Introduction
El trasplante hepático ortotópico (OLTx) es la única opción de tratamiento para los pacientes con enfermedad hepática terminal o carcinoma hepatocelular avanzado. Durante los últimos 25 años, el número de candidatos en la lista de espera ha aumentado gradualmente y ahora supera con creces el número de injertos disponibles. En la mayoría de las regiones de trasplante, del 20 al 30% de los pacientes en lista de espera para un trasplante de hígado mueren sin recibir un trasplante de órganos o se retirado de la lista debido a la progresión de la enfermedad. Estrategias para aumentar el número de donantes y, por lo tanto, el número de injertos disponibles, se requiere desesperadamente. Criterios ampliados de asignación de órganos, de conservación prolongada del injerto, y de inducción de tolerancia inmunológica aún representan grandes desafíos clínicos 1-3. Por lo tanto, la investigación experimental OLTx es fundamental con el fin de optimizar la práctica OLTx clínica.
Porcino OLTx es un modelo experimental bien establecida que se asemeja OLTx humana en muchas maneras, incluyendo ltamaño iver, anatomía y fisiología 4-6. Así, se ha convertido en un método experimental estándar en los campos de investigación, tales como las técnicas quirúrgicas, la fisiología, la inmunología, la preservación y la lesión por isquemia-reperfusión. Numerosas técnicas de adquisición de injerto, hepatectomía receptor, y, en particular, la reconstrucción vascular, se han descrito en la literatura 5. La elección de la técnica adecuada varía de acuerdo a la preferencia del investigador y capacidad técnica.
En contraste con el escenario humano, congestión esplácnica durante la fase de anhepática representa un problema importante en porcino OLTx. Isquemia intestinal y subsiguiente daño vascular congestiva pueden causar inestabilidad hemodinámica severa, poniendo en peligro la supervivencia de cerdo y, por lo tanto, el éxito del experimento 7-9. Por lo tanto, suficiente descompresión intestinal es obligatoria, especialmente en entornos experimentales técnicamente menos refinados.
Nosotrosing un shunt porto-cava-yugular activo para la duración de la fase anhepática es una opción fiable para evitar la congestión intestinal. El sistema puede ser utilizado para los experimentos de reperfusión temprana, así como escenarios de supervivencia a largo plazo. El siguiente protocolo contiene toda la información para un modelo de trasplante hepático estable y reproducible en los cerdos, incluyendo la contratación de hígado de donante, operación destinatario incluyendo hepatectomía y técnicas de reconstrucción recipiente de extremo a extremo, y el cuidado postoperatorio.
Protocol
Todos los animales recibieron atención humanitaria en el cumplimiento de las '' Principios de Laboratorio Animal Care '' formulados por la Sociedad Nacional para la Investigación Médica y la '' Guía para el Cuidado de Animales de Laboratorio '' publicado por los Institutos Nacionales de Salud, Ontario, Canadá . El Comité de Cuidado Animal del Instituto de Investigación General de Toronto aprobó todos los estudios.
1. Recuperación de Órganos
- Cerdos Yorkshire Casa de sexo masculino entre 30 y 35 kg en el centro de investigación por 1 semana antes del trasplante para evitar una reacción física inducida por el estrés (que puede alterar el resultado de la perfusión 10,11) y para aclimatar a los animales a las condiciones de la vivienda. Fast cerdo durante un mínimo de 6 horas antes de la inducción de la anestesia.
- Anestesiar el cerdo donante de una inyección intramuscular (im) de una mezcla de ketamina (25 mg / kg), atropina (0,04 mg / kg), y midazolam (0,15 mg / kg). Antes de la intubación, asegúrese de que el cerdo respira espontáneamente 2 L de oxígeno dosificado con 5% de isoflurano. En posición supina, rocíe las cuerdas vocales con lidocaína al 2% 2 min antes de la intubación para evitar los espasmos de las cuerdas vocales. Para un 35 kg de cerdo, utilice un tubo traqueal 6,5 Fr. Bloquear el tubo traqueal con 3-5 ml de aire de la habitación.
- Después de la intubación, utilizar capnometría confirmar la intubación correcta. Monitorear la frecuencia cardiaca y saturación de oxígeno por oximetría de pulso en la cola del cerdo. Bajar el vaporizador de isoflurano al 2%.
- Ajuste la profundidad de la anestesia por valores de concentración alveolar mínima (MAC); aspirar a 2-2,5 MAC. Ajuste el ventilador para 14-16 respiraciones / min y un volumen corriente de 10 a 15 ml / kg de peso corporal.
- Publicar un G intravenosa (iv) del catéter 18 en una de las venas del oído para permitir la infusión de solución de lactato de Ringer (200 ml / h). Frote el cerdo y la cubrirá con paños estériles.
- Después de asegurar condiciones estériles, hacer una follo laparotomía mediaconducido por una extensión lateral izquierdo. Use una toalla para cubrir los intestinos grandes y pequeños antes de moverlos hacia el lado izquierdo.
- Divida el ligamento falciforme y el ligamento triangular utilizando un cauterio.
- Soltar el hígado desde el diafragma en el lado derecho mediante un electro-cauterización; utilizar tijeras para la parte superior entre el cava y el diafragma. Diseccionar el cava infrahepática a la rama de la vena adrenal en el lado derecho y la vena renal en el lado izquierdo.
- Separar el cava y la aorta distal infrahepática unos de otros; ligar ramas de la aorta a la columna vertebral; aislar y arterias renales libres del tejido adherente. Rodea cada arteria renal con un empate 2-0.
- Craneal a la vena renal izquierda, disección de la aorta y la arteria mesentérica. Rodean la arteria mesentérica con un empate 2-0.
- Después de abrir el peritoneo craneal a la arteria mesentérica, siga cuidadosamente la aorta hacia el tronco celíaco. Diseccionar el tronco celíaco caudalmente al portal veen; rodean las arterias gástricas esplénica y de izquierda, que se ramifican en sentido posterior del tronco celíaco. Diseccionar el tronco celíaco de la vena porta.
- Soltar la vena portal mediante una incisión peritoneal entre el páncreas y la vena portal. Ate las venas que drenan desde el páncreas a la vena porta.
- Separar el conducto de la bilis desde el ligamento hepatoduodenal y dividirlo distal después de la ligadura.
- Ligar los vasos linfáticos dentro del ligamento hepatoduodenal para evitar fugas linfático. Divida la arteria gastroduodenal y las arterias gástricas derecha entre los lazos. Ligar venas más pequeñas.
- Diseccionar la aorta detrás del diafragma entre el corazón y el tronco celíaco. Coloque un empate 2-0 la vuelta de la aorta craneal al tronco celíaco.
- Retire la vesícula biliar y cauterizar cualquier hemorragia del lecho de la vesícula biliar.
- Abre el diafragma. Administrar 1000 UI / kg peso del donante de heparina intracardially o iv Conjunto isoflurano al 5% (> 2,5 MAC) con el fin de lograrun nivel de anestesia más profunda. Para un donante después de la muerte modelo circulatorio (DCD), inducir un paro cardíaco por inyección intracardiaca de 40 mval KCl 3 min después de la administración de heparina. Establecer paro cardiaco como el punto de partida de la isquemia caliente.
- Ate los lazos establecidos con anterioridad en todo el renal, esplénica, mesentérica, y las arterias gástrica izquierda. Ate la aorta distal entre arterias renales e ilíacas y canular la aorta con una línea de lavado de órganos.
- Ate la vena porta tan proximal como sea posible y canular con otra línea de lavado de órganos.
- Después de cerrar la pre-set lazo alrededor de la aorta proximal, lave el hígado con 2 L de frío Universidad de Wisconsin (UW) usando dual de perfusión a través de aorta (bolsa de presión) y la vena portal (por gravedad).
- Extirpar el hígado, dejando a todos los buques restantes de largo. Deja un reborde diafragmática generoso alrededor de la cava suprahepática. Coloque el hígado en una bolsa estéril de órganos en el hielo.
- Durante back-mesa de preparación, clamplificador de la cava suprahepática mediante una abrazadera Satinsky y lave el hígado una segunda vez con aproximadamente 0,5 L de solución UW retrógradamente a través de la vena cava inferior inferior hasta que el flujo de salida de la vena porta es clara.
- Ate todas las ramas arteriales de la aorta y el tronco celíaco. Realizar una perfusión de la presión arterial de back-mesa con el restante 0,5 l de solución UW 12.
- Enjuague el conducto biliar usando solución UW.
- Recorte el parche diafragmática a un tamaño decente. Cierre todas las venas frénicos - por lo general 3, 1 cada uno a la izquierda y derecha, y 1 posterior - con ayuda de 4-0 puntos de sutura de polipropileno monofilamento.
- Cierre la bolsa de órganos y almacenar el hígado en el hielo.
2. Destinatario hepatectomía
- Anestesiar al cerdo receptor por una inyección im de una mezcla de ketamina (25 mg / kg), atropina (0,04 mg / kg), y midazolam (0,15 mg / kg).
- Coloque el cerdo en posición supina sobre una mesa quirúrgica en la parte superior de una estera de calefacción. Cubra el wi cerdoth una manta con circulación de calor.
- Antes de la intubación, asegúrese de que el cerdo respira espontáneamente 2 L de oxígeno dosificado con 5% de isoflurano. Rocíe las cuerdas vocales con lidocaína al 2% 2 min antes de la intubación para evitar los espasmos de las cuerdas vocales. Para un 35 kg de cerdo, utilice un tubo traqueal 6,5 Fr. Bloquear el tubo traqueal con 3-5 ml de aire de la habitación.
- Después de la intubación, utilizar capnometría confirmar la intubación correcta. Monitorear la frecuencia cardiaca y saturación de oxígeno por oximetría de pulso en la cola del cerdo. Colocar y fijar una sonda de temperatura en el hocico del cerdo. Baje el vaporizador isoflurano al 2% (objetivo de 2-2,5 MAC). Ajuste el ventilador para 14-16 respiraciones / min y un volumen corriente de 10 a 15 ml / kg de peso corporal.
- Use ungüento en los ojos para evitar la sequedad mientras que bajo anestesia.
- Utilice una técnica Seldinger 13 para insertar un inductor vaina (8,5 Fr) en la vena yugular externa izquierda. Utilice este catéter después de un bypass portal-cava-yugular activo.
- Utilice Seldinger technique insertar una nutrición parenteral (TPN) catéter totales (9,5 Fr) en la vena yugular externa derecha.
- En condiciones estériles, disecar la arteria carótida derecha e insertar un catéter de polipropileno (18 G) para monitorización de la presión arterial invasiva. Rodean la arteria con un empate 2-0 seda para permitir la ligadura de emergencia.
- Bajar el vaporizador de isoflurano al 1% (1,5-2 MAC) y añadir propofol (5 - 8 mg / kg / iv hr) para mantener la profundidad de la anestesia. Para la analgesia, utilizar la infusión continua iv de citrato de fentanilo (más preferido, 2 mg / kg / hr) o remifentanil (segunda elección, 15 mg / kg / hr).
- Antes de incisión en la piel, dar 1,000 mg de cefuroxima y 500 mg de metronidazol iv. Configurar una bomba de infusión utilizando lactato de Ringer con glucosa al 5% a 150 ml / h.
- Coloque la manta de circulación de calor en la zona de la cabeza y el cuello. Frote el cerdo y la cubrirá con paños estériles.
- En condiciones estériles, hacer una laparotomía media. Insertar un r abdominaletractor obtener acceso suficiente al cuadrante superior derecho.
- Divida el ligamento falciforme y el ligamento triangular usando cauterio.
- En varios pasos, dividir el ligamento hepatoduodenal cerca del hígado entre los lazos. Identificar, dividir, y marcar las ramas de la arteria y el conducto de la bilis hepática.
- Diseccionar la arteria hepática retrógrada hasta la división de la arteria gastroduodenal. Asegúrese de que una pinza bulldog ajusta alrededor de la arteria hepática común proximal a la arteria gastroduodenal para después de sujeción.
- Liberar la vena porta del tejido adherente.
- Movilizar la vena cava desde el retroperitoneo en el lado derecho mediante un electro-cauterio. Use las tijeras para la parte superior entre el cava y el diafragma. Diseccionar el cava infrahepática a la rama de la vena adrenal en el lado derecho y la vena renal en el lado izquierdo.
- Exponer el hilio del bazo. Aproximadamente a mitad de camino a lo largo de la longitud del bazo, cuidadosamente clara def la arteria esplénica y la vena de capas peritoneales adheridos. Rodean tanto arteria esplénica y la vena con 4 2-0 corbatas de seda.
- Insertar un 8,5 Fr inductor vaina con 2 agujeros adicionales en la punta del catéter en la vena esplénica, apuntando distalmente hacia la vena porta. Fijar el catéter distal para su inserción con uno de los 2-0 lazos y cerrar la vena proximal a la inserción con otro 2-0 empate. Deje las otras 2 lazos abiertos.
- Extraer sangre del catéter, lavarlo con 10 ml de solución salina, y cerrar la abrazadera del catéter.
- Rellene salina en un bypass que consiste en una cabeza de bomba centrífuga, un tubo yugular (3/16 "), y la entrada tanto de una rama portal (3/16") y una rama de la vena cava (1/4 ", conector Luer Lock en proximal apertura). Ponga una abrazadera de tubo en el extremo proximal del tubo de la vena cava.
- Conecte el portal y la apertura yugular de la derivación a ambos catéteres introductores vaina (Figura 1) y sellar la connección con un anillo abrazadera metálica. Coloque el cabezal de la bomba centrífuga a su posición de la bomba.
- Dé 1.000 mg de ácido tranexámico y 10.000 UI de heparina 3 min iv antes de pinzamiento. Reducir la tasa de infusión de propofol a 2 mg / kg / hr por el tiempo de la fase de anhepática. Ajustar la concentración de isoflurano a la presión arterial y reactividad del cerdo.
- Abra las abrazaderas de ambos catéteres introductores de vaina y la vena porta pinzamiento. Asegúrese de que la sangre se está ejecutando a través de la carretera de circunvalación de forma pasiva.
- Arranque la bomba centrífuga a cerca de 1.500 revoluciones / min. Continuar pinzamiento si a) el cerdo es cardiovascularmente estable y b) la derivación está funcionando a aproximadamente 500 ml / min. Si el cerdo no tolera el pinzamiento, volumen sustituto (cristaloides o coloides) y agentes inotrópicos (norepinefrina en pequeña boli).
- Cruz sujetar la vena cava craneal infrahepática solo a las venas renales utilizando una abrazadera De Bakey-Beck. Aplique una presión firme sobre los tiss hígadoue para exprimir una parte de la sangre remanente. Cruz-sujetar la vena cava suprahepática incluyendo un borde diafragmático mediante una abrazadera Satinsky mientras retraer el hígado caudalmente.
- Cortar la vena cava suprahepática directamente en su frontera con el tejido hepático. A continuación, cortar la vena porta, cerca del hilio hepático.
- Aproximadamente 4 cm craneal de la abrazadera infrahepática cava, cortar un agujero en la pared anterior de la vena cava. En este agujero, colocar el conector de la abertura de bypass 'cava con el bloqueo Luer hacia delante.
- Asegure el conector en la cava infrahepática con 1-0 corbatas de seda. A continuación, abra la pinza de la línea de la rama de la cava de la derivación.
- Finalmente, abrir la pinza cava infrahepática para permitir un bypass de la vena cava-yugular además de la derivación porto-yugular existente. Aumentar la velocidad de la bomba a aproximadamente 2.500 revoluciones / min de manera que el flujo de salida de derivación en el lado yugular es de entre 900 - 1100 ml / min.
- Extirpar el hígado en su c restanteone xión craneal al conector de derivación infrahepática, asegurando que los lazos que aseguran la conexión de derivación no se cortan. Coloque el tubo de derivación con cuidado para evitar torceduras. Dé 500 mg de metilprednisolona para inicializar la inmunosupresión.
Reconstrucción 3. Recipiente
- Usando 4-0 suturas de polipropileno monofilamento, cerca de todo 3 ostia vena frénica en el lado receptor en la abertura de la cava suprahepática. Cosa 4-0 suturas de monofilamento de doble brazo de polipropileno dentro-fuera en ambas esquinas de la cava suprahepática en el lado receptor.
- Retire la bolsa de órganos de donantes de la caja de hielo. Abra la bolsa de órganos, quitar el hígado del donante, y lo coloca en la cavidad abdominal.
- Para una anastomosis de extremo a extremo de la cava suprahepática, recortar el donante de la vena cava suprahepática para encajar el lado receptor. El uso de las agujas dentro de los puntos de las esquinas lado receptor, hacer un punto de esquina dentro afuera en cada uno de los lados de la suprahcava donante epatic.
- Disparo ambos extremos de la sutura derecho juntos. Aproximado tanto ostia del receptor y el donante cava, luego atar ambas terminaciones de la sutura izquierda.
- Disparo el extremo más corto y hacer un punto de afuera hacia dentro de la cava destinatario vuelta pared al lado de la eliminatoria. Corre sobre la pared del fondo, idealmente eversión las paredes cava.
- Añadir 2-3 puntos de sutura de la pared frontal con la misma sutura, una vez que se haya alcanzado el lado derecho, y luego disparó este final de sutura. Corre por la pared frontal con la sutura que queda de la esquina izquierda. Unir ambas suturas utilizadas para la espalda y las paredes frontales. Ate las otras dos finales de sutura en la esquina derecha.
- Después de recortar la vena portal de donantes a una longitud apropiada, realizar una anastomosis de vena portal de extremo a extremo de la misma manera, utilizando suturas de polipropileno monofilamento 6-0. Poco antes de terminar con la pared frontal, intubar el lumen del cava infrahepática con otra línea de lavado y enjuague la solución UW con 1 l de solución salinaa RT a través de la vena cavaportal infrahepática.
- Completar la anastomosis y atar las suturas, dejando aproximadamente 0,5 cm de factor de crecimiento. Dicho de otra De Bakey- Beck se sujeten a la cava infrahepática donante.
- Abra la abrazadera cava suprahepática y compruebe si hay sangrado. Entonces, reperfundir el hígado mediante la apertura de la abrazadera portal.
- Use suturas de polipropileno 6-0 monofilamento de puntos hemostáticos. Disminuya la velocidad de la bomba de bypass a aproximadamente 1.500 revoluciones / min y cierre la pinza del catéter introductor vaina portal.
- Reclamp el lado receptor de la vena cava infrahepática y poner una pinza de la línea por parte de la cava de la derivación. Parar la bomba centrífuga.
- Cortar los lazos del conector cava y retírela. Devuelva la sangre que queda de la derivación al cerdo a través del catéter yugular.
- Cierre la pinza del catéter yugular y desconecte el bypass. Dé 100 mg de sulfato de protamina para antagonizar la heparina. Tenga especial cuidado de la pihemodinámica del g durante estos pasos; utilizar catecolaminas para soporte de presión y bicarbonato de sodio sustituto de la acidosis metabólica.
- Realizar una anastomosis de extremo a extremo de la cava infrahepática de nuevo de la manera descrita anteriormente, utilizando 5-0 suturas de polipropileno monofilamento. Reperfundir la cava inferior infrahepática por la liberación de las dos pinzas.
- Recortar un parche aórtico alrededor del tronco celiaco del donante. Ate la arteria gastroduodenal receptor cerca de la arteria hepática común. Ponga una pinza bulldog en la arteria hepática común proximal a la unión de la arteria gastroduodenal. Recorte un parche arterial pequeña con una tijera Potts, utilizando el tejido vascular alrededor de la unión.
- Enjuague la arteria hepática donante con 10 ml de solución salina heparinizada y puso otro bulldog pinza más distal para evitar volver sangrado. Anastomosan el extremo a extremo ostia arterial en una técnica paracaídas correr, utilizando una sutura de polipropileno monofilamento 6-0. Reperfundir por primera opeción distal y luego las pinzas bulldog proximales.
- Anastomosan final a extremo del conducto biliar con 2 6-0 suturas de polipropileno monofilamento utilizando la técnica de funcionamiento descrito anteriormente. Asegúrese de que grandes porciones de tejido peribiliary se incluyen debido a que el conducto biliar porcina es muy frágil y rompe fácilmente.
- Después de la comprobación de la hemostasia, retire el catéter introductor vaina de la vena esplénica. Cierre los extremos proximales y distales con los 2 lazos restantes.
- Cierre de la pared abdominal con un tamaño 1 monofilamento sutura absorbible. Cierre la piel, ya sea con una grapadora de piel o cualquier corriendo 2-0 sutura.
Fase 4. Post-operatorio
- Utilice la almohadilla caliente y una manta de circulación de calor para mantener caliente el cerdo.
- Gases en sangre muestra por hora. Ajustar la deshidratación mediante el aumento de la velocidad de infusión.
- Destete la anestesia. Ventilar el cerdo durante otras 2 horas.
- Retire el catéter introductor vaina de la yugular izquierda ve. Presione firmemente durante unos minutos para evitar el sangrado.
- Túnel del catéter por vía subcutánea TPN a un lado del cuello del cerdo. Asegure con 2-0 suturas.
- Quite la línea arterial después de 2 horas si el cerdo es hemodinámicamente estable sin el apoyo de catecolaminas. Asegúrese de que el lado de la punción no está sangrando. De lo contrario, hacer una bolsa de tabaco puntada 6-0 alrededor del agujero arterial sin cerrar la arteria. Cierre el lugar de la incisión.
- Detener la ventilación una vez que el cerdo es capaz de respirar de forma independiente. Desconecte el tubo de ventilación del tubo traqueal. Repetidamente comprobar si el cerdo está respirando adecuadamente.
- Coloque el cerdo en una posición prona en un solo corral provisto de una lámpara de calentamiento. Extubar una vez que el cerdo es capaz de mantener su cabeza en forma independiente. No deje a un animal sin vigilancia hasta que se haya recuperado el conocimiento suficiente para mantener decúbito esternal. Casa del cerdo por separado durante todo el período post-operatorio.
- Proporcionarmedicación suficiente dolor iv post-operativamente (por ejemplo, buprenorfina 0,01-0,05 mg / kg cada 6 horas).
- Si el cerdo no bebe de forma independiente, sustituir un volumen suficiente iv
- Continuar metilprednisolona como inmunosupresión (día 250 mg postoperatorio (POD) 1 de la mañana y luego 125 mg cada mañana). Iniciar la cefalosporina 2 mg / kg dos veces al día po de POD2 en.
- Administrar 500 mg de metronidazol y 1000 mg de cefazolina dos veces al día, así como 20 mg de pantoprazol una vez al día hasta que POD3.
- Vigilar estrechamente el cerdo. No dude en sacrificarlo si muestra signos de sufrimiento (por ejemplo, letargo, refusión para beber, acidosis persistente o hipoglucemia, o signos de hemorragia o peritonitis). Para la eutanasia, Exsanguinate el cerdo bajo anestesia profunda isoflurano (5%,> 2,5 MAC) por el corte de la cava suprahepática.
Representative Results
En un primer estudio trasplante, un modelo de donante corazón latiente (HBD, n = 5) se comparó con un modelo de DCD (n = 10) expuestos a 45 min de isquemia caliente in situ. En ambos grupos, los injertos se conservaron en hielo durante 10 horas después de la contratación.
En el grupo de HBD, 100% de los cerdos receptores sobrevivió hasta el final del seguimiento de 5 días después del trasplante. En el grupo de DCD, sólo el 50% de los cerdos receptores sobrevivió durante 5 días debido a problemas de coagulación o descompensación metabólica, como resultado de la función hepática post-operatorio disminuido.
Todas las muestras de sangre fueron recolectadas desde el catéter venoso central. Después de la centrifugación, se obtuvieron muestras de suero y se analizaron para la lesión hepatocelular (aspartato aminotransferasa, AST), la función biliar (bilirrubina y fosfatasa alcalina total de), y la función hepática (INR). El curso de tiempo de cada marcador se muestra en las Figuras 2 - 5.
Figura 1. Esquema de la derivación porto-cava-yugular. El bypass es llenado con solución de Ringer lactato. A continuación, la parte de la vena cava se sujeta con una abrazadera de tubo, las partes yugular y esplénicas están conectados a los catéteres pre-establecidos, la derivación se abre, y la bomba centrífuga se inicia después del pinzamiento venosa portal. Después de la resección hepática, la parte de la cava de la derivación se inserta y se fija en el infrahepática muñón de la vena cava, craneal a las venas renales. La abrazadera de tubo se libera para permitir la descompresión de la vena cava, además de la descompresión portal.
Figura 2. aspartato aminotransferasa (AST) (HBD n = 5, DCD n = 10). AST es un marcador sensible de daño hepatocelular. La popa picoer 24 horas es menor en el HBD que en el grupo DCD, lo que sugiere la lesión por reperfusión menos hepática; la desviación estándar más pequeña muestra resultados más homogéneas en el grupo de HBD.
Figura 3. La bilirrubina total (HBD n = 5, DCD n = 10). Bilirrubina total, como un marcador de eliminación biliar y la bilis integridad de ductos, muestra una tendencia estable y homogéneo con valores por debajo de 10 mmol / L en el grupo de HBD. La curva de la bilirrubina en el grupo de DCD aumenta gradualmente con el tiempo y muestra una desviación estándar alta, lo que sugiere una lesión biliar en sólo una parte del grupo experimental.
Figura 4. La fosfatasa alcalina (HBD n = 5, n = 10 DCD). La fosfatasa alcalina is un indicador de lesión biliar. Los valores para el grupo de HBD son más bajas que la del grupo de DCD, lo que implica menos lesión biliar.
Figura 5. INR (HBD n = 5, DCD n = 10). Un valor alto indica INR función hepatocelular disminuida debido a la disminución de la liberación de factores de coagulación. En ambos grupos HBD y DCD, los valores de INR vuelvan a los valores normales de 5 días después del trasplante, lo que sugiere la recuperación de la función hepática. Los valores para el grupo de HBD aparecen inferior.
Discussion
Experimental porcino OLTx es un procedimiento difícil para un contexto de investigación sin los recursos de cuidados intensivos de un escenario clínico. Las posibles complicaciones incluyen la inestabilidad hemodinámica, hemorragia, isquemia de órganos, la hipotermia y metabólica, así como respiratoria, descompensación. Para cualquier grupo de investigación, formación suficiente procesal de la técnica quirúrgica 5, así como el 14,15 anestesia cerdo es obligatoria con el fin de lograr resultados representativos y reproducibles.
Muchas sutilezas técnicas se han descrito en la literatura, especialmente en relación con la fase de reconstrucción vascular 5. El protocolo OLTx descrito anteriormente proporciona la información necesaria para un modelo de cava-sustitución parecido OLTx humano. Los resultados proporcionados demuestran supervivencia de los animales fiable y recuperación del injerto en ambos modelos HBD y DCD. El protocolo es aplicable en situaciones de supervivencia a corto plazo utilizados en la reperfusión del injerto experimentos, por ejemplo, así como en modelos de supervivencia a largo plazo, tales como estudios de tolerancia.
Un gran obstáculo de porcino OLTx es la relativamente pobre tolerancia de cava y vena porta pinzamiento. Congestión esplácnica durante la fase anhepática causa la hipertensión venosa y daño capilar que puede conducir a mayor isquemia intestinal y la inestabilidad hemodinámica hasta el punto de un choque irreversible, incluso después de la reperfusión de órganos 7. Desde la vena cava está completamente integrado en el parénquima hepático, un procedimiento de lengüeta de la cava de preservación no es factible. La oclusión total de la vena cava durante la fase de reconstrucción cava perjudica la estabilidad hemodinámica del cerdo. Aunque algunos informes muestran que porcino OLTx puede llevarse a cabo durante cava y la vena portal oclusión total de menos de 25 min 16,17, una técnica de derivación porto-cava-yugular para el momento de la reconstrucción vascular es la opción más segura y más práctico 7- 9,18. En ªexperiencia e autores, un pasivo de derivación porto-yugular no es óptima para mantener el hemodinámicamente estable cerdo durante la fase anhepática. El modelo de derivación, incluyendo la descompresión activa de tanto cava infrahepática y la vena porta, permite una fase de reconstrucción calma de las anastomosis cava y portal suprahepáticas incluso con el tiempo de sujeción prolongada debido a complicaciones imprevistas. Contrariamente a los informes anteriores 7, una esplenectomía no es obligatoria cuando se retira el catéter de derivación portal. Tanto la arteria esplénica y la vena se cierran a medio camino a lo largo de la longitud del bazo dejando la mitad proximal suficientemente perfundido. Las complicaciones como sangrado o embolia gaseosa debido a la desconexión de derivación son evitables, asegurando que la derivación se coloca con cuidado y bien sujeto.
En supervivencia a largo plazo OLTx experimentos, la anastomosis de las vías biliares se considera un punto débil debido a su alta tasa de complicaciones 19. El tejido biliar es muy frágil y needs especial cuidado cuando se maneja. Muchas técnicas de anastomosis diferentes han sido descritos 5,19. Una anastomosis de extremo a extremo es técnicamente fácil y asociado con mínimas complicaciones 19. Una sutura continua con una aguja no cortante incluyendo grandes secciones de tejido conectivo peribiliary parece ser superior a una sutura interrumpida. El conducto biliar se coloca bajo tensión innecesaria cuando se anudan los puntos individuales de la sutura interrumpida. Esto puede resultar en lágrimas de tejido y fugas biliares consecutivos. El material de sutura - absorbible o no absorbible - no suele ser importante, dada su limitada vida útil hasta que se termina el cerdo. Para los modelos de supervivencia a largo plazo durante varios meses, las suturas absorbibles - como en OLTx humana - son preferibles.
Cuidados específicos se debe tomar con el post-operatorio de seguimiento. Nutrición suficiente y suministro de fluido, un protocolo de alivio del dolor fiable, y una inmunosupresión adecuadarégimen son obligatorios. Para los experimentos a largo plazo, la inmunosupresión parece particularmente importante. En comparación con otros mamíferos, cerdos muestran una tasa de rechazo inmunológico sorprendentemente baja después OLTx 20,21. Infiltraciones de células redondas son máximas durante la segunda semana después del trasplante y disminuyen espontáneamente, incluso sin inmunosupresión. El rechazo es raramente la causa de muerte después de porcino OLTx 22. Sin embargo, incluso con el protocolo de inmunosupresión que implica la administración iv y esteroides inhibidores de la calcineurina po mencionado aquí, rechazo de injerto se indica mediante un leve aumento de las transaminasas partir de alrededor de 4 días después de OLTx y confirmado por campo aparente portal infiltración de células redondas. Inhibidores de la calcineurina se puede dar ya sea po 23,24 o 25,26 iv; Ambos métodos tienen desventajas. Incluso con SIDA aplicación oral, la cantidad real de alcanzar el tracto gastro-intestinal sigue siendo difícil de alcanzar. Por otra parte, la infusión iv continua enla pluma de un cerdo con un animal activo es difícil. Por lo tanto, la aplicación iv debe ser realizado como un bolo, que se traduce en picos de alta concentración de fármaco junto con los efectos tóxicos potenciales. Sin embargo, ambos métodos de aplicación parecen permitir la supervivencia a largo plazo.
Similar a un entorno clínico, se recomienda la profilaxis de la úlcera de estrés post-operatorio. Hemorragia postoperatoria de las úlceras pépticas es un problema frecuente y puede estar relacionado con una función hepática 27. Después de algunos casos de sangrado gastrointestinal en ambos grupos OLTx, los autores comenzaron la profilaxis regulares con pantoprazol y no experimentaron ningún sangrado gastrointestinal desde entonces.
El mantenimiento estricto de condiciones estériles intraoperatorio, comparables a las condiciones en un quirófano clínica y profilaxis antibiótica consiguientes, disminuye el riesgo de complicaciones infecciosas.
En conclusión, este artículo provides información práctica para el establecimiento de un programa OLTx porcina en un contexto de investigación. Dedicación suficiente, la práctica y el trabajo en equipo es importante para disminuir el período de aprendizaje, para producir resultados fiables, y para reducir los costos y el número de animales de investigación.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Atropine Sulphate 15 mg/30ml | Rafter 8 Products | 238481 | |
| Buprenorphine 0.3 mg/ml | RB Pharmaceuticals LDT | N/A | |
| Cefazolin 1 g | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2237138 | |
| Cyclosporin Oral Solution 5,000 mg/50 ml | Novartis Pharmaceuticals Canada Inc. | 2150697 | |
| Fentanyl Citrate 0.25 mg/5 ml | Sandoz Canada Inc. | 2240434 | |
| Heparin 10,000 iU/10 ml | Leo Pharma A/S | 453811 | |
| Isoflurane 99.9%, 250 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2231929 | |
| Ketamine Hydrochloride 5000 mg/50 ml | Bimeda-MTC Animal Health Inc. | 612316 | |
| Lactated Ringer’s + 5% Dextrose, 0.5 L | Baxter Corporation | 61131 | |
| Lacteted Ringer’s, 1 L | Baxter Corporation | 61085 | |
| Metronidazole 500 mg/100 ml | Baxter Corporation | 870420 | |
| Midazolam 50 mg/10 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2242905 | |
| Pantoprazole 40 mg | Sandoz Canada Inc. | 2306727 | |
| Potassium Chloride 40 mEq/20 ml | Hospira Healthcare Corporation | 37869 | |
| Propofol 1,000 mg/100 ml | Pharmascience Inc. | 2244379 | |
| Protamine Sulfate 50 mg/5 ml | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | 2139537 | |
| Saline 0.9%, 1 L | Baxter Corporation | 60208 | |
| Sodium Bicarbonate 50 mEq/50 ml | Hospira Healthcare Corporation | 261998 | |
| Solu-Medrol 500 mg | Pfizer Canada Inc. | 2367963 | |
| Tranexamic Acid 1,000 mg/10 ml | Pfizer Canada Inc. | 2064413 | |
| University of Wisconsin Solution, SPS-1 | Organ Recovery Systems | SPS-1 | |
| Xylocaine Endotracheal 10 mg/50 ml | AstraZeneca | 2003767 | |
| Appose ULC 35 W skin stapler | Covidien Canada | 803712 | |
| Maxon, 1 | Covidien Canada | 606173 | |
| Sofsilk, 0 | Covidien Canada | S606 | |
| Sofsilk, 2-0 | Covidien Canada | S405 | |
| Sofsilk, 3-0 | Covidien Canada | S404 | |
| Surgipro II, 4-0 | Covidien Canada | VP581X | |
| Surgipro II, 5-0 | Covidien Canada | VP725X | |
| Surgipro II, 6-0 | Covidien Canada | VP733X | |
| Catheter i.v, 18 G | BD Canada | 381147 | |
| Cook TPN catheter, 9.5 Fr | Cook Medical Company | C-TPNS-9.5-90 | |
| PSI Kit for sheath catheter, 8.5 Fr | Arrow International | ASK-09803-UHN | |
| Infusion Pump Line | Smith Medical ASD Inc. | 21-0442-25 | |
| Liver Admin Set (flush line) | CardioMed Supplies Inc | 17175 | |
| Mallinckrodt, Tracheal Tube, 6.5 mm | Covidien Canada | 86449 | |
| Med-Rx Suction Connecting Tube | Benlan Inc. | 70-8120 | |
| Organ Bag | CardioMed Supplies Inc | 2990 | |
| Suction Tip | Tyco Healthcare Group LP | 8888501023 | |
| Valleylab, Cautery Pencil | Covidien Canada | E2515H | |
| Valleylab, Patient Return Electrode | Covidien Canada | E7507 | |
| Bypass Connector 3/8” x 1/4“ | Raumedic AG | 955083-001 | |
| Bypass Connector 3/8” x 3/8” Luer Lock | Raumedic AG | 955163-001 | |
| Bypass Connector Y 3/8” x 3/8” x 1/4” | Raumedic AG | 961360-002 | |
| Bypass Tubing 1/4” x 1/16” | Raumedic AG | 039505-010 | |
| Bypass Tubing 3/8” x 3/32” | Raumedic AG | 039535-005 | |
| Rotaflow Centrifugal Pump | Maquet-Dynamed | HC 2821 | |
| Stainless Steel Hose Clamp Ring, 5mm | Oetiker | 16700007 | |
| Abdominal Retractor | Medite GmbH | N/A | |
| De Bakey – Beck, Infrahepatic Cava Clamp | Aesculap Inc. | FB519R | |
| Deithrich, Atraumatic Clamp (Portal Vein) | Aesculap Inc. | FB525R | |
| Gregory Bulldog Clamp, curved | Aesculap Inc. | FB382R | |
| Gregory Bulldog Clamp, straight | Aesculap Inc. | FB381R | |
| Potts – De Martel, Scissors | Aesculap Inc. | BC648R | |
| Satinsky, Suprahepatic Cava Clamp | Aesculap Inc. | FB605R | |
| Symetrical Tubing Clamp | Codman Instruments | 198010 | |
| Anesthesia Machine, Optimax | Moduflex Anesthesia Equipment | SN5180 | |
| Bypass Flow meter, HT 110 | Transonic Systems Inc. | HT110B11106 | |
| Flow meter probe, H6XL | Transonic Systems Inc. | H6Xl689 | |
| Heat Therapy Pump, T/Pump | Gaymar Industries Inc | TP500-G89D19 | |
| Infusion Pump 3,000 | SIMS Graseby LTD. | SN300050447 | |
| Isoflurane Vapor 19.1 | Draeger Medical Canada Inc. | N/A | |
| Monitor, Datex AS 3 | Instrumentarium Corp./ Hitachi | D-VHC14-23-02 | |
| Rotaflow Centrifugal Drive Unit | Maquet-Dynamed | 952301 | |
| Rotaflow Console | Maquet-Dynamed | 706035 | |
| Temperature Therapy Pad | Gaymar Industries Inc | TP26E | |
| Valleylab Force Tx | Valleylab Inc. | 216151480 | |
| Ventilator, AV 800 | DRE Medical Equipment | 40800AVV | |
| Warm Touch, Patient Warming System | Nellcor/ Covidien Canada | 5015300A |
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