמלים ופתולוגיים. מאז שחרור ביו-חומרים מושתלים ולספק אותות פיסיקליים וכימיים לl הסמוךרקמות ung, השתלה של ביו-חומרים אלה על ריאות חולות עלולה לנרמל את הרקמות חולות הסמוכות, המאפשרות לחוקרים לפתח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה.
המטרה הכללית של פרוטוקול זה היא להציג את השיטה להשתיל ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של עכבר בוגר, המאפשר לחוקרים לאפיין את המנגנונים המולקולריים של כלי דם ריאה ופיתוח alveolar, ולמנף את הידע הזה כדי לפתח חומרי biomimetic מסוגל של כלי דם ריאה משחזר פיסיולוגיים והיווצרות מכתשי לטיפול במחלות ריאה שונות.
יותר מ -35 מיליון אמריקאים סובלים ממחלות ריאה כרוניות, כוללים מחלת ריאות חסימתית כרונית ופיברוזיס ריאתי. חולים אלה סימפטומים לטווח ארוך כרוניים בדרכי הנשימה כגון קוצר נשימה, לחץ בחזה, שיעול טורדני, ועייפות, שפוגעים בחיי היום היום שלהם 1-3 באופן משמעותי. למרות כמות גדולה של מאמץ לפתח טיפולים יעילים למחלות ריאה אלה, כיום אין תרופה; לכן, איכות חיים של חולים אלה היא עניה וכלכלי ועלויות אנושיות הייGH 4-7. נכון לעכשיו, השתלת ריאות היא הדרך היחידה להציל את החולים עם מחלות ריאה כרונית סופנית. עם זאת, בגלל המחסור בתורמים להשתלה, עלות גבוהה, סיבוכים חמורים, ושיעור הישרדות נמוך 8-11, השתלה היא לא גישה אופטימלית. התקדמות מהירה בטכניקות האחרונות הנדסת רקמות אפשרה לחוקרים bioengineer ריאות מושתלים על ידי אכלוס מחדש כל ריאות decellularized עם סוגים שונים של תאים או תאי גזע pluripotent מושרה (iPS) 12,13. עם זאת, ריאות bioengineered אלה הן פונקציונליות בבעלי החיים מארח רק לכמה שעות לאחר 12,14,15 השתלה. גם ניצול ביו-חומרים להתחדש מבנים ופונקציות המורכבים של ריאות היה די מוצלח. זה יכול להיות בגלל תהליכים ביולוגיים מרכזיים ששולטים בהתחדשות ריאות מבוגרים לא נחקרו היטב. בריאות, היווצרות של מערכת כלי הדם היא אחד מהאירועים המוקדמים והחשובים ביותר duriפיתוח ng והתחדשות 16-21. שהוקם זה עתה בvasculatures הריאות לא גם לספק רק חמצן, חומרי מזון ומרכיבי תא שונים הנדרשים להיווצרות איברים, אלא לספק אותות רגולציה מאלפות לתאים המקיפים 22-25. לפיכך, אנגיוגנזה משחקת תפקידי מפתח בalveolarization משובי בריאות מבוגרים 24,26,27. בנוסף, אנגיוגנזה deregulated תורמת למחלות ריאה כרוניות כגון מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) 28, דיספלזיה bronchopulmonary (BPD) 21-23, ופיברוזיס ריאתי 29. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להנדסת ריאות או טיפול במחלות ריאה כרוניות, יש צורך להבין את המנגנונים הבסיסיים של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות.
כל איבר מציג תכונות מכאניות וכימיות ייחודיות, אשר עשוי להיות שונה בין תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים 30-33. microenviron איבר ספציפי אלהמפעלים לווסת התנהגויות תא האנדותל ולתזמר יצירת רשת כלי דם באופן ספציפי לאיבר 24,34-36. לכן, כדי לפתח אסטרטגיות יעילים יותר להתחדשות ריאות, המנגנון שבבסיס אנגיוגנזה ריאות ספציפיות צריך להיות מובן. בעוד מבחני אנגיוגנזה קונבנציונליים in vivo כגון השתלה תת עורית הידרוג'ל נעשו שימוש נרחב למחקר אנגיוגנזה 37-39, שיטות אלה לא לשחזר אנגיוגנזה איבר ספציפי. לאחרונה, שיטה חדשנית להשתלת Matrigel בעובש אלסטי על ריאות העכבר פותחה והוצגה בהצלחה לגייס כלי דם ותאי האפיתל ריאות לג'לים 22. גישה ייחודית זו תאפשר לחוקרים לחקור את המנגנון של אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, כמו גם יחסי גומלין בין כלי דם ותאי ריאה שאינם כלי דם בתנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. מאז 1) Matrigel אינו מתאים ליישום קליני; 2) הדוארעובש lastic משמש כדי להפיל את ג'ל עשוי להשפיע על יחסי גומלין בין הידרוג ורקמת ריאה מארח ו -3) עובש אלסטי על הריאות שעלול להיות גורם פגיעה בתפקוד ריאות וכאב בזמן הנשימה, כגישה רלוונטית יותר מבחינה קלינית, מטריצת הפיברין 3D המכיל גורמי angiogenic (פקטור גדילה של אנדותל כלי דם (VEGF) / גורם גדילה פיברובלסטים בסיסי (bFGF)) כבר מושתל על ריאות העכבר ללא יציקה בתבנית הגמישה, וסכם אנגיוגנזה המופקת ריאות מארח בהצלחה. ג'ל ליפין, סיבי פולימר שנוצרו מפיברינוגן-ביקע תרומבין, ידוע למלכודת מגוון גורמי angiogenic כגון bFGF וVEGF להאיץ אנגיוגנזה in vivo 40,41. בשל יכולת ההתחדשות שלו והטבע מתכלה 42, ג'ל הפיברין נעשה שימוש נרחב בתחום הנדסת רקמות.
מאמר זה מציג רומן וגישה ייחודית להשתלת ג'ל הפיברין על פני השטח הריאות של adul חייםעכבר ולא מוכיח כי אנגיוגנזה המופקת ריאות המארח סכמה בתוך ג'לי in vivo. שיטה זו, המאפשרת לחוקרים ללמוד אנגיוגנזה ריאות ספציפיות, צפויה להוביל לפיתוח גישות טיפוליות חדשות לסוגים שונים של מחלות ריאה ולקדם באופן משמעותי את המאמצים לחדש ריאות מבוגרים בהצלחה.
מאמר זה מציג שיטה חדשה להשתלה בביו-חומרים על פני השטח הריאות של חיים עכבר בוגר. עם מערכת זו, אנגיוגנזה נגזרת-ריאה המארח סכמה בהצלחה בתוך החומר. מערכת זו מאפשרת לחוקרים לחקור crosstalk בין תאי אנדותל, תאים אחרים (לדוגמא, תאי אפיתל, תאי mesenchymal, תאי מערכת חיסון) ורכיבי ECM שו…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה על ידי קרנות מאיגוד לב אמריקאי (בבוקר), משרד הגנה האמריקאי (BC074986), ובית החולים הפקולטה פיתוח הקריירה המלגה לילדים בבוסטון (TM, בבוקר). המחברים מודים אמנדה ג'יאנג ואליזבת ג'יאנג לקבלת סיוע טכני.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Fibrinogen from human placenta | Sigma | F4883 | For fabrication of fibrin gel |
Thrombin from bovine plasma | Sigma | T9549 | For fabrication of fibrin gel |
Recombinant mouse VEGF 164 | R&D | 493-MV | For supplementation to fibrin gel |
Recombinant mouse bFGF | R&D | 3139-FB | For supplementation to fibrin gel |
Rodent Intubation Stand | Braintree Scientific INC | RIS 100 | For intubation |
Fiber-Optic Light Source | Fisher Scientific | 12-565-35 | For intubation |
20G Elastic catheter | B.Braun | 4251652-02 | For intubation |
MiniVent Ventilator | Harvard Apparatus | CGS-8009 | For ventilation |
Stemi DV4 Steromicroscope | Fisher Scientific | 12-070-515 | For surgey |
Absobable suture | Ethicon | PDP304 | Surgical suture |
Antibody against CD31 | BD Biosciences | 553370 | Immunohistochemistry |
Antibody against AQP5 | Abcam | AB78486 | Immunohistochemistry |
Antibody against SP-B | Millipore | AB40876 | Immunohistochemistry |