Intravenøse injeksjoner i Neonatal Mus

Summary

Dyremodeller av pediatrisk sykdom kan oppleve tidlig debut og aggressiv sykdomsprogresjon. Klinisk relevant terapi levering til unge musemodeller kan være teknisk vanskelig. Denne protokollen beskriver en ikke-invasiv metode for intravenøs injeksjon nyfødte mus i løpet av de første to dagene etter fødselen av livet.

Abstract

Intravenøs injeksjon er en klinisk relevant måte å levere therapeutics. For voksne gnagere og større dyr, intravenøse injeksjoner er teknisk mulig og rutine. Men kan noen musemodeller har tidlig debut av sykdom med en rask progresjon som gjør administrasjon av potensielle behandlinger vanskelig. Den tidsmessige (eller ansiktsbehandling) vene er bare anterior til ørepropp i mus, og er godt synlig for de to første dagene etter fødselen på hver side av hodet ved hjelp av en dissekere mikroskop. I løpet av dette vinduet, kan den time vene injiseres med volum opp til 50 pl. Injeksjonen er trygt og godt tolerert av både valpene og dammene. En typisk injeksjonsprosedyren er fullført i løpet av 1-2 minutter, hvoretter pup føres tilbake til hjemmeburet. Ved den tredje postnatal dag venen er vanskelig å visualisere og injeksjonsprosedyren blir teknisk upålitelig. Denne teknikken har blitt anvendt for levering av adeno-assosiert virus (AAV) VectORS, som i sin tur kan gi nesten kropps-bred, stabil transgene ekspresjon for livet av dyret avhengig av det virale serotype valgt.

Introduction

Levering av legemiddel til sentralnervesystemet (CNS) i murine modeller av pediatrisk sykdom er fortsatt en utfordring. Mus som modell nyfødte sykdomstilstander er underdimensjonert og utviklingsmessig umodne, og kan derfor være vanskelig å direkte injisere i passende strukturer innenfor CNS. Intravaskulær injeksjon av terapeutiske midler er en ikke-invasiv, godt tolerert fremgangsmåte for å levere celler, medikamenter, eller virale vektorer til hele kroppen, inkludert CNS ^1-5 og retina ^3,5-9. Tidligere publikasjoner beskriver temp ansiktet vene injeksjon ved hjelp av en transilluminator ^10,11, uten en disseksjon mikroskop ^11,12, eller som krever to personer til å injisere ^10. Injeksjonsteknikken som er beskrevet i denne protokollen er en fordel fordi en enkeltperson kan injisere unger, og lyskilden å vise time vein ikke berøre valp, noe som eliminerer behovet for kirurgisk tape eller feste av en valp til en fast overflateslik som en transilluminator ^11. Levering av adeno-assosiert virusvektor serotype 9 (AAV9) i mus frembringer robuste ekspresjon i neuroner og astrocytter i hele hjernen og ryggmargen (figur 1). Intravaskulær levering av virale vektorer inn i overfladiske temp ansikts vene har vært pålitelig brukt i ulike studier i neonatal mus til å behandle den pediatriske nevromuskulær sykdom Spinal muskelatrofi (SMA) ^2,4,13,14 og til slutt økt levetiden på behandlede mus.

Intravaskulær injeksjon av neonatale mus også effektivt retter seg mot det perifere nervesystemet og perifere organer (figur 2). Etter injeksjon av AAV, har transduksjon av dorsale rotganglier, lever, hjerte, skjelettmuskel, lunge, og plexus myentericus i tarmen blitt observert ^1,3,6,7,15. Utbredt transduksjon av CNS og periferien gjør denne metoden ideell for injeksjon av sykdommer som krever ekspresjon av den globaleet transgen, slik som Gaucher sykdom ¹⁶ og andre lysosomale lagringssykdommer ^17,18, Batten sykdom og relaterte neuronal ceroid lipofuscinoses, ¹⁹ og Bardet-Biedl syndrom, en genetisk multisystem lidelse med debut av symptomer som oppstår i tidlig barndom ^20. Intravaskulær injeksjon i neonatale mus bør også betraktes som en ny metode for modellering av systemomfattende pediatriske sykdommer. Denne teknikken har blitt oversatt til større dyremodeller ^5,21 og intravaskulær injeksjon allerede eksisterer som en klinisk akseptabel metode for å levere therapeutics.

Den nåværende protokollen beskriver en enkel, effektiv metode for å levere midler til neonatale mus gjennom overfladiske temp ansiktet vene senest postnatal dag 2. Injeksjon kan gjennomføres av en enkelt, praktisert individ og er godt tolerert av både valpene og dammene. Pups opplever minimal nød og komme seg raskt. Importantly, vil vellykket injeksjon resultere i global levering av midlet administreres. Denne protokollen er hensiktsmessig for levering av virale vektorer, farmasøytiske midler eller cellene til nyfødte mus.

Protocol

Alle prosedyrer er oppført i protokollen er godkjent Institute for Animal bruk og vedlikehold komité (IACUC) av Ohio State University.

1. Utarbeidelse av Workspace

1. Samle våt is for å bedøve museunger, et tomt bur for å segregere demningen fra kullet, et disseksjonsmikroskop, en lyskilde som kan plasseres i en vinkel til injeksjon (bruk av en lyskilde i en 90 °   vinkel i forhold til injeksjonsstedet tilslører venen), en ren overflate for å plassere dyret for injeksjon, bomullspinner, 3/10 cc insulinsprøyte med 3/8 "30 G-nål (en per dyr) og 1% Evans blå fargestoff ( laget med fosfatbufret saltvann (PBS)) løsning for opplæring.
2. Fjern demningen til et eget bur mens manipulere valpene.

2. injeksjonsprosedyren

1. Plasser en enkelt valp direkte på våt is i 30-60 sekunder for å bedøve dyret. Ikke la than dyret på is for lenge på grunn av fare for hypotermi relaterte komplikasjoner inkludert ventrikkelflimmer, vev hypoksi og metabolsk acidose.
   MERK: Vår erfaring er at 30-60 sek er tilstrekkelig til å bremse valpen bevegelser for å tillate injeksjon. Dersom dypere bedøvelse er påkrevet, kan inhaleringsmidler for eksempel 1-2% isofluran være hensiktsmessig.
2. Mens dyret er på is, legger sprøyten med 30 ul Evans blått fargestoff.
3. Når dyret er fullt bedøvet, bekreftet av mangel på bevegelse på isen mens de fortsatt puster, flytte den under mikroskopet. For en høyrehendt injeksjon, møte dyrets snute til høyre. Plasser venstre pekefinger på snuten og venstre langfinger caudal til ørepropp slik at ørepropp er mellom indeksen og midtre fingrene (figur 1).
4. Undersøke bare anterior til ørepropp for en overfladisk kapillær som beveger seg når huden er manipulert. Dette kapillær er ikke målet, menidentifikasjon er viktig for temporal vein identifikasjon. Deretter finne en mørk, skygge vene dårligere til kapillær som forblir fast uavhengig av huden posisjon. Tinning vene vises skygge, kjører rygg å ventral, og trekkes inn i halsvenen (figur 1).
5. Oppgi time vene med nålen skrå opp. Dersom dette er korrekt satt inn, er det mulig å se nålen vinkel fylles med blod gjennom huden. Deretter presses stempelet langsomt og notat bleking av venen ned på siden av ansiktet.
6. La nålen å forbli innenfor venen for en ekstra 10-15 sek for å hindre tilbakestrømning av injectant.

3. Post-injeksjon

1. Etter en skikkelig injeksjon bør valpen blir blå nesten umiddelbart. Fjern nålen og bruke mild makt for å bruke en bomullspinne til injeksjonsstedet inntil blodpropp.
2. Overvåk valpen for tegn på stress. La valpen 2-3 min å komme seg og rewarm, recognize når valpen er ved bevissthet, oppreist og bevege seg, før du går tilbake til buret. Cup valpene i undersøkerens hansker for å gi passende varme til hjelp i utvinningen om nødvendig. Alternativt plassere en varmepute under hjem buret for å lette varmer den injiserte valp. Vanligvis etter en Evans blue dye injeksjon, avlive valper. Ikke ta med fargestoff ved injisering testmateriale.
3. Plasser valpen tilbake til hjemmet buret og sørge for at valpen er belagt med sengetøy og / eller nestlet å sikre reacceptance ved demningen.
4. Bruk en ny sprøyte og bomullsdott for hver valp for å opprettholde sterilitet.

Representative Results

Under en skikkelig injeksjon bør venen øyeblikk slår klart, eller Blanch. Hvis injisere fargestoff hele valpen bør bli blått i løpet av sekunder. Hvis en utilbørlig injeksjon har oppstått, er det ofte en konsentrert subkutan bolus i hodet eller nakken og injectant kan lekke ut av injeksjonsstedet. Urettmessige injeksjoner kan også resultere i utseendet blåmerker rundt halsen. Valper som mottar subkutane injeksjoner (dvs. injeksjonen ikke var fullt levert i venen) vanligvis opplever ingen syke bivirkninger og rutinemessig svare på behandling som de riktig injisert mus gjør.

Avhengig av terapi levert, kan vellykket injeksjon resultere i utstrakt levering til CNS og perifere organer. Når injisere selv gratis adenoassosiert virus serotype 9 uttrykker grønt fluoriserende protein (GFP) med en kylling β-aktin hybrid promoter (CB) (sammen referert til som "scAAV9 CB GFP"), transgenuttrykk finnes i gliacellene og nevroner tvers av flere områder av hjernen og i ryggmargen (2A-2C). Intravaskulær injeksjon av scAAV9 CB GFP resulterer også i utstrakt ekspresjon i hele omkretsen, med merkbar ekspresjon i hjerte og lever vev (Figurene 3A-3D).

Figur 1: (A) En provisorisk injeksjon plattform laget av et absorberende puten ("bleie") vikles rundt en Styrofoam stativet fra 50 ml konisk emballasje. Plattformen kan undersøkeren sin hånd å hvile på bordet ved siden av plattformen. Dette gjør at etterforsker for å utføre injeksjon med en flatere vinkel i forhold til muse valp. (B) Bildet viser pup immobilisering mellom pekefinger og langefinger. ( Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2: Sentralnervesystemet genekspresjon etter nyfødte intravenøs injeksjon av selvkomplementære AAV9 uttrykker grønt fluorescerende protein (scAAV9 CB GFP) Postnatal dag 1 (P1) museunger ble injisert intravenøst ​​med en x 10 ¹¹ vektor genomer (VG) for selv. komplementær (sc) scAAV9 CB GFP. Fire uker etter injeksjon, ble musene avlivet og dynket med 4% paraformaldehyde. Vev ble samlet inn, skiver og farget for GFP uttrykk. GFP-ekspresjon er sett i hele hjernen, inkludert striatum den fremre (A) through pons og lillehjernen (B). GFP positive celler er vanligvis nevroner og astrocytter. GFP uttrykk er også påvist i ryggmargen (C). Spinal motor nevroner og ryggmargen nevroner er effektivt transdusert hjelp nyfødte IV levering. GFP positive blodkar og astrocytter er også sett i hele rygg grå materie. Alle skala barer = 200 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3: GFP-ekspresjon i perifere organer følgende neonatal intravenøs injeksjon av selvkomplementære AAV9 GFP (scAAV9 CB GFP) GFP immunfluorescens er detekterbar i voksen mus hjerte (A) og leveren (C). (B) og leveren (D) av uinjiserte mus. Alle skala barer = 100 mikrometer.

Discussion

Intravaskulær levering av agenter til CNS eller hele kroppen er vanskelig i neonatale murine modeller av sykdom. Den beskrevne protokollen er en rask, relativt ikke-invasiv måte å intravenøst ​​administrere løsninger i neonatal mus med minimale krav til utstyr. Selv om det tidsmessige ansikts vene kan sees med det blotte øye, injeksjoner kan ha større nøyaktighet ved bruk av mikroskop og fiberoptisk lyskilde, spesielt for en unpracticed injektor. Intravaskulære injeksjoner i neonatale mus har en høy suksessrate ¹² og AAV transduksjon har blitt observert i tidlige unger, selv om en del av injectant administreres subkutant. Injeksjonen er godt tolerert av museunger, og dammer på FVB / N eller C57BL / 6 bakgrunner tolerere manipulasjon av valpene svært godt. Men i sjeldne tilfeller dammer kan ødelegge hele kull. Disse injeksjonene kan med hell utføres i mus så små som 0,8 g til 1,6 g. Alternativ injeksjonn ruter for nyfødte mus har blitt publisert av oss og andre, inkludert retro-orbital, intrajugular og intraperitoneal ^10,15,22. Vi foretrekker beskrevet her injeksjons ruten, fordi det er klinisk relevant, i stand til å bli utført av en enkelt experimenter med ingen spesielle krav til utstyr og gjør det mulig for et bredt spekter av volumer som skal administreres.

Et vanlig problem oppleves når du utfører injeksjoner er problemer med å se den time venen og derfor feilplassering av nålen. Den fiberoptiske lyskilde bør plasseres ved <90 ° og skinner nedover på hodet når det blir holdt for beste visning av venen. Injektorer bør ta deg tid til å justere lyskilden som passer deres behov. Temporal vene observasjon blir betydelig redusert hvis pups er for stor, karakterisert som eldre enn P2 eller større enn 2,0 g. Et annet problem kan avgjøre om nålen skrå har kommet inn i venen. Den tidsmessige ansikts vene er SuperFisielle, så forsiktighet må tas for å unngå å legge inn under venen. Sikre at nålen skrå går inn parallelt med venen vil hindre punktering gjennom venen. Nål plassering er best verifisert ved langsom injeksjon og påfølgende bleking av venen.

Den overfladiske temp vene er synlig på hver side av hodet. Venstrehendt individer kan oppleve at vendt dyret til etterforsker venstre kan være ergonomisk bedre og bør bestemmes for hver enkelt etterforsker. Skulle venen ikke være synlig eller er mistargeted på innledende forsøk, rettet venen på den motsatte side av hodet er hensiktsmessig. Hvis venen er punktert på begge sider av hodet, kan det oppstå en viss lekkasje gjennom det første området under injisering inn i det andre området. Avhengig av arbeidsavstanden av mikroskopet, kan det være hensiktsmessig å bygge en liten plattform for å injisere dyret; for eksempel en tom beholder Styrofoam fra 50 ml konisktube emballasje (figur 1). Dette gjør at etterforsker for å plassere dyret nær kanten av plattformen, slik at undersøkerens sprøyte hånd kan hvile direkte på bordet. Dette kan forbedre vinkelen trer inn i venen og minimere lys obstruksjon.

Det er noen begrensninger i nytten av protokollen inkludert injeksjonsvolum, alder vindu for injeksjoner og uforutsigbarheten i demningen respons. Injeksjonsvolumer for valpene er begrenset til 50 pl. Vi har tidligere dosert dyr med 100 ul, men har observert økt injeksjonsrelatert dødelighet sammenlignet med lavere volum injeksjoner, men andre rapporterer hell levere 100 ul ^10,12. Videre, har det blitt foreslått at økte injeksjonsvolumer kan skade blodhjernebarrieren ^23. Ofte er det eksperimentelle reagens blandes med PBS for å opprettholde en konstant 50 ul injeksjonsvolum. Vi er klar over studier examining effekten av injeksjonsvolum på spredt over hele den nyfødte mus, og empiriske studier bør utføres for å identifisere effekter på injeksjonsvolum for nye reagenser ved en gitt dose. En annen begrensning er at den overfladiske temp vene er lett synlig på de første og andre postnatale dager. Endringer i størrelsen dyr, hud pigmentering og tykkelse kombineres for å tilsløre venen på senere aldre selv om andre rapporterer tilgang til venen gjennom postnatal dag 6 ^10,12. Alternativt, brukte vi ultralyd guidet hjerte injeksjoner for å levere viral vektor til sirkulasjonen i P5 og P10 dyr ^4. Endelig er den aksept av muse demninger av prosedyren uforutsigbar. Vi har behandlet FVB / N, C57BL / 6 og B6SJL mus over musemodeller av nevromuskulær sykdom og autismespekterforstyrrelser. FVB / N mus er mest tolerante, mens stammer på C57BL / 6 bakgrunnen kan tidvis ødelegge enkelte unger eller hele kull, men dette er en sjelden foreteelse. Imidlertid, dennebør være en vurdering når du planlegger for tilstrekkelig n for et eksperiment. Dam aksept kan bli ytterligere påvirket av hva sykdom musestammen er modellering. For eksempel, en modell av en autisme spektrum lidelse hadde en mye høyere rate av valp avvisning enn forventet basert på bakgrunn belastning. Fremme valper kan være en betraktning hvis demningen aksept er en bekymring. Andre tilnærminger for å begrense avvisning inkluderer utfører injeksjoner i et eget rom fra demningen til å begrense tilgangen til avkommets ultralyd vokaliseringer, og å gni demningen nese og / eller unger med en klut fuktet med 70% etanol for å maskere etterforsker duft. Unger bør også bli gnidd med skittent sengetøy for å hjelpe til med aksept.

Denne protokollen har blitt brukt til å behandle en musemodell for SMA. SMA er en pediatrisk nevrodegenerativ sykdom som først og fremst påvirker lavere motoriske nerveceller i ryggmargen. Uten behandling dør denne musemodell med 15 dager etter fødselen i gjennomsnitt. After intravenøse injeksjoner av AAV genterapi i en dag-gamle mus, overlevelse ble utvidet til ett år, demonstrere sikkerhet og toleranse av den beskrevne injeksjon protokollen ^2,4,14. Lignende resultater ble også oppnådd på samme SMA-musemodellen etter IV injeksjon av antisens oligonukleotider ^8,9. Fremtidige applikasjoner inkluderer levering av andre celle og gen-terapi, så vel som etablering av neonatale modeller for sykdommer i CNS og periferien utviklings å eksogent uttrykker et cDNA eller en RNAi kassett ^24. Intravenøs injeksjon er en godkjent klinisk metode for levering; Derfor kan bruk av denne teknikken være fordelaktig i prekliniske studier for en rekke forskjellige midler.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Thinpro insulin syringe	Terumo	SS30M3009	3/10 cc, 3/8" needle, 30 G, 1 per mouse
Evans blue dye	Sigma-Aldrich	E2129	Dilute to 1% with 1x Phosphate Buffered Saline
Cotton tipped applicators	Fisher Scientific	23-400-101
Fiber optic light source	Fisher Scientific	12-562-36
Dissecting microscope