Summary
Her er en fremgangsmåde beskrevet til etablering af systemisk infektion i nyfødte rotter med kulturer af Escherichia coli K1. Denne ikke-invasiv procedure tillader kolonisering af mavetarmkanalen, translokation af patogenet til den systemiske cirkulation, og invasion af det centrale nervesystem ved choroid plexus.
Abstract
Undersøgelse af samspillet mellem værtsdyr og bakterielt patogen kun mening, hvis infektionen model anvendte replikerer de vigtigste elementer i den naturlige infektion. Denne protokol beskriver procedurer for etablering og evaluering af systemisk infektion på grund neuropathogenic Escherichia coli K1 i den neonatale rotte. Kolonisering af mavetarmkanalen fører til spredning af patogenet langs gut-lymfe-blod-hjerne løbet af infektion og modellen viser stærk afhængighed alder. En stamme af E. coli O18: K1 med øget virulens for den neonatale rotte producerer exceptionelt høje kolonisering, translokation til blodet rum og invasion i hjernehinden efter transit gennem chorioideus plexus. Som i den humane vært, er penetration af centralnervesystemet ledsaget af lokal inflammation og en uvægerligt dødelig udgang. Modellen er bevist anvendelighed til studier af mekanismenaf patogenese, til evaluering af terapeutiske indgreb og til vurdering af bakteriel virulens.
Introduction
Systemiske bakterielle infektioner er en stor trussel mod trivsel og overlevelse af den nyfødte; præmature børn er særligt sårbare. Neonatal bakteriel meningitis (NBM), ofte forbundet med bakteriel sepsis, fortsætter med at være en væsentlig kilde til dødelighed og sygelighed i de første par uger af livet, og problemet forværres af den fortsatte udvikling af resistens over for frontline antibakterielle stoffer 1,2. Et tilfælde af NBM er en medicinsk nødsituation, der indebærer en høj medicinsk, social og økonomisk byrde 3; derfor er der et presserende behov for nye lægemidler, og især nye profylaktiske strategier til at mindske byrden for infektion. Nogle NBM funktioner er usædvanligt: i den udviklede verden, Escherichia coli og Gruppe B streptokokker er ansvarlige for det store flertal af sager, og kapaciteten af disse stammer til at fremkalde NBM er næsten altid forbundet med tilstedeværelsen af en beskyttende polysaccharid capsule der gør det muligt at patogenet at unddrage immungenkendelse processer 4. En meget stor del (80-85%) af neuroinvasive E. coli udtrykke K1 kapsel 5,6, en α-2,8-bundet polysialic-polymer, der er strukturelt identiske vært for modulatorer af neuronal plasticitet 7.
Evaluering af nye behandlings- og profylaktiske for NBM og tilhørende bakteriæmi og sepsis vil klart drage fordel af en robust dyremodel for infektion, der efterligner de centrale træk ved sygdommen i den menneskelige nyfødte, især den stærke alder afhængighed og den naturlige vej for infektion . En bred vifte af modeller for Gram-positive og Gram-negative bakterielle meningitis er tilgængelige 8,9 og disse har betydeligt udvidet vores viden om patogenese, patofysiologi og behandlingsmuligheder i disse infektioner. Således har eksperimentelle infektioner i rotter, mus, kaniner og aber er blevet anvendt til at undersøge meningitis i både neonate og den voksne. Men mange af disse modeller anvender direkte intracisternal eller subkutan injektion af bakterier til initiering af infektion, hvilket skaber en kunstig patogenese ved at omgå de naturlige processer i formidling fra stedet for kolonisering. I nogle tilfælde er disse metoder til podning ført til væsentlige ændringer i patologi; for eksempel subkutan administration af E. coli K1 stammer ophævede alder afhængighed forbundet med naturlig infektion, der producerer bakteriæmi og invasion af det centrale nervesystem (CNS) i begge nyfødte og voksne 10. Disposition til E. coli NBM er kritisk afhængig af vertikal transmission af den agens fra mor til barn ved eller kort efter fødslen 11. Maternelle E. coli K1 bakterier koloniserer den neonatale mave-tarmkanalen (GI) 11-13, der er steril ved fødslen, men hurtigt opnår en kompleks mikroflora 14. I koloniserede nyfødte, E. coliK1 bakterier har evnen til at translokere fra det intestinale lumen ind i den systemiske cirkulation før indtastning CNS over blod-hjerne eller blod-cerebrospinalvæske væskebarrierer 9,15. Design af robuste modeller af eksperimentel infektion bør tage hensyn til oplysningerne vedr.
Selv om mus er blevet almindeligt anvendt til undersøgelse af visse former af bakteriel meningitis 8, er de uegnede til undersøgelser af neonatal infektion: de er overvældet af systemisk infektion og viser ikke den stærke afhængighed alder karakteristisk for det menneskelige spædbørn 16. Yderligere α-defensiner, centrale peptider i mavetarmkanalen yde beskyttelse mod systemisk invasion af E. coli K1 17, er højt udtrykt i Paneth celler og neutrofiler hos mennesker og rotter, men ikke i mus 18. Der er en bemærkelsesværdig grad af overlapning, redundans og heterogenitet i mus defensin og relaterede cryptidin generne ikke findes i andre enimals 19. Neonatal rotte blev anvendt først ved Moxon og medarbejdere 20 at undersøge patogenesen af Haemophilus influenzae-meningitis efter intranasal inokulation replikerer naturlige sted for kolonisering af dette neonatal patogen i mennesker, og derefter tilpasset til aldersbetinget E. coli K1 bakteriæmi og meningitis. Bortolussi et al. 21 ansat intraperitoneal injektion af det bakterielle inokulum at initiere infektion, men den primære undersøgelse af Glode og medarbejdere 22 brugt oral gastrisk fodring parallel den naturlige rute for infektion efter GI kolonisering. Som ventrikelsondekanalen kan beskadige slimhindeoverflader blev proceduren raffineret omfatter fodring af inoculum til nyfødte 23. Her fremgangsmåde til mavetarmkanalen kolonisering og procedurerne til at spore infektion i modtagelige rotteunger er beskrevet; derudover er terapeutiske og forebyggende anvendelser af model diskuteret.
Protocol
Alle dyreforsøg udført i denne undersøgelse var i overensstemmelse med national og europæisk lovgivning og blev godkendt af Etisk Komité UCL School of Pharmacy og det britiske indenrigsministerium (HO). Alt animalsk arbejde blev udført under HO projekt licenser PPL 80/2243 og PPL 70/7773.
1. Rat Forberedelse
- Foretag alle in vivo forsøg med patogenfrie Wistar neonatale rotter.
- Behold alle rotte kuld (12 nyfødte pr koloni) i individuelle bure med deres ammende mødre (9-11 uger gamle hunner), under optimale betingelser (19-21 ° C, 45-55% luftfugtighed, 15-20 luftskifter / time og 12 timers lys / mørke cyklus).
2. Bakteriel Cell Fremstilling
- Store E. coli K1 lagre i 20% (v / v) glycerol ved -80 ° C. For hvert eksperiment plade ud stock bakterier onto Mueller-Hinton (MH) agarplader og inkuberes ved 37 ° CO / N.
- Dagen før fodring, inocusene 10 ml MH bouillon med en enkelt E. coli K1 koloni og kultur O / N ved 37 ° C, 200 rpm. Som en kontrol for medium kontaminering forberedes 10 ml uinokuleret MH bouillon og inkuberes ved 37 ° C ved 200 rpm.
- Transfer 100 pi O / N bakteriel suspension i 9,9 ml MH bouillon (1: 100 v / v), og der inkuberes ved 37 ° C, 200 rpm, indtil midten af eksponentielle fase er nået, hvilket svarer til en optisk densitet på 0,6 målt ved en bølgelængde på 600 nm (OD 600).
3. Fodring af neonatale rotter med E. coli K1
- Hold forsigtigt dyret lodret i den ene hånd fra nakken, så munden for at åbne. Sæt langsomt steril pipettespids i munden af dyret, og pipette 20 pi af inoculum (~ 37 ° C) i munden af dyret i løbet af 30 sek tidsperiode. Sende dyret tilbage til moderen umiddelbart efter fodring.
- Kontroller, at 4-8 x 10 6 bakterier er blevet fodret to hver pup ved seriel fortynding af inoculum i PBS og spotting på MH agarplader.
4. Vurdering af Colonization af E. coli K1
- Hold forsigtigt dyret i den ene hånd fra nakken. Fugt en steril vatpind i sterilt PBS, og derefter aftør forsigtigt endetarmsåbning område. Sende dyret tilbage til moderen umiddelbart efter pensling.
- Placere podepinden spids i et rør indeholdende 300 pi sterilt PBS og opbevares på is.
- Bestemme antallet af levedygtige bakterier ved seriel fortynding i PBS og udpladning på MacConkey agarplader.
- Bestem levedygtig E. coli K1 ved bakteriofag resistensbestemmelse. Vælge en enkelt koloni ved anvendelse af en steril mikrobiologisk loop, dyppet i 200 pi sterilt PBS, underkastes derpå hvirvelblanding.
- Ved hjælp af en steril mikrobiologisk løkke, sub-kultur på MH agar i en lige linje. Lad pladen tørre i 30 sekunder, og derefter afpipetteres 10 pi bacteriophage K1E (10 9 plaquedannende enheder / ml (PFU / ml)) på midten af linjen. Inkubér pladen O / N ved 37 ° C.
- Næste dag, undersøge plade til bakteriofag-medieret lyse.
5. Vurdering af sværhedsgrad af sygdommen
- Vurdere sygdommens sværhedsgrad af hvert dyr 4 - 5 gange dagligt ved hjælp af syv-pointsystem er skitseret i tabel 1.
- Hvis et dyr scorer ≥3 ud af 7, straks frasortering dyret at minimere dyrenes lidelser. Optag dyret som døde.
6. euthanization af neonatale rotter og blodprøvetagning
- Hold forsigtigt dyret i den ene hånd, og udsætter hoved og hals. Desinficere halsen af dyret ved aftørring med en spritserviet. Desinficere en stor saks anvender 70% ethanol, før skylning i sterilt PBS for at fjerne spor af ethanol.
- Hold forsigtigt dyret direkte over en petriskål. Halshugge den nyfødte ved hjælp af skarpe Surgical saks, der sikrer, at blodet drypper ind i petriskål. Undgå kontakt med hovedet for at forhindre forurening af blod med hud flora.
- Umiddelbart indsamle blod under anvendelse af en steril pipette og blandes med heparin-natriumsalt i en koncentration på fra 20 til 50 enheder / ml i en 0,5 ml mikrocentrifugerør.
- Bestemme antallet af levedygtige bakterier ved seriel fortynding i PBS og udpladning på MacConkey agarplader. Bestem antallet af levedygtige E. coli K1 ved at teste følsomheden af levedygtige bakterier til bakteriofager K1E.
7. Dissektion
- Efter halshugningen af den neonatale rotte bruge aseptiske forhold for at udskære og indsamle væv af interesse. Vask alle instrumenter (vist i figur 1) i 70% ethanol og sterilt PBS.
- Rengør dissektion bord og våde maven helt med 70% ethanol. Placer liget om på ryggen og fastgør til dissektion bord ved (i) pinning venstre bagben tiloperationsbordet med en steril nål, (ii) at strække liget og pinning højre forben operationsbordet, (iii) pinning højre bagben og venstre forben operationsbordet.
- Træk huden langs venstre side af underlivet ved hjælp af pincet, derefter skæres langs den venstre side af liget fra underlivet til brystbenet ved hjælp af små dissektion saks.
- Udvide excision over brystbenet, og derefter ned i højre side af liget fra brystbenet til maven ved anvendelse af pincetter og små dissektion saks, der sikrer, at ingen af de underliggende strukturer er beskadiget.
- Endelig forsigtigt trække ned hudlap fra brystbenet til underlivet hjælp iris buede dissektion pincet til at eksponere bughinden.
- Hæv forsigtigt bughinden med pincet og skæres lodret for at blotlægge de indre organer, der sikrer, at ingen af de underliggende organer er beskadiget.
8. IndsamlingGI Tract
- Identificere maven, tyndtarmen, coecum, colon og mesenteriske lymfesystemet.
- Fjern maven ved forsigtigt transecting på begge sider, og derefter placere i en bijou indeholdende 1,6 ml sterilt PBS ved hjælp af steril pincet.
- Transektere tyktarmen på endetarmen. Træk forsigtigt hele tarm masse fra liget ved hjælp af dissektion pincet og sted i en steril petriskål. Sikre, at dette er gjort let, så tarmens struktur og mesenteriallymfeknuderne lymfatiske strukturer ikke adskille.
9. Separation af mavetarmkanalen og Mesenterial lymfesystemet (figur 2)
- Hæld 30 ml sterilt PBS i petriskålen sikre mavetarmkanalen er helt neddykket.
- Identificer den centrale masse mesenterial lymfesystemet, og knibe med fin dissektion pincet. Identificer den mest proksimale del af tyndtarmen, og knibe med fin dissektion pincet.
- Træk langsomt central massen af mesenteriske lymfesystemet og den distale tyndtarm i modsatte retninger, indtil de to væv er fuldstændig adskilt fra hinanden. Udfør denne proces med omhu for at sikre, at de små tarme ikke er strakt, da dette forhindrer reproducerbar indsamling af proksimal, midterste og distale regioner. Placer mesenteriske lymfesystemet i 300-500 pi sterilt PBS og anbring på is.
10. Sektionsinddeling af mavetarmkanalen
- Transektere mavetarmkanalen på coecum at adskille tyndtarmen fra tyktarmen.
- Placer kolon i 300-500 pi sterilt PBS og placere på is.
- Indsamle repræsentative væv fra proksimale, midterste og distale områder i tyndtarmen. Juster tyndtarmen fra midtpunktet.
- Derefter (i) at indsamle de sidste 2 cm af væv før blindtarmen som den distale tyndtarm, (ii) at indsamle vævet 5-7 cm over midtpunktet som den proximale tyndtarm, og(Iii) indsamle vævet 3-5 cm under midtpunktet som i midten tyndtarmen.
11. Indsamling leveren
- Identificere de tre kamre af rottelever efter fjernelse af maven.
- Træk lapper væk fra bughulen med fin dissektion pincet.
- Fjern leveren ved at skære alle knyttet ledbånd ved hjælp af fine saks. Placer lever i 300-500 pi sterilt PBS og sted på is.
12. Indsamling Spleen
- Identificer milten.
- Træk milt væk fra maven og bruge fine saks til at klippe gastrosplenic ligament.
- Placer milt i 300-500 pi sterilt PBS og sted på is.
13. Indsamling af nyrerne
- Identificere nyrerne, der bliver synlig på bagsiden af bughulen ved fjernelse af mavetarmkanalen og andre organer.
- Afskårne urinlederne og eventuelle knyttet ledbånd usynge fine dissektion saks og fjern nyrer hjælp fine pincet. Fjern binyrerne og fede materiale (hvis det stadig er vedhæftet) ved hjælp af fine pincet og dissektion saks.
- Placer begge nyrer i 300-500 pi sterilt PBS og placere på is.
14. Indsamling af Brain
- Efter halshugning, holde hovedet i en oprejst position ved hjælp buede pincet. Klem huden på toppen af hovedet i længderetningen ved hjælp af et andet sæt buede pincet, og gøre et snit med fin dissektion saks. Skær resterende huden nær halsen, igen på langs med fine dissektion saks.
- Træk huden i en udad retning ved hjælp af fine tænger på begge sider til at afsløre kraniet og fjerne hud flapper med fin dissektion saks. Placer fine dissektion saks i spinal åbning og lave et snit langs kraniet mod talerstolen.
- Træk begge sektioner af kraniet i en udad retning ved hjælp af fine tænger. Klip til at fjerne kraniet segmenter.
15. vævsbehandling og Homogenisering
- Til eksperimenter, der kræver levedygtighed tæller eller DNA-ekstraktion, sted væv i rør indeholdende sterilt PBS. Umiddelbart bestemme antallet af levedygtige bakterier ved seriel fortynding i PBS og udpladning på MacConkey agarplader, eller opbevares ved -20 ° C med 20% glycerol for kort sigt. For DNA-ekstraktion, opbevare væv ved -20 ° C.
- Til eksperimenter, der kræver RNA ekstraktion, sted væv i passende mængder RNAlater opløsning (10 pi pr 1 mg væv), derefter gemme straks ved -20 ° C til kortvarig eller ved -80 ° C langtidsopbevaring.
- For eksperimenter, der kræver billedbehandling sted væv i 10 ml Methacarn opløsning (60% methanol, 30% chloroform og 10% eddikesyre) og opbevare ent RT (20-25 ° C) i op til 3 uger.
- Beregn vævsvægt ved sammenligning af vægten af rør før og efter tilsætningen af væv. Homogenisere væv under anvendelse af en homogenisator. Vask homogenisatoren gang i 70% ethanol og to gange i sterilt PBS i mellem homogenisering af hver prøve.
BEMÆRK: Methacarn fiksering er ønskeligt til fiksering af tarmprøver for at bevare mucin-relaterede mucosale forsvar strukturer; formalinfiksering kan anvendes til systemiske væv.
Representative Results
E. coli K1 systemisk infektion model beskrives her replikerer mange af funktionerne i den naturlige infektion hos mennesker. Bakterierne indtages, kolonisere mavetarmkanalen, translocerer i blodet rum via mesenteriallymfeknuder før oprettelse organ-specifik sygdom med tilhørende hjernebetændelse 24. Vigtigere, viser model stærk afhængighed alder; som vist i figur 3, to dage gamle (P2) rotteunger er meget modtagelige for invasiv sygdom, men i løbet af en syv-dages periode dyrene bliver progressivt mere resistent over for infektion, men ikke til mavetarmkanalen kolonisering 17. Efter transit fra det sted GI kolonisering til blodet rum, hvis bakterierne kan visualiseres i blodprøver ved fluorescens mikroskopi (figur 4) før indtastning CNS overvejende på plexus chorioideus 25. I nogle dyr, der er omfattende invasion af andre større organer såsomlunge, milt og nyre 25.
Antallet af bakterier i væv kan variere betydeligt mellem individuelle hvalpe 25, men når biobelastningen scores som enten er til stede eller fraværende der er en høj grad af reproducerbarhed med hensyn til organ invasion. Med et kuld på 12 hvalpe som en enkelt test kohorte, power beregninger ved hjælp af G * Power Software fastslået, at denne prøve størrelse svarer til en sandsynlighed 98,6% for at finde en effekt baseret på overlevelse ved hjælp af seks dyr fra kohorten, og> 99% sandsynlighed, hvis alle tolv tages i betragtning. Modellen er derfor egnet til vurdering af nye midler skræddersyet til behandling af neonatale bakterielle infektioner og har været anvendt i proceduren til at vurdere det terapeutiske potentiale af kapslen depolymerase EndoE der selektivt fjerner K1 kapsel fra den bakterielle overflade 24-26. Det kan også anvendes til at undersøge host-bakterie interaktioner der har indflydelse på pathogenesis af E. coli neuropathogens; i denne sammenhæng er det blevet anvendt til undersøgelser af E. coli A192PP kolonisering og formidling. Det er blevet påvist, at E. coli A192PP celler fortsætter i mavetarmkanalen af P2, P5 og P9 hvalpe i stort tal; tidsmæssige aspekter af kolonisering i disse tre grupper var meget ens (figur 5) og afspejler kapaciteten af bakterierne til at replikere og opretholde befolkningstæthed i tarmen.
Virulensen af klinisk isolat A192 blev styrket ved seriel passage i neonatale rotter for at sikre ringe eller ingen redundans af anvendelsen af dyr. E. coli A192 koloniseret P2 neonatale rotter med 100% effektivitet, fremkaldte bakteriæmi hos 35% af dyrene og produceret en dødelig effekt på 25% 27. Den passage derivat A192PP koloniserer mave-tarmkanalen, producerer bakteriæmi og forårsager dødelighed i alle P2 unger. Således kan modellen anvendes til at undersøge virulensen af different K1 stammer med hensyn til deres evne til at invadere CNS og andre organsystemer fra stedet for kolonisering. I denne sammenhæng Pluschke og medarbejdere 23 anvendes en neonatal rotte infektion til bestemmelse kapacitet på 95 E. coli K1 stammer af human oprindelse til at forårsage bakteriæmi efter gut kolonisering; de observerede store variationer i effektiviteten af både kolonisering og invasive kapacitet, der understøtter den klonale natur E. coli K1 neuropathogens.
Figur 1. Materialer til væv samling: (A) vejning skala, (B) forvejede rør indeholdende de nødvendige medier, (C) operation bord, lineal og nåle at pin ned dyret, (D) 70% (v / v) ethanol og PBS at sterilisere vævet opsamlingsmateriel,
Figur 2. Adskillelse af mavetarmkanalen og mesenterial lymfesystemet. (A) Grip den centrale masse af mesenteriske lymfesystemet med fine dissektion pincet. (B) Grip den proximale del af tyndtarmen, og trække i modsatte retninger. (C) mavetarmkanalen og mesenteriske lymfesystemet vil fuldt separatelye. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 3. Survival of neonatale rotteunger alderen fra to dage (P2) til ni dage (P9) efter oral administration af E. coli A192PP, der illustrerer den stærke afhængighed af systemisk infektion alder. Hver gruppe repræsenterer 24 nyfødte.
Figur 4. Fluorescensbilleder E. coli A192PP celler i en blodudstrygning fra en P2 pup inficeret efter oral administration af bakterier. lipopolysaccharid O antigen på den bakterielle overflade var stained med kanin-anti-O18 polyklonale antistof og Alexa546-konjugeret gede-anti-kanin andet antistof. K1 kapsel blev visualiseret med EndoE-GFP reagens. Stort set alle bakterier påvises i blodprøver viste den beskyttende K1 kapsel. Billeder blev taget til fange af Dr. Andrea Zelmer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.
Figur 5. E. coli A192PP intestinal kolonisering efter administration af det bakterielle inokulum. DNA blev ekstraheret fra hele tarmen og E. coli K1 kolonidannende enheder / g (CFU / g) væv bestemt ved kvantitativ polymerasekædereaktion (qPCR) rettet mod polysialyltransferase (Neus) genet som beskrevet andetsteds 17
| Feature | Sund | Usund |
| Farven på huden | Pink | Pale / Gul |
| Agility (stabilitetsrefleks) | Pup straks vender om baglæns placering | Vanskeligheder med at vende tilbage placering (> 3 sek), eller ikke kan opnå |
| Et let tryk på underlivet | Ingen lyd | Sound of agitation |
| Mave / mælkeledning | Synlig og hvid | Ikke synlig |
| Temperatur | Varm | Relativt koldt * |
| Vægt | Gevinst på 1,5-2 g per dag | Ingen vægtøgning eller vægttab |
| Adfærd, når de anbringes i bur | Bevæger sig i retning mor og starter feeding | Kan ikke bevæge sig mod mor og viser svært fodring |
Tabel 1. Syv-pointsystem: De første tre scoringer opført er som regel de første tegn observeres. * Nyfødte med systemisk infektion erfaring forhøjet kropstemperatur (> 2 ° C). Men på grund af den manglende smidighed af dyr for at nå deres mor til at opretholde kroppens temperatur, kan usunde dyr blive adskilt fra kuldet og føler koldt på den bare hånd.
Discussion
Dyremodellen beskrevet her bygger på tidligere arbejde, der har til formål at gengive de vigtigste træk ved naturligt forekommende infektioner hos mennesker. Neonatale rotter blev oprindeligt anvendt til at studere spædbarn meningitis grund H. influenzae type b, som arten opfyldte de vigtigste kriterier for en robust model for infektion. Således bør indgangsport af det relevante patogen afspejle det naturlige menneskelige infektion og reproducerbart give anledning til lignende patologi af tilstrækkelig varighed til at tillade terapeutisk intervention. De teknikker, der anvendes, bør ikke begrænse anvendelsen af proceduren, og bør ikke bidrage til sygdom resultat 20. Modellen for H. influenzae meningitis i spædbarn rotter udviklet af Moxon og kolleger opfylder disse kriterier 20; naturlig infektion forekommer efter kolonisering af slimhinderne i de øvre luftveje og denne vigtige funktion blev gentaget i rotteunger af ikke-traumetic instillation af bakterierne på membranerne i de nasale passager. Vigtigere, blev aldersbetinget infektionens art replikeres i modellen.
Den samme gruppe var også den første til at udvikle en ikke-invasiv model af E. coli K1 NBM i den neonatale rotte-22. Patogenfrit Sprague-Dawley unger blev koloniseret af fodring 10 august-10 oktober bakterier gennem en mundtlig gastrisk rør; inokulum derfor var betydeligt højere end den, der anvendes af os. Kolonisering med de tre K1 undersøgte stammer, C94 (O7: K1: H), EC3 (O1: K1: H) og LH (Ø75: K1: H3) forekommer i en relativt høj andel (48-74%) af K1-fodrede dyr, men forekomsten af bakteriæmi, meningitis og dødelighed var variabel og signifikant lavere end satserne for kolonisering. Den klonale natur af E. coli K1 eksperimentel infektion blev etableret senere 23, og det er nu klart, at kun O18: K1 og, i mindre grad, O7: K1 serotyper er i standtil konsekvent at forårsage systemisk infektion. Af denne grund er disse undersøgelser af patogenesen af neuropathogenic E. coli K1 var baseret på brugen af virulens-forstærket O18: K1 stamme A192PP. En sammenligning af E. coli K1 fodring af neonatale rotter ved en gastrisk slange, som anvendes af Glode og kolleger 22, og en dråbe fodring metode som ansat ved Achtman gruppe 23 afslørede store antal dødsfald ved hjælp af den tidligere metode, næsten helt sikkert på grund af skader på slimhindeoverflader ved gastrisk rør. Da satserne for kolonisering er sammenlignelige med disse to metoder, anbefales det at bruge mindre invasiv metode til at fodre bakterierne ved hjælp af en pipette med en steril spids, som er beskrevet i denne meddelelse.
E. coli-stamme A192PP brugt i vores studier er O18: K1. Det er en mere virulent derivat af den kliniske stamme E. coli A192, der oprindeligt blev udvundet fra en patient med sepsis 27 26. Stammen fremkalder en aldersbetinget sygdom sværhedsgrad, med 100% bakteriæmi og dødelighed, når det administreres til 2 dage gamle dyr 28. I modsætning 9 dage gamle dyr er fuldstændigt resistente over for sygdomme. K1-specifikke lytiske bakteriofager kan anvendes til at skelne E. coli K1 fra andre E. coli stammer 29. I denne undersøgelse, skal følsomheden af levedygtige bakterier til bakteriofag K1E anvendes til (i) at kontrollere renheden af E. coli K1 suspensioner parat til at blive fodret til dyrene, og (ii) at skelne E. coli K1 fra andre colibakterier for at beregne rentabiliteten i endetarmsåbning podninger, blod og vævsprøver. Hvis kolonien er E. coli K1, vil det være modtagelige for bakteriofag K1E lysis, og bakteriel vækst hæmmes ved stedet for bakteriofag inokulering. Hvis kolonien er ikke E. coli K1, vil det be resistente over for KIE bakteriofag lysis, og der bør være et område med bakterievækst i stedet for bakteriofag inokulering. Det skal erindres, at dyremodeller ikke kan afspejle alle funktioner af den naturligt forekommende sygdom. Den nuværende model kan modificeres til at undersøge virulens karakteristika som andre end E. neuropathogenic bakterier coli A192PP og variationer i størrelsen af den koloniserende inoculum kan imødekommes. Fremtidige anvendelser af teknikken kunne omfatte evaluering af tiltrængte lægemidler til at behandle den betingelse, og at afdække detaljerne i værtens respons på kolonisering og væv invasion.
Den her beskrevne metode er enkel, men effektiv. Single kuld på 10 - 12 unger blev ansat som test- eller kontrolgrupper og det inden-kuld tilgang sikrer en høj grad af reproducerbarhed og statistisk gyldighed. Det er bydende nødvendigt, at hvalpene kommer tilbage til deres naturlige mødre snarest muligt efter enhver procedure og kuld bør derfor ikke omfatte dyr, der forskellige indgreb. Det er vigtigt, at Fed inokulum opvarmes ellers hvalpene vil afvise den tilbudte kultur. Hvalpene hurtigt at udvikle en kompleks mikrobioter og inden for to dage efter fødslen mavetarmkanalen er koloniseret med en bred vifte af bakterier fra rækkerne etableret som de mest udbredte mikrober i spædbørn og voksne tarmen. Hvalpe, der ikke er blevet fodret E. coli A192PP ikke bære E. coli K1 i mavetarmkanalen 17 og så bestemmelse af satserne for kolonisering er forholdsvis ligetil. Imidlertid NEUS -baserede qPCR metode til påvisning kolonisere E. coli K1 er langt mere følsomme, at de traditionelle dyrkningsmetoder og anbefales kraftigt 17.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de ikke har nogen konkurrerende finansielle interesser.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af forskningsbevillinger G0400268 og MR / K018396 / 1 fra Medical Research Council, og ved aktion Medical Research. Yderligere støtte blev leveret af National Institute for Health Research University College London Hospitals Biomedical Research Centre.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Pathogen-free Wistar rats (12 x neonate, 1 x lactating mother) |  Harlan, UK |
||
| E. coli K1 A192PP | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Bacteriophage K1E | Taylor lab |
Mushtaq et al. 2004 | |
| Glycerol | Sigma, UK |
G5516 | |
| Mueller-Hinton Agar | Oxoid, UK |
CM0037 | |
| Mueller-Hinton Broth | Oxoid, UK |
CM0405 | |
| MacConkey Agar | Oxoid, UK |
CM0007 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma, UK |
P4417 | |
| Ethanol 100% | Sigma, UK |
E7023 | |
| Heparin Sodium Salt | Sigma, UK |
84020 | Prepare 20 - 50 units/ml |
| RNAlater Solution | Sigma, UK |
R0901 | 10 μl/mg tissue |
| Acetic Acid | Sigma, UK |
320099 | |
| Chloroform | Sigma, UK |
C2432 | |
| Methanol | Sigma, UK |
322415 | |
| Cotton-tipped swabs | Fisher Scientific, UK |
11542483 | |
| Alcotip Swabs | Scientific Laboratory Supplies, UK |
SWA1000 | |
| Petri dishes | Sigma, UK |
P5856 | |
| 30 ml Universal Tube | AlphaLaboratories, UK |
CW3890 | |
| 0.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1405-1500 | |
| 1.5 ml microcentrifuge tubes | StarLab, UK |
I1415-1000 | |
| 0.1 μl calibrated loops | StarLab, UK |
E1412-0112 | |
| L-shaped spreaders | StarLab, UK |
E1412-1005 | |
| Cuvettes | Fisher Scientific, UK |
10594175 | |
| Forceps straight with fine points | Fisher Scientific, UK |
12780036 | |
| Forceps straight with blunt tips | Fisher Scientific, UK |
12391369 | |
| Forceps watchmaker's curved with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12740926 | |
| Scissors straight with very fine points | Fisher Scientific, UK |
12972055 | |
| Laboratory Scissors | VWR, UK |
USBE4251 | |
| 25 G Syringe Needles | Greiner Bio-One Ltd |
N2525 | |
| LAMBDA 25 UV/Vis Spectrophotometers | PerkinElmer, UK |
L60000BB | |
| Unitemp Incubator | B&T, UK | OP958 | |
| Multitron shaking incubator | INFORS HT, UK |
AJ118 | |
| Ultra-Turrax T-10 homogenizer | IKA Werke |
0003737000 |
References
- Harvey, D., Holt, D. E., Bedford, H. Bacterial meningitis in the newborn: a prospective study of mortality and morbidity. 23 (5), 218-225 (1999).
- Brouwer, M. C., Tunkel, A. R., van de Beek, D. Epidemiology diagnosis, and antimicrobial treatment of acute bacterial meningitis. Clin. Microbiol. Rev. 23 (3), (2010).
- Silva, L. P. A., Cavalheiro, L. G., Queirós, F., Nova, C. V., Lucena, R. Prevalence of newborn bacterial meningitis and sepsis during the pregnancy period for public health care system participants in Salvador, Bahia, Brazil. J. Infect. Dis. 11 (2), 272-276 (2007).
- Levy, O. Innate immunity of the newborn: basic mechanisms and clinical correlates. Nat. Rev. Immunol. 7 (5), 379-390 (2007).
- Robbins, J. B., et al. Escherichia coli K1 capsular polysaccharide associated with neonatal meningitis. N. Eng. J. Med,, et al. 290 (22), 1216-1220 (1974).
- Korhonen, T. K., et al. hemolysin production, and receptor recognition of Escherichia coli strains associated with neonatal sepsis and meningitis. Infect. Immun. 48 (2), 486-491 (1985).
- Rutishauser, U. Polysialic acid in the plasticity of the developing and adult vertebrate nervous system. Nat. Rev. Neurosci. 9 (1), 26-35 (2008).
- Koedel, U., Pfister, H. W. Models of experimental bacterial meningitis. Infect. Dis. Clin. North Am. 13 (3), 549-577 (1999).
- Tunkel, A. R., Scheld, W. M. Pathogenesis and pathophysiology of bacterial meningiits. Clin. Microbiol. Rev. 6 (2), 118-136 (1993).
- Kim, K. S., et al. The K1 capsule is the critical determinant in the development of Escherichia coli meningitis in the rat. J. Clin. Invest. 90 (3), 897-905 (1992).
- Obata-Yasuoka, M., Ba-Thein, W., Tsukamoto, T., Yoshikawa, H., Hayashi, H. Vaginal Escherichia coli share common virulence factor profiles, serotypes and phylogeny with other extraintestinal E. coli. Microbiology. 148 (9), 2745-2752 (2002).
- Sarff, L. D., et al. Epidemiology of Escherichia coli K1 in healthy and diseased newborns. Lancet. 305 (7916), 1099-1104 (1975).
- Schiffer, M. S., et al. A review: relation between invasiveness and the K1 capsular polysaccharide of Escherichia coli. Pediatr. Res. 10 (2), 82-87 (1976).
- Palmer, C., Bik, E. M., DiGuilio, D. B., Relman, D. A., Brown, P. O. Development of the human infant intestinal microbiota. PLoS Biol. 5 (7), 1556-1573 (2007).
- Nassif, X., Bourdoulous, S., Eugène, E., Couraud, P. O. How do extracellular pathogens cross the blood-brain barrier. Trends Microbiol. 10 (5), 227-232 (2002).
- Moxon, E. R., Glode, M. P., Sutton, A., Robbins, J. B. The infant rat as a model of bacterial meningitis. J. Infect. Dis. 136, 186-190 (1977).
- Birchenough, G. M. H., et al. Altered innate defenses in the neonatal gastrointestinal tract in response to colonization by neuropathogenic Escherichia coli. Infect. Immun. 81 (9), 3264-3275 (2013).
- Ganz, T. Defensins: antimicrobial peptides of innate immunity. Nat. Rev. Immunol. 3 (9), 710-720 (2003).
- Bevins, C. L., Salzman, N. H. Paneth cells, antimicrobial peptides and maintenance of intestinal homeostasis. Nat. Rev. Microbiol. 9 (5), 356-368 (2011).
- Moxon, E. R., Smith, A. L., Averill, D. R., Smith, D. H. Haemophilus influenzae meningitis in infant rats after intranasal inoculation. J. Infect. Dis. 129 (2), 154-162 (1974).
- Bortolussi, R., Ferrieri, P., Björkstén, B., Quie, P. G. Capsular K1 polysaccharide of Escherichia coli: relationship to virulence in newborn rats and resistance to phagocytosis. Infect. Immun. 25 (1), 293-298 (1979).
- Glode, M. P., Sutton, A., Moxon, E. R., Robbins, J. B. Pathogenesis of neonatal Escherichia coli meningitis: induction of bacteremia and meningitis in infant rats fed E. coli K1. Infect. Immun. 16 (1), 75-80 (1977).
- Pluschke, G., Mercer, A., Kusećek, B., Pohl, A., Achtman, M. Induction of bacteremia in newborn rats by Escherichia coli K1 is correlated with only certain O (lipopolysaccharide) antigen types. Infect. Immun. 39 (2), 599-608 (1983).
- Zelmer, A., et al. Administration of capsule-selective endosialidase E minimizes changes in organ gene expression induced by experimental systemic infection with Escherichia coli K1. Microbiology. 156 (7), 2205-2215 (2010).
- Zelmer, A., et al. Differential expression of the polysialyl capsule during blood-to-brain transit of neuropathogenic Escherichia coli K1. Microbiology. 154 (8), 2522-2532 (2008).
- Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Prevention and cure of systemic Escherichia coli K1 infection by modification of the bacterial phenotype. Antimicrob. Agents Chemother. 48 (1), 1503-1508 (2004).
- Achtman, M., et al. Six widespread bacterial clones among Escherichia coli K1 isolates. Infect. Immun. 39 (1), 315-335 (1983).
- Mushtaq, N., Redpath, M. B., Luzio, J. P., Taylor, P. W. Treatment of experimental Escherichia coli. infection with recombinant bacteriophage-derived capsule depolymerase. J. Antimicrob. Chemother. 56 (5), 160-165 (2005).
- Gross, R. J., Cheasty, T., Rowe, B. Isolation of bacteriophages specific for the K1 polysaccharide antigen of Escherichia coli. J. Clin. Microbiol. 6 (6), 548-550 (1977).
