Introduction
斑马鱼（ 斑马鱼 ）胚胎已被广泛用作模型为研究肾发展和多囊肾病。有许多优势，使用斑马鱼作为动物模型：研究遗传相互作用的可行性，使用反义吗啉（MO），用于蛋白质敲低的能力，有机会迅速测定大量的胚胎，并且容易观察器官的表型活幼虫1。该前肾是第一个肾在脊椎动物发展和功能是在幼虫斑马鱼2。斑马鱼前肾的结构相对简单相比哺乳动物后肾，第三和最后肾发展的哺乳动物。肾单位是肾脏的工作单元，其中每个人肾脏500,000-1,000,000肾3,4和具有约13000肾5各小鼠肾脏之间含有，因此很难观察单肾结构我ñ人或小鼠肾脏。斑马鱼只有两个肾单位，每个斑马鱼肾包含所有在肾小球和小鼠和人类6和类似专门肾细胞类型的小管中发现的主要组件。相比其他脊椎动物模型如爪蟾 ，斑马鱼肾更接近于哺乳动物肾，因为它有一个封闭的系统7。
在最近几年中，斑马鱼的基因组已经被测序，允许广泛介绍的遗传工具，广泛突变体资源，并在斑马鱼的模型转基因报告线路集合。 12-72小时受精后（HPF）之间的斑马鱼前肾表格可在透明的胚胎很容易被可视化。在肾母细胞瘤蛋白WT1是肾脏发育的一个重要因素。所述wt1b启动子的Tg的控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）转基因斑马鱼线（wt1b：GFP）显示GFP expre裂变专门设在pronephric地区的斑马鱼胚胎，从17 HPF 8起。 Nephronophthisis（NPHP），一种常染色体隐性囊性肾脏疾病，是由NPHP基因9的突变引起。 NPHP4被击倒吗啉导致囊肿形成的的Tg（wt1b：GFP）鱼10因此，这种转基因鱼是一个合适的模型，观察肾脏结构和囊肿形成肾脏发育过程中。重要的是，肾脏发育的调节剂的影响，可以利用该菌株中一个时间和劳动高效方式进行研究。
我们的论文描述了使用的Tg（wt1b：GFP）鱼作为模式基因调制后显现肾囊肿形成。我们使用的开始和剪切位点反义的MO打掉了Wnt5a基因斑马鱼。而Wnt5a是Wnt信号家族的非规范的分泌糖蛋白，发挥各器官和细胞产后的发展具有重要作用功能11。 Wnt5a的工作原理是通过非经典Wnt途径，包括平面细胞极性（PCP）途径，已经发现肾小管伸长时发挥导向细胞分裂的作用。 Wnt5a的通过形成与受体样酪氨酸激酶（RYK），其中，还转导Wnt5a的信令通过形成与VANGL平面细胞极性蛋白2（Vangl2）的复合物，从而促进Vangl2稳定性12复杂调节的Wnt / PCP通路。在PCP途径缺陷可能导致随机的细胞分裂，并导致肾囊肿形成。我们使用的Tg（wt1b：GFP）斑马鱼线以下的Wnt5a敲除，观察肾囊肿形成。 的Tg（wt1b：GFP）斑马鱼模型允许实时成像，及时观察肾脏结构。 Wnt5a的击倒后，肾囊肿形成被发现开始，在24 HPF;在72 HPF，囊肿可能在肾小球和近端小管中找到。这种方法也可用于为screen其他基因可能导致肾囊肿形成。
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Protocol
注：伦理学声明：所有斑马鱼实验批准的机构动物护理和使用委员会在东弗吉尼亚医学院。
1.准备吗啉
- 设计和合成的翻译阻滞（AUG-）和剪接抑制（剪接）反义吗啉代（MO）的寡核苷酸用于感兴趣按照制造商的说明（ 图1A）的基因。请参阅生产商的表1中的信息。
注：材料订单出货冻干股玻璃瓶。 - 添加高档无菌水至玻璃瓶重新暂停的MO至25微克/微升的最终浓度。确保该寡核苷酸被完全溶解。如果一些固体遗骸，加热包含在65℃的股票的寡核苷酸溶液中5至10分钟，涡旋简要小瓶。
- 存储在MO原液在RT。不要将它们存储在4℃或-20℃; C，因为较低的温度可能导致在MO寡核苷酸结合到容器壁。测量使用分光光度计原液的浓度（请参阅表1）一个新的MO原液制成各一次。
- 通过稀释原液用高档无菌水至所需的剂量准备注射的当天将MO工作溶液。加0.5％酚红达到0.05％的浓度。例如，以与15毫微克/ nL的浓度5μl的工作溶液中，加入3微升的MO原液和0.5微升0.5％酚红至1.5微升水。
注：有了这个工作浓度，注射每一滴（500 PL）包含MO的7.5纳克和两滴含有15纳克MO的。
2.准备的注射装置的
- 购买玻璃预拉针（请见表1详细信息）。另外，拉玻璃注射针无线TH针拉马。
- 将空气压缩机和调整压力设置为50磅。打开解剖显微镜光源和微微微量注射泵和调整设置如下：保持压力20磅，喷射压力10磅，2.5和100微秒范围选通的周期值。
- 加载玻璃预拉针以5微升注射溶液和放置针在与尖端朝下的垂直位置。等待，直到所有的溶液到达针尖没有可见气泡。将针保持器在旁边的显微镜适当的位置，并插入玻璃针插入支架。调整喷射角为45度。
- 把针尖进入视野，在显微镜下，高走下舞台，并专注于尖端最薄的区域。断针尖与细点镊子。
- 将尺子和毛细管具有0.15mm的一侧通过显微镜下侧内径;该溶液注入到毛细管的一端，以使一个液柱。调整排出时间来达到每17滴每1mm长度的液柱，然后每滴的体积为1 NL（墨滴体积液柱=πX半径2×长度（）滴/计数（）。
注：将一滴用直径为0.1毫米给出约500复一个注射量（墨滴体积= 4/3 XπX半径3）。
3.准备施肥斑马鱼胚胎和注射用吗啉代
- 根据标准斑马鱼的饲养和维护协议公布转基因斑马鱼繁殖对：设置的Tg（GFP wt1b）。收集自然产卵后的胚胎，并将其保存在一个10cm培养皿充满E3水（5毫米氯化钠，氯化钾0.17毫米，0.33毫米氯化钙2，0.33毫米硫酸镁4）。启动MO注射马上13。监测胚胎形态，在显微镜下，并确保MO注射是在单细胞阶段，或不迟于四细胞阶段。
- 胚胎转移到10cm的培养皿中以楔形琼脂槽。吸出多余的水E3并轻轻按压胚胎进入低谷。
- 操纵与微量的胚胎以可视化的解剖显微镜下1-细胞期的胚胎。穿透绒毛膜，然后将蛋黄到一个或两滴MO的注入蛋黄（1滴= 500 PL）。转移注射的胚胎至10cm的培养皿与E3的水和孵化在28.5℃。
- 在注射后，取出死胚，并记录注射的胚胎的数量。取代E3水在盘每24至48小时。
4.表型救援实验
- 选择来自另一个物种具有不同的主碱基对结构（通常为3-7个碱基对的错配），并且，因此，耐对MO的直向同源物，救援。例如，在这个实验中，我们选择了鼠标因为鼠标Wnt5a的 mRNA序列是来自斑马鱼的序列不同。
- 设计的引物组与正向引物起始于平移位点和反向引物在接近所述mRNA编码区的末端。添加T7启动子序列的正向引物序列的5'端。在这个实验中，我们使用了以下的引物序列;前锋：5'-TAA TAC GAC TCA CTA标签GGA CTA TGA TGC TGC TGA AGC TGA A- 3'和反向：5'-TCA CTT GCA GAC GTA CTG gtc- 3“。
- 执行一个50μl的聚合酶链反应（PCR）用引物组（0.5μM，每种引物）上述设计和0.1微克含有小鼠Wnt5a的 cDNA序列与下列PCR程序模板DNA：1个循环的95℃5分钟; 35个循环的95℃（30秒），58.5℃（30秒），72℃（1分钟）;和最后延伸步骤在72℃进行7分钟。
- 完成后，吨他的周期，运行2微升的PCR产物的1％琼脂糖凝胶，以确保乐队是正确的大小。纯化的PCR产物与根据制造商的说明一PCR纯化试剂盒。检查DNA浓度用分光光度计。存储所述纯化的PCR产物，在-20℃或在加帽的RNA转录在下一步直接使用。
- 合成体外根据制造商的说明书加帽的mRNA用加帽的RNA合成试剂盒。稀释的mRNA在20μl无RNA酶的水，并确定该浓度。分装的RNA，并储存于-80℃。
- 对注射的当天，制备mRNA的核糖核酸酶与游离的无菌水的工作溶液。需要注意的是40皮克通常是在该RNA的非特异性或毒性作用不发生的最高的RNA剂量。置于冰上的工作方案。注入胚胎与MO，然后抢救的mRNA，或二者共同注入在一起。例如，如果与mRNA prepar的浓度每次注射的ED在步骤4.5为0.6微克/微升，添加0.67微升的mRNA（0.4微克）与4.33微升无RNA酶的水，使0.08微克/微升的最终浓度，然后一滴（500 PL）中含有40皮克mRNA的。准备MO如步骤3中所述。
5.准备注射胚胎的荧光成像
- 孵育28.5°CO后/ N，增加0.003％N-苯基硫氧嘧啶（PTU）的E3水，以防止黑化，从而影响观察用荧光显微镜前肾结构。然而，原肠胚形成之前不要添加PTU，因为它会影响早期胚胎发育。
- 在48 HPF，手动dechorionate用细镊子胚胎。采取48和72 HPF胚胎图像光解剖显微镜下。
注意：这些图片可以采取无需麻醉。 - 约10分钟前在荧光显微镜下成像，将它们放置在麻醉胚胎10cm的培养皿含有160微克/毫升缓冲三卡因。等待5-10分钟，然后轻轻地接触斑马鱼，以确认它们不移动，因此，麻醉正在工作。
- 之后将胚麻醉，将它们安装在3％的甲基纤维素和定向它们在解剖显微镜下俯卧位置（请参阅表1）。
- 观察在荧光显微镜下的前肾结构（请参阅表1），并拍摄照片，在不同的放大倍数（10X和20X）。
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Representative Results
Wnt5a的击倒被引进翻译阻挡MO实现（AUG-MO）或外显子/内含子的剪接边界MO（拼接-MO），以斑马鱼胚胎的一个细胞阶段。所述AUG-MO靶向起始密码子，因此，抑制了母亲和合子Wnt5a的消息。拼接-MO靶向第三剪接供体位点和抑制Wnt5a的（ 图1A）仅合子转录。所述AUG-和剪接morphants phenocopied彼此具有多个缺陷，包括卷曲的尾巴向下体轴和心包水肿（ 图1B）。鼠标Wnt5a的mRNA的部分抢救morphant表型（ 图4B），这表明表型不是由于脱靶效应。 的Tg（wt1b：GFP）的转基因斑马鱼，其表达的GFP由wt1b启动子驱动，以便将GFP概括wt1b的内源表达，被用来勾勒pronephric结构。 的Tg（WT1B：GFP）的鱼显示Wnt5a的击倒后肾小球囊肿形成在48 HPF，而对照胚胎注射酚红单独显示正常pronephric发展，形成一个“U”形的稠肾小球与肾小管该横向延伸（ 图2）。在72 HPF，肾小球结构进一步发展，容易观察血管回路，既AUG-和剪接-MOS开发的肾小球和近端小管（ 图3）囊肿。 72 HPF morphant胚胎的横向组织切片的H＆E染色显示囊肿的形成，扰乱了肾小球结构和扩张型肾小管（ 图4A）。
图1：吗啉设计和斑马鱼胚胎在72小时受精后（HPF）注射后光镜的外观用苯酚 - 红控制，AUG-MO，或剪接-MO。 （A）的图表表示的斑马鱼Wnt5a的基因，编码区，和由AUG-和剪接MO靶向的区域。所述Wnt5a的AUG-MO被设计为靶向的ATG起始密码子到方框蛋白质翻译;拼接-MO被设计为靶向的外显子3和4接续-MO寡针对任何剪接点预计将产生或者是完全或部分的单一外显子缺失或一个完整的或部分的单一内含子插入的边界。我们选择击倒Wnt5a的，既是AUG-MO，这会影响孕产妇和合子消息，以及一个拼接- MO，这仅影响合子转录，以增强特异性。（B）的注射用苯酚-红的胚胎（喷射控制）显示正常机身弧度，长度和心包。注射了AUG-MO胚胎呈下降卷曲的尾巴结构和心包水肿，胚胎注射了拼接-MO phenocopied的外观的胚胎注射AUG-MO。巴=2毫米。
图2： 的Tg（wt1b：GFP）的荧光显微镜的外观。斑马鱼胚胎在48 HPF注射酚红控制，Wnt5a的 AUG-MO或Wnt5a的接头-MO后，在酚红喷射控制，前肾发育完成48高倍视野。两个稠合肾小球和近端小管中可以看出。囊肿形成可以在肾小球观察中都AUG-和剪接-MO的胚胎在48通过斑马鱼前肾发展（巴= 100微米）的端部HPF。
图3： 的Tg（wt1b：GFP）的荧光显微镜外观斑马鱼胚胎在72 HPF注射后酚红控制了Wnt5a AUG-MO或Wnt5a的拼接-MO，在72 HPF，肾小球结构可以清楚地显现。在酚红喷射控制，两个稠合的肾小球和血管循环可以被观察到。Wnt5a的击倒导致囊肿形成在所有的肾单位的结构，可以被可视化，包括肾小球和肾小管区域（条= 100微米）。
图4：72 HPF morphant胚胎的横向组织切片的（A）H＆E染色显示囊肿的形成，扰乱了肾小球结构和扩张的肾小管。阿罗：pronephric肾小球;箭头：扩张肾小管。棒=20μm左右。（B）中的AUG-MO的表型可以被部分地救出与小鼠的Wnt5a，耐莫由于在初级碱基对结构的差，从而表明表型不是由于脱靶效应。所不同的是在P <0.05统计学显著（* P <0.05与酚红组;＃P <0.05，与AUG-MO 15纳克组）。
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Discussion
多囊肾（PKD）是终末期肾脏疾病的主要原因在人类中之一，其特征在于进行性囊肿形成，肾肿大，与异常小管发育14。常染色体显性多囊肾（ADPKD）是一种遗传性疾病，其中突变要么PKD1的，编码多囊蛋白1（PC1），或PKD2，多囊编码-2（PC2），导致多囊性肾脏。许多其它基因，特别是那些编码在初级纤毛中发现的蛋白质，被认为是参与肾囊肿的发展，至今尚无理想的工具来筛选这些基因。我们描述了一个快速简便的方法在斑马鱼基因敲除后，观察肾囊肿形成。这种方法可以容易地用于筛选其他候选PKD基因。
一个这种技术的优势是它的简单。在的Tg（wt1b：GFP）斑马鱼，GFP的表达是肾小球，肾小管和管道，这使得它一个特定的LY合适的模型来研究整个pronephric肾的结构。 的Tg（wt1b：GFP）斑马鱼允许pronephric结构和肾囊肿形成的基因后，直接可视化打掉。有人怀疑它的Wnt5a敲除可能导致PCP通路缺陷，肾囊肿形成的小鼠。然而，Wnt5a的全球敲除是产后致死小鼠和不能用于出生后观察肾囊肿形成。通过使用这里描述的，在很短的时间周期的方法，它被确定Wnt5a的拦截在斑马鱼导致肾囊肿形成。这个结果，下一个步骤将是产生肾脏特定Wnt5a的基因敲除小鼠。
这种技术也有一些限制。它是难以估计的MO的功效没有良好的抗体，并排除在MO可能抑制无关的基因的功能，以使表型的可能性。广泛的控制experimeNTS必须克服这些问题。两个不同的MO，所述AUG-MO和剪接MO被用来评估Wnt5a的击倒。既morphants phenocopied对方，并注入鼠的Wnt5a表达，耐由于在初级碱基对结构的差 的MO，获救的异常表型，这表明表型不是由于MO的“脱靶”效应。
我们的模型表明，Wnt5a的敲除导致肾囊肿形成的斑马鱼胚胎。这种方法可用于测试被怀疑引起肾囊肿形成许多其它基因，因为它是简单的和耗时更少。一旦被证实，该基因突变导致肾囊肿形成在斑马鱼，进一步的实验，可以进行调查的肾囊肿形成的详细机制。在该实验中，由于Wnt5a的全球敲除小鼠是产后致死的，不能被用来OB服务生后肾囊肿形成，下一步将是利用产生的酶Cre-lox系统的肾脏专用的Wnt5a基因敲除小鼠。
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Acknowledgments
这项工作是支持由美国国立卫生研究院（DK093625到LH和DK069909和DK047757至JHL）和VA（优异奖I01BX000820到JHL）。我们要感谢博士迈克尔·包和何洁博士在宾夕法尼亚斑马鱼核心的大学提供必要的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.5% Phenol-Red | Sigma | P0290 | Color indicator for injection |
| Morpholino | Genn Tools, LLC | (customized) | Customized designed to the gene of interest |
| Pre-pulled needle | Tritech Research | MINJ-PP | If large amount of needle is required, you can also purchase a needle puller and prepare the needle in the lab |
| T7 mMessage Kit | Ambion | 1344 | For in vitro transcription to make capped mRNA for rescue experiment |
| N-Phenylthiourea | Sigma | P7629 | For prevention of melanization |
| Tricaine | Sigma | A5040 | Also called ethyl 3-aminobenzoate, for zebrafish anesthesia |
| Methyl Cellulose | Sigma | M-0387 | For position of zebrafish |
| QIAquick PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | For purification of PCR product for cap RNA synthesis. |
| dNTP mix | Promega | U1511 | For PCR |
| Tag DNA Polymerase | Invitrogen | 10342-053 | For PCR |
| NanoDrop spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-1000 | For measure morpholino and RNA concentration |
| Air Compressor | Werther International, Inc. | Panther Compact 106 | Air source for injection |
| Pico micro-injection pump | World Precision Instruments Inc | PV830 Pnematic PicoPump | Other types of microinjection system can be used. |
| Micro-manuplator | World Precision Instruments Inc | MMJR | Right-handed (MMJL for left handed) |
| Needle holder | World Precision Instruments Inc | 5430-ALL | To hold needle for micromanipulation |
| Dumont Tweezers | Fine Surgical Tools | 11253-20 | For breaking off the needle tip |
| Dissecting microscope | Leica M205C | For observing and imaging zebrafish embryos | |
| Fluorscence microscope | Zeiss Axio Obserer D1m | For imaging zebrafish pronephros | |
| Capillary tube (I.D. 0.15 mm) | VitroCom | CV1525Q-100 | For measure the volume of each injected drop |
References
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