Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Medicine
Click here for the English version

Medicine

Implantasjon av fibringel på Mouse Lung å studere Lung-spesifikke Angiogenese

Published: December 21, 2014 doi: 10.3791/52012
Automatic Translation
1, 1
1Vascular Biology Program, Department of Surgery, Boston Children's Hospital and Harvard Medical School

Abstract

Nyere betydelige fremskritt i stamcelle forskning og bioteknologi teknikker har gjort store fremskritt i å utnytte biomaterialer til å fornye og reparere skader i enkle vev i ortopediske og perioden felt. Imidlertid har forsøk på å regenerere strukturene og funksjonene til mer komplekse tredimensjonale (3D) organer som lunger har ikke vært særlig vellykket fordi de biologiske prosesser av organ regenerering ikke er godt utforsket. Det er blitt klart at angiogenese, dannelsen av nye blodkar, spiller viktige roller i organ regenerering. Nydannede vasculatures ikke bare levere oksygen, næringsstoffer og forskjellige cellekomponenter som er nødvendige for regenerering organ, men også gi instruktive signaler til de lokale regenererende vev. Derfor, for å kunne regenerere lungene hos en voksen person, er det nødvendig å rekapitulere lunge-spesifikke microenvironments hvori angiogenese stasjoner regenerering av lokale lungevevet. Selv conventional in vivo angiogenese analyser, for eksempel subkutan implantasjon av ekstracellulære matrise (ECM) rik hydrogeler (f.eks fibrin eller kollagen gels eller Matrigel - ECM protein blanding utskilt av Engelbreth-Holm-Swarm mus sarkomceller), er mye brukt til å utforske generelle mekanismer for angiogenese, lunge-spesifikke angiogenese, hittil ikke blitt godt karakterisert, fordi fremgangsmåter for implantering av ortotopisk biomaterialer i lungen ikke har blitt godt etablert. Målet med denne protokollen er å innføre en unik metode for å implantere fibringel på lunge overflaten av levende voksen mus, noe som åpner for en vellykket gjentagelse av verts lunge-avledet angiogenese inne i gel. Denne tilnærmingen gjør forskere til å utforske de mekanismer som lunge-spesifikke mikromiljøet kontrollerer angiogenese og alveolar regenerering i både normale og patologiske tilstander. Siden implantert biomaterialer utgivelsen og levere fysiske og kjemiske signaler til tilstøtende lUng vev, kan implantering av disse biomaterialer for syke lungen potensielt normalisere de tilstøtende sykt vev, slik at forskere for å utvikle nye terapeutiske tilnærminger for ulike typer av lungesykdommer.

Introduction

Det overordnede målet med denne protokollen er å innføre en metode for å implantere fibringel på lunge overflaten av voksen mus, som tillater forskere å karakterisere de molekylære mekanismene for lunge vaskulær og alveolar utvikling, og for å utnytte denne kunnskapen for å utvikle biomimetic materialer stand av rekapitulere fysiologiske lunge vaskulær og alveolar formasjon for å behandle ulike lungesykdommer.

Mer enn 35 millioner amerikanere lider av kroniske lungesykdommer, inkludert kronisk obstruktiv lungesykdom og lungefibrose. Disse pasientene har langvarige kroniske luftveissymptomer som kortpustethet, tetthet i brystet, griner hoste og tretthet, som i betydelig grad svekker deres hverdag 1-3. Til tross for en stor innsats for å utvikle effektive behandlingsformer for disse lungesykdommer, som for tiden er det ingen kur; derfor er livskvalitet for disse pasientene fattige og økonomisk og menneskelige kostnadene er high 4-7. Foreløpig er lungetransplantasjon den eneste måten å redde pasienter med terminal-trinns kroniske lungesykdommer. Men på grunn av mangel på transplantasjons givere, høye kostnader, alvorlige komplikasjoner, og lav overlevelse 8-11, er transplantasjon ikke en optimal tilnærming. Nyere rask fremgang i tissue engineering teknikker har gitt forskerne til bioingeniør implanterbare lunge ved repopulating decellularized hel lunge med ulike typer stamceller eller indusert pluripotent stilk (iPS-celler) 12,13. Men disse bioengineered lungene er funksjonell i vertsdyret kun i flere timer etter implantasjon 12,14,15. Utnytte biomaterialer å regenerere de komplekse strukturer og funksjoner av lungene har også vært ganske mislykket. Dette kan skyldes at viktige biologiske prosesser som styrer voksen lunge regenerering ikke har blitt godt utforsket. I lungene, er en av de tidligste og viktigste hendelser duri dannelse av det vaskulære systemetng utvikling og regenerering 16-21. Nydannede vasculatures i lungen ikke bare levere oksygen, næringsstoffer og ulike cellekomponenter som kreves for orgel formasjon, men også gi instruktive regulatoriske signaler til omkringliggende celler 22-25. Dermed angiogenese spiller nøkkelroller i regenerativ alveolarization hos voksne lungene 24,26,27. I tillegg bidrar deregulert angiogenese til kroniske lungesykdommer som kronisk obstruktiv lungesykdom (KOLS) 28, bronkopulmonal dysplasi (BPD) 21-23, og lungefibrose 29. Derfor, for å utvikle mer effektive strategier for å konstruere lungene eller behandle kroniske lungesykdommer, er det nødvendig å forstå de grunnleggende mekanismer for lunge-spesifikke angiogenese.

Hvert organ viser unike mekaniske og kjemiske egenskaper, som kan variere mellom fysiologiske og patologiske tilstander 30-33. Disse organspesifikk microenvironmenter regulere endotelcelle atferd og orkestrere vaskulær nettverk formasjon i en organspesifikk måte 24,34-36. Derfor, for å utvikle mer effektive strategier for lunge regenerering, må mekanismen bak lunge-spesifikke angiogenese skal forstås. Mens konvensjonelle in vivo angiogenese-assays slik som subkutan implantasjon hydrogel er blitt brukt i stor utstrekning for angiogenese forskning 37-39, har disse fremgangsmåter ikke rekapitulere organspesifikk angiogenese. Nylig har en ny metode for å implantere Matrigel i en elastisk mold på musen lunge blitt utviklet og vist å kunne rekruttere blodårer og lunge epitelceller i gels 22. Denne unike tilnærming vil tillate forskere å utforske mekanismen for lunge-spesifikke angiogenese, så vel som interaksjonene mellom blodårer og ikke-vaskulære lungeceller i fysiologiske og patologiske tilstander. Siden 1) Matrigel er ikke egnet for klinisk anvendelse; 2) eLastic formen som brukes til å kaste gelen kan påvirke interaksjonen mellom hydrogeler og verts lungevev og 3) den elastiske formen på lungen potensielt forårsaker forringelse av lungefunksjonen og smerter ved respirasjon, som en mer klinisk relevant tilnærming, en 3D-fibrin-matrise inneholdende angiogene faktorer (vaskulær endotelial vekstfaktor (VEGF) / basisk fibroblast vekstfaktor (bFGF)) har blitt implantert i mus lungen uten støping i den elastiske form, og har med hell rekapitulert vertslungeavledet angiogenese. Fibringel, polymere fibriller generert fra trombin-spaltede fibrinogen, er kjent for å fange en rekke av angiogene faktorer som bFGF og VEGF til å akselerere angiogenese in vivo 40,41. På grunn av sin evne til regenerativ og biologisk nedbrytbar natur 42, fibringel mye brukt innen vevsteknologi.

Denne artikkelen introduserer en ny og unik tilnærming til implantatet fibringel på lunge overflaten av levende adult mus og viser at verts lunge-avledet angiogenese er rekapitulert inne i gels in vivo. Denne metoden, som gjør det mulig for forskere å studere lunge-spesifikke angiogenese, vil sannsynligvis føre til utvikling av nye terapeutiske tilnærminger for ulike typer av lungesykdommer og betydelig videre anstrengelser for å kunne regenerere voksen lunge.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

MERK: in vivo dyrestudie ble utført i henhold til anbefalingene i Guide for omsorg og bruk av forsøksdyr av National Institutes of Health. Protokollen ble gjennomgått og godkjent av Animal Care og bruk komité Boston Children Hospital (Protokoll Numbers: 13-10-2526R, 14-02-2568R). Alle legemidler som brukes i denne protokollen er farmasøytisk karakter og disse stoffene er utarbeidet under sterile forhold.

1. fibringel Forberedelse

  1. Forberede fibrin gel som inneholder VEGF og bFGF.
    1. Tine-stamløsninger av fibrinogen og trombin som er lagret ved -80 ° C til romtemperatur (25 ° C).
    2. Legg trombin (endelig konsentrasjon: 2,5 U / ml), CaCl2 (sluttkonsentrasjon: 45 mM), VEGF (sluttkonsentrasjon: 0-100 ng / ml) og bFGF (sluttkonsentrasjon: 0-100 ng / ml) til fibrinogen oppløsning (sluttkonsentrasjon: 12,5 mg / ml i 0,9% natrium-m-oppløsning 43 til 45) i et 1,5 ml rør.
    3. Bland forsiktig ved pipettering.
    4. Forsiktig pipette 200 mL av blandingen på en steril plast rett i en drop-klok måte å bruke P200 pipettespissen.
    5. Inkuber dråper ved 37 ° C i 30-60 min før de stivner.
      NB: Det størknede gel kan holdes i forseglede plastskål ved romtemperatur (25 ° C) i flere timer før implantasjon (figur 1a).
  2. Trim fibrin gel inn ca 3 x 3 x 3 mm terninger ved hjelp av små kirurgiske saks før implantasjon.

2. Mouse Forberedelse

  1. Bedøve voksen mus (8-12 uker) etter intraperitoneal (IP) injeksjon av ketamin (100 mg / kg) og xylazin (10 mg / kg) og bekrefter at musen er tilstrekkelig bedøvet ved å knipe tå på musen.
    1. Bruk dyrlege salve på øynene av musen for å hindre tørrhet under forsøket.
  2. Shave fur over venstre side av brystkassen på musen.
  3. Utføre endotrakeal intubasjon av musen.
  4. Plasser musen på intubasjon stå vinklet på 70 ° og hold musen på plass ved å hekte sine øvre fortenner over en liten gummistrikk plassert på toppen av stativet.
  5. Forsiktig trekke tungen til en side med butte tang.
  6. Visualstrupehodet ved hjelp av en fiberoptisk gooseneck mikroskop lyset.
  7. Sett endotrakeal elastisk kateter (21 G) i luftrøret.
  8. Bekrefte at musen er spontant puste i en jevn måte (vanlig 100-150 åndedrag / min, noe paradoksal eller grunt åndedrett).
  9. Plasser musen i utsatt posisjon under disseksjon mikroskop.
  10. Mekanisk ventilere musen med en gnager ventilator (150 pust / min og 7 ml / kg tidevolum).
  11. Telle ribbeina å finne interkostalrom mellom 4. og 5. rib.
  12. Lag et sterilt felt over området by grundig tørke ned med alkohol og Povidone-Jod. Dekk kirurgiske feltet tilstrekkelig med en steril kirurgisk drapere.

3. Mouse Surgery

  1. Etter lokal injeksjon av 0,25% bupivakain (200 ul) i huden, blir en tverrgående innsnitt (ca. 1 cm lengde) over interkostalrom ved hjelp disseksjonssaksen.
  2. Etter injeksjon av 0,25% bupivacain (200 mL) i Intercostalmuskler, lage en muskel snitt mellom den 4. og 5. rib hjelp av gode liten saks.
  3. Sett inn en dissekere retractor mellom ribbeina til fullt visual venstre lunge.
    1. Skrape et lite område (1 x 1 mm square) av visceral pleura for sentrum av venstre lunge hjelp fin pinsett.
    2. Bruke milde press på området ved hjelp av en steril bomullspinne til blødninger og luftlekkasjer er helt kontrollert.
    3. Sett liten mengde frisk blanding av fibrinogen / trombin (fibrinlim) (trinn 1.1.2. 20 & #181; l) over området ved hjelp av P200 pipettespissen.
  4. Forsiktig plassere en fibringel (trinn 1.2) ved hjelp av små tenger over området (Figur 1b).
    1. Bekrefte at gelen er godt festet på området under respiratoriske bevegelser av lungen.
  5. Sørg for at det er verken massive luft lekker eller blødning fra lungene.
  6. Nære snitt (muskel og hud lag) med absorberbare sutur, som ikke har for å bli fjernet.
  7. Aspirer brysthulen ved hjelp av 27 G nål og 1 ml sprøyte for å forhindre pneumothorax.
  8. Avslutte mekanisk ventilasjon.

4. Mouse Recovery

  1. Kontroller at mus er spontant puste i en jevn måte (vanlig 100-150 åndedrag / min, noe paradoksal eller grunt åndedrett).
  2. IP injisere en ml forvarmes 0,9% NaCl for å unngå dehydrering.
  3. Tillate musen til å gjenopprette på sirkulerende varmt vann pad.
  4. Ta av endotracheal tube etter å ha bekreftet at musen har stabil puste.
  5. Injisere Meloxicam (5 mg / kg, subkutan injeksjon (SC), i 3 dager som postoperativ smertestillende.
  6. Overvåke bevegelsene til musen nøye på minimum 15 min intervaller inntil det er sternum (stand til å rulle på magen sin og stå oppreist) og bevisst.
  7. Etter utvinning, tilbake musen til et nytt bur isolert fra mus uten kirurgi.
  8. Overvåke operasjonsstedet etter tegn på infeksjon (rødhet, hevelse, utslipp), dyrs grunnleggende biologiske funksjoner (mat og vann inntak, vannlating, avføring, kropps vektøkning) samt kliniske tegn på stress (piloereksjon, redusert locomotion) daglig etter kirurgisk prosedyre.

5. Høsting Lung

  1. 7-30 dager etter implantering, avlive musen med CO 2 via kilde av komprimert gass.
  2. Lage et snitt mellom tuppen av xyphoid prosess og brystbenethakk (median sternotomi) og høste hele lunge med implantert gel for histologiske og biokjemiske analyse ved å kutte luftrøret og dissekere alle forbindelser til hjerte, lunger og luftrør.
  3. Fix implantert gel med lunge med 4% paraformaldehyde løsning over natten ved 4 ºC, bygge inn i oktober sammensatte, og ta serievise deler av 30 mikrometer tykkelse.
  4. Utføre histologisk (hematoxylin og eosin farging) og immunhistokjemiske analyser (endothelial markør: CD31, epitel markør: aquaporin (AQP) 5 og overflateprotein (SP) -B) med konfokal mikroskop 22,37,40.
  5. Kompilere stabler av optiske seksjoner (30 mikrometer tykk) for å danne tredimensjonale bilder av lunge endothelial og epitelceller som bruker 3D-programvare for bildeanalyse 37.
  6. Kvantifisere forventede områder av nydannede blodkar som bruker bildeanalyse programvare 46.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

For å undersøke hvorvidt verts lunge-avledede vaskulære formasjonen rekapitulert inne i biomaterialer implantert i lunge, fibrin-geler supplert med store angiogene faktorer VEGF og bFGF (0, 10 og 100 ng / ml hver) ble implantert på overflaten av levende mus lungene så rapportert ved bruk Matrigel 22. Fibrin-geler 47 som inneholder disse angiogene vekstfaktorer ble fremstilt som vist i Figur 1a. Etter torakotomi, ble et lite område av den venstre lungen overflaten skrapes ved hjelp av pinsett og den fabrikkerte fibringel ble implantert på lungen av den voksne mus ved anvendelse av en liten mengde av fibrin-lim, som er godkjent av FDA, og er mye brukt som et effektivt tetningsmiddel for å stoppe luftlekkasjer og redusere blødning i lungekirurgi 48,49 (Figur 1b). De fleste mus kom seg uten alvorlige luftveissymptomer (f.eks, pneumothorax, respirasjonshemming). Syv dager etter implantering, ble musene avlivet og lungene var harveinvest. Implantert fibringel ble inkorporert i verts lungen 7 dager etter implantasjon (figur 1c). 3D rekonstruksjon av konfokale fluorescens bilder har vist at verts-avledede CD31-positive endotelialceller dannet vaskulære nettverk inne gelene 7 dager etter implantasjon i en VEGF / bFGF doseavhengig måte (figur 2a, c). Type I (AQP5 positive) og type II (SP-B positiv) lunge epitelceller ble også rekruttert langs nydannede blodkar inne gelene som ble supplert med høyere konsentrasjoner av VEGF og bFGF (hver 100 ng / ml) (figur 2a) . H & E farging av histologiske snitt viste at andre typer av vertscellene også migrert inn i gelen 7 dager etter implantasjon (figur 2b). Disse funnene antyder at vertslungeavledet regenerative vaskulære nettverk er konstruert med hell innenfor fibrin-geler som suppleres med angiogene faktorer og implanteres på overflaten av voksen mouse lunge.

Figur 1
Fig. 1: (a) fibringel fremstilt før implantasjon (b) fibringel implantert over skrapet visceral pleura av den venstre lungen (pilhoder) (c) Implantert fibringel (pilhoder) inkorporert i verts lungen 7 dager etter implantasjon.. Skala barer 1 mm.

Figur 2
Figur 2: (a) Fluorescens mikrografer som viser dannelsen av vaskulære nettverk (CD31 positive; grønn) og rekruttert type I (AQP5-positive; magenta) eller type II (SP-B positive; magenta) lunge epitelceller på innsiden av fibringel supplert med forskjellige konsentrasjoner av VEGF og bFGF (0, 10 og 100 ng / ml hver) 7 dager etter implantasjon. Stiplede linjer angir grenseflaten mellom implanterte fibringel og verts lunge. Skala bar.: 20 um (b) Lett mikrofotografi av H & E-farging som viser infiltrasjon av vertsceller inn i fibringel 7 dager etter implantasjon. Piler angir grenseflaten mellom gelen og verts lunge. Skala bar: 20 mikrometer (c) Graf som viser anslått områder av nydannede blodkar i fibrin geleer som suppleres med ulike konsentrasjoner av VEGF og bFGF (0, 10 og 100 ng / ml hver) 7 dager etter implantasjon..

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Denne artikkelen introduserer en ny metode for å implantere biomaterialer på lunge overflaten av levende voksen mus. Med dette systemet blir vertslungeavledet angiogenese hell rekapitulert inne i materialet. Dette systemet gjør det mulig for forskere å utforske krysstale mellom endotelceller, andre celler (f.eks, epitelceller, mesenchymale celler, immunceller) og ulike ECM-komponenter som er nødvendige for lokal angiogenese 50-53 og alveolar regenerering 24,54. Selv om konvensjonell in vivo subkutan hydrogel implantasjon har vært brukt mye for angiogenese forskning 37-39, trenger disse metodene ikke rekapitulere organspesifikk angiogenese. Dette system, der hydrogel implanteres direkte på lungeoverflaten, blir det mulig for forskere å utforske rollene til lunge-spesifikke mikromiljøet i angiogenese og alveolar regenerering i voksen mus lunge. Disse geler kan fremstilles av ulike ECM-rik biomaterial (f.eks kollagener, fibrins) som kan suppleres med ulike kjemiske faktorer (f.eks angiogeniske faktorer, vekstfaktorer) 55,56, stamceller og / eller iPS-celler. I tillegg til kjemiske faktorer, mekaniske krefter også styre angiogenese 23,37. Stivheten av fibringel endringer i en fibrinogen konsentrasjonsavhengig måte 57 og manipulering av fibrinogen-konsentrasjon kan påvirke angiogenese ikke bare gjennom kjemiske signaler, men også gjennom fysiske signaler 58,59. Derfor kan det fysikalsk-kjemiske egenskaper av de fibrin-gelene må optimaliseres omhyggelig for å rekapitulere fysiologisk organspesifikk angiogenese i fremtiden. Sårtilheling etter skraping visceral pleura produserer også en endogen fibrinkoagel, som omfatter ulike typer vertsceller og fremmer helbredelsesprosessen og vev gjenfødelse. Denne naturlige koagel kan samhandle med eksogent implantert fibringel, og dermed styre angiogenesis i den implanterte gel. Fluoresceinmerket fibrinogen kan muliggjøre forskere å skille mellom naturlig fibrinkoagel og implantert fibringel og utforske disse mekanismene. Selv om dette er en kraftig metode for å karakter angiogenese hos voksne mus lungene, søknad til studiet av lunge utvikling og sykdommer hos nyfødte mus vil trolig presentere tekniske utfordringer.

Det endelige målet med denne studien er å rekruttere funksjonelle blodkar til fibrin gels implantert på syke lunger og å bruke matrisen som en medisinsk enhet for å gjenopprette funksjonelle lunge strukturer. Mulige kommunikasjon mellom vertsceller og vaskulære og alveolære strukturer inne gelene samt funksjonaliteten av disse strukturene skal bli undersøkt i senere eksperimenter. Siden VEGF nivåer i lungene er redusert hos pasienter med BPD 60 og emfysem 61, kan legge VEGF til matrisen bedre rekrutteringen av blodkar i matrise implanted på disse syke lunger. Mekaniske egenskaper også variere mellom friske og syke lunger 23,62. For eksempel ekspresjonen av matriks-metalloproteinaser og lysyl-oksydase, som kontrollerer nedbrytning og tverrbinding av kollagen, respektivt, blir endret på ulike lungesykdommer inkludert kronisk obstruktiv lungesykdom og pulmonær fibrose 63-67. I syke lunger, er visse linjer av stamceller for lunge endothelial og epitelceller utarmet 68. Således manipulere disse faktorer (angiogene faktorer, ECM'er, ECM stivhet) eller implantering av fibrin-geler supplert med progenitorceller 69 vil sannsynligvis føre til dannelse av funksjonelle blodkar inne i matrisen og utvinning av lungefunksjonen i forskjellige patologiske tilstander. Siden kjemiske faktorer kan kompletteres på innsiden av fibrin-geler for å modulere angiogenese lokalt, kan systemet også benyttes oppdage spesifikke miljø signaler som kan normalisere syke lungene hos kroniske lungesykdommer. I sammendraget, introduserer denne artikkelen en metode for å implantere fibrin hydrogel på lunge overflaten av levende mus, som gjør det mulig for forskerne å karakter lunge-spesifikk angiogenese in vivo. Modifikasjon av forskjellige faktorer (for eksempel tidsforløpet, konsentrasjoner og kombinasjoner av angiogene faktorer, ulike typer hydrogeler, fysiske og kjemiske egenskaper av hydrogeler) i dette systemet, vil avsløre mekanismene for angiogenese og regenerering i lungen. Således vil dette systemet betydelig fremme vitenskapelig kunnskap om grunnleggende vaskulær biologi, vevsteknologi, så vel som lunge medisin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av midler fra American Heart Association (AM), US Department of Defense (BC074986), og Boston Children Hospital fakultet Karriereutvikling Fellowship (TM, AM). Forfatterne takker Amanda Jiang og Elisabeth Jiang for teknisk assistanse.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Fibrinogen from human placenta Sigma F4883 For fabrication of fibrin gel
Thrombin from bovine plasma Sigma T9549 For fabrication of fibrin gel
Recombinant mouse VEGF 164 R&D 493-MV For supplementation to fibrin gel
Recombinant mouse bFGF R&D 3139-FB For supplementation to fibrin gel
Rodent Intubation Stand Braintree Scientific INC RIS 100 For intubation
Fiber-Optic Light Source Fisher Scientific 12-565-35 For intubation
21 G Elastic catheter B.Braun 4251652-02 For intubation
MiniVent Ventilator Harvard Apparatus CGS-8009 For ventilation
Stemi DV4 Steromicroscope Fisher Scientific 12-070-515 For surgey
Absobable suture Ethicon PDP304 Surgical suture
Antibody against CD31 BD Biosciences 553370 Immunohistochemistry
Antibody against AQP5 Abcam AB78486 Immunohistochemistry
Antibody against SP-B Abcam AB40876 Immunohistochemistry

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Donaldson, G. C., Seemungal, T. A., Bhowmik, A., Wedzicha, J. A. Relationship between exacerbation frequency and lung function decline in chronic obstructive pulmonary disease. Thorax. 57, 847-852 (2002).
  2. Lopez-Campos, J. L., Calero, C., Quintana-Gallego, E. Symptom variability in COPD: a narrative review. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 8, 231-238 (2013).
  3. Ley, B., Collard, H. R., King, T. E. Clinical course and prediction of survival in idiopathic pulmonary fibrosis. Am J Respir Crit Care Med. 183, 431-440 (2011).
  4. Ferrer, M., et al. Chronic obstructive pulmonary disease stage and health-related quality of life. The Quality of Life of Chronic Obstructive Pulmonary Disease Study Group. Ann Intern Med. 127, 1072-1079 (1997).
  5. Reardon, J. Z., Lareau, S. C., ZuWallack, R. Functional status and quality of life in chronic obstructive pulmonary disease. Am J Med. 119, 32-37 (2006).
  6. De Vries, J., Kessels, B. L., Drent, M. Quality of life of idiopathic pulmonary fibrosis patients. Eur Respir J. 17, 954-961 (2001).
  7. Sullivan, S. D., Ramsey, S. D., Lee, T. A. The economic burden of COPD. Chest. 117, 5S-9S (2000).
  8. Orens, J. B., Garrity, E. R. General overview of lung transplantation and review of organ allocation. Proc Am Thorac Soc. 6, 13-19 (2009).
  9. Benden, C. Specific aspects of children and adolescents undergoing lung transplantation. Curr Opin Organ Transplant. 17, 509-514 (2012).
  10. Lyu, D. M., Zamora, M. R. Medical complications of lung transplantation. Proc Am Thorac Soc. 6, 101-107 (2009).
  11. Trulock, E. P., et al. Registry of the International Society for Heart and Lung Transplantation: twenty-fourth official adult lung and heart-lung transplantation report-2007. J Heart Lung Transplant. 26, 782-795 (2007).
  12. Weiss, D. J. Current status of stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Stem Cells. 32, 16-25 (2013).
  13. Ghaedi, M., et al. Human iPS cell-derived alveolar epithelium repopulates lung extracellular matrix. J Clin Invest. 123, 4950-4962 (2013).
  14. Ott, H. C., et al. Regeneration and orthotopic transplantation of a bioartificial lung. Nat Med. 16, 927-933 (2010).
  15. Petersen, T. H., et al. Tissue-engineered lungs for in vivo implantation. Science. 329, 538-541 (2010).
  16. Tuyl, M., et al. Angiogenic factors stimulate tubular branching morphogenesis of sonic hedgehog-deficient lungs. Dev Biol. 303, 514-526 (2007).
  17. Galambos, C., deMello, D. E. Molecular mechanisms of pulmonary vascular development. Pediatr Dev Pathol. 10, 1-17 (2007).
  18. McGrath-Morrow, S. A., et al. Vascular endothelial growth factor receptor 2 blockade disrupts postnatal lung development. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 420-427 (2005).
  19. White, A. C., Lavine, K. J., Ornitz, D. M. FGF9 and SHH regulate mesenchymal Vegfa expression and development of the pulmonary capillary network. Development. 134, 3743-3752 (2007).
  20. Zhao, L., Wang, K., Ferrara, N., Vu, T. H. Vascular endothelial growth factor co-ordinates proper development of lung epithelium and vasculature. Mech Dev. 122, 877-886 (2005).
  21. Stenmark, K. R., Abman, S. H. Lung vascular development: implications for the pathogenesis of bronchopulmonary dysplasia. Annu Rev Physiol. 67, 623-661 (2005).
  22. Mammoto, T., et al. LRP5 Regulates Development of Lung Microvessels and Alveoli through the Angiopoietin-Tie2 Pathway. PLoS ONE. 7, e41596 (2012).
  23. Mammoto, T., Jiang, E., Jiang, A., Mammoto, A. ECM structure and tissue stiffness control postnatal lung development through the LRP5-Tie2 signaling system. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49, 1009-1018 (2013).
  24. Ding, B. S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147, 539-553 (2011).
  25. Crivellato, E. The role of angiogenic growth factors in organogenesis. Int J Dev Biol. 55, 365-375 (2011).
  26. Sakurai, M. K., et al. Vascular endothelial growth factor accelerates compensatory lung growth after unilateral pneumonectomy. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 292, 742-747 (2007).
  27. Panigrahy, D., et al. Epoxyeicosanoids promote organ and tissue regeneration. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 13528-13533 (2013).
  28. Voelkel, N. F., Douglas, I. S., Nicolls, M. Angiogenesis in chronic lung disease. Chest. 131, 874-879 (2007).
  29. Hanumegowda, C., Farkas, L., Kolb, M. Angiogenesis in pulmonary fibrosis: too much or not enough. Chest. 142, 200-207 (2012).
  30. Levental, K. R., et al. Matrix crosslinking forces tumor progression by enhancing integrin signaling. Cell. 139, 891-906 (2009).
  31. Mammoto, A., Mammoto, T., Ingber, D. E. Mechanosensitive mechanisms in transcriptional regulation. J Cell Sci. 125, 3061-3073 (2012).
  32. Westermann, D., et al. Role of left ventricular stiffness in heart failure with normal ejection fraction. Circulation. 117, 2051-2060 (2008).
  33. Merchante, N., et al. Liver stiffness predicts clinical outcome in human immunodeficiency virus/hepatitis C virus-coinfected patients with compensated liver cirrhosis. Hepatology. 56, 228-238 (2012).
  34. Ding, B. S., et al. Inductive angiocrine signals from sinusoidal endothelium are required for liver regeneration. Nature. 468, 310-315 (2010).
  35. Fidler, I. J. Angiogenic heterogeneity: regulation of neoplastic angiogenesis by the organ microenvironment. J Natl Cancer Inst. 93, 1040-1041 (2001).
  36. Folkman, J. How is blood vessel growth regulated in normal and neoplastic tissue? G.H.A. Clowes memorial Award lecture. Cancer Res. 46, 467-473 (1986).
  37. Mammoto, A., et al. A mechanosensitive transcriptional mechanism that controls angiogenesis. Nature. 457, 1103-1108 (2009).
  38. Malinda, K. M. In vivo matrigel migration and angiogenesis assay. Methods Mol Biol. 467, 287-294 (2009).
  39. Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J Cell Mol Med. 10, 588-612 (2006).
  40. Mammoto, T., Jiang, A., Jiang, E., Mammoto, A. Platelet rich plasma extract promotes angiogenesis through the angiopoietin1-Tie2 pathway. Microvasc Res. 89, 15-24 (2013).
  41. Mosesson, M. W. Fibrinogen and fibrin structure and functions. J Thromb Haemost. 3, 1894-1904 (2005).
  42. Bensaid, W., et al. A biodegradable fibrin scaffold for mesenchymal stem cell transplantation. Biomaterials. 24, 2497-2502 (2003).
  43. Teichert-Kuliszewska, K., et al. Biological action of angiopoietin-2 in a fibrin matrix model of angiogenesis is associated with activation of Tie2. Cardiovasc Res. 49, 659-670 (2001).
  44. Lafleur, M. A., Handsley, M. M., Knauper, V., Murphy, G., Edwards, D. R. Endothelial tubulogenesis within fibrin gels specifically requires the activity of membrane-type-matrix metalloproteinases (MT-MMPs). J Cell Sci. 115, 3427-3438 (2002).
  45. Collen, A., et al. Aberrant fibrin formation and cross-linking of fibrinogen Nieuwegein, a variant with a shortened Aalpha-chain, alters endothelial capillary tube formation. Blood. 97, 973-980 (2001).
  46. Mammoto, T., et al. Mechanochemical Control of Mesenchymal Condensation and Embryonic Tooth Organ Formation. Dev Cell. 21, 758-769 (2011).
  47. Murphy, K. C., Leach, J. K. A reproducible, high throughput method for fabricating fibrin gels. BMC Res Notes. 5, 423 (2012).
  48. Matar, A. F., Hill, J. G., Duncan, W., Orfanakis, N., Law, I. Use of biological glue to control pulmonary air leaks. Thorax. 45, 670-674 (1990).
  49. Thetter, O. Fibrin adhesive and its application in thoracic surgery. Thorac Cardiovasc Surg. 29, 290-292 (1981).
  50. Rahbarghazi, R., et al. Juxtacrine and paracrine interactions of rat marrow-derived mesenchymal stem cells, muscle-derived satellite cells, and neonatal cardiomyocytes with endothelial cells in angiogenesis dynamics. Stem Cells Dev. 22, 855-865 (2013).
  51. Nucera, S., Biziato, D., De Palma, M. The interplay between macrophages and angiogenesis in development, tissue injury and regeneration. Int J Dev Biol. 55, 495-503 (2011).
  52. Joensuu, K., et al. Interaction between marrow-derived human mesenchymal stem cells and peripheral blood mononuclear cells in endothelial cell differentiation. Scand J Surg. 100, 216-222 (2011).
  53. Takakura, N. Role of intimate interactions between endothelial cells and the surrounding accessory cells in the maturation of blood vessels. J Thromb Haemost. 9 Suppl 1, 144-150 (2011).
  54. Plantier, L., Boczkowski, J., Crestani, B. Defect of alveolar regeneration in pulmonary emphysema: role of lung fibroblasts. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 2, 463-469 (2007).
  55. Belair, D. G., Murphy, W. L. Specific VEGF sequestering to biomaterials: influence of serum stability. Acta Biomater. 9, 8823-8831 (2013).
  56. Wong, C., Inman, E., Spaethe, R., Helgerson, S. Fibrin-based biomaterials to deliver human growth factors. Thromb Haemost. 89, 573-582 (2003).
  57. Stolzing, A., Colley, H., Scutt, A. Effect of age and diabetes on the response of mesenchymal progenitor cells to fibrin matrices. Int J Biomater. 2011, 378034 (2011).
  58. Vailhe, B., Ronot, X., Tracqui, P., Usson, Y., Tranqui, L. In vitro angiogenesis is modulated by the mechanical properties of fibrin gels and is related to alpha(v)beta3 integrin localization. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 33, 763-773 (1997).
  59. Kniazeva, E., Kachgal, S., Putnam, A. J. Effects of extracellular matrix density and mesenchymal stem cells on neovascularization in vivo. Tissue Eng Part A. 17, 905-914 (2011).
  60. Angio, C. T., Maniscalco, W. M. The role of vascular growth factors in hyperoxia-induced injury to the developing lung. Front Biosci. 7, 1609-1623 (2002).
  61. Kasahara, Y., et al. Inhibition of VEGF receptors causes lung cell apoptosis and emphysema. J Clin Invest. 106, 1311-1319 (2000).
  62. Owen, C. A. Roles for proteinases in the pathogenesis of chronic obstructive pulmonary disease. Int J Chron Obstruct Pulmon Dis. 3, 253-268 (2008).
  63. Demedts, I. K., et al. Elevated MMP-12 protein levels in induced sputum from patients with COPD. Thorax. 61, 196-201 (2006).
  64. Haq, I., et al. Association of MMP-2 polymorphisms with severe and very severe COPD: a case control study of MMPs-1, 9 and 12 in a European population. BMC Med Genet. 11, 7 (2010).
  65. Mercer, P. F., et al. MMP-9, TIMP-1 and inflammatory cells in sputum from COPD patients during exacerbation. Respir Res. 6, 151 (2005).
  66. Matute-Bello, G., et al. Essential role of MMP-12 in Fas-induced lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 37, 210-221 (2007).
  67. Sivakumar, P., Gupta, S., Sarkar, S., Sen, S. Upregulation of lysyl oxidase and MMPs during cardiac remodeling in human dilated cardiomyopathy. Mol Cell Biochem. 307, 159-167 (2008).
  68. Gomperts, B. N., Strieter, R. M. Stem cells and chronic lung disease. Annu Rev Med. 58, 285-298 (2007).
  69. Lau, A. N., Goodwin, M., Kim, C. F., Weiss, D. J. Stem cells and regenerative medicine in lung biology and diseases. Mol Ther. 20, 1116-1130 (2012).

Tags

Grunnleggende protokollen lunge angiogenese gjenfødelse fibrin gel implantasjon mikromiljø
Implantasjon av fibringel på Mouse Lung å studere Lung-spesifikke Angiogenese
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Mammoto, T., Mammoto, A.… More

Mammoto, T., Mammoto, A. Implantation of Fibrin Gel on Mouse Lung to Study Lung-specific Angiogenesis. J. Vis. Exp. (94), e52012, doi:10.3791/52012 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter