一种可能的多囊肾病斑马鱼模型：敲低wnt5a可导致斑马鱼肾脏出现囊肿

摘要

我们描述了一种建立多囊肾病斑马鱼模型的方法。我们使用Tg(wt1b:GFP)转基因鱼来观察肾脏结构。通过显微注射吗啉代寡核苷酸实现wnt5a基因的表达敲低。在该GFP转基因斑马鱼中，观察到wnt5a基因敲低后出现前肾囊肿的形成。

摘要

多囊肾病（PKD）是终末期肾病最常见的病因之一，是一种目前尚无治愈手段的严重疾病。导致PKD囊肿形成的分子机制仍不十分明确，但认为涉及多个基因。Wnt5a是一种非经典糖蛋白，可调控多种发育过程。Wnt5a通过平面细胞极性（PCP）通路发挥作用，该通路在肾小管上皮细胞伸长过程中调控细胞的定向分裂。PCP通路的缺陷已被发现可导致肾囊肿的形成。本文介绍了一种通过使用针对wnt5a基因的反义吗啉代寡核苷酸（MO）敲低wnt5a基因，建立斑马鱼多囊肾病模型的方法。Tg(wt1b:GFP)转基因斑马鱼用于在wnt5a基因敲低后可视化观察肾脏结构及肾囊肿。使用了两种不同的反义MO（AUG起始位点和剪接位点），两者均在wnt5a敲低后导致尾部向下卷曲的表型及囊肿形成。注射对MO具有抗性的小鼠Wnt5a mRNA（因其一级碱基配对结构不同）可挽救异常表型，证明该表型并非由吗啉代寡核苷酸的“脱靶”效应引起。本研究结果支持利用斑马鱼模型研究wnt5a基因在肾脏中功能的有效性。

引言

斑马鱼（Danio rerio）胚胎被广泛用作研究肾脏发育和多囊肾病的模型。使用斑马鱼作为动物模型具有诸多优势：可研究基因间的相互作用，可利用反义吗啉代寡核苷酸（MO）实现蛋白敲低，能够快速检测大量胚胎，并且易于在活体幼鱼中观察器官表型¹。前肾是脊椎动物中最早发育的肾脏，在斑马鱼幼体中具有功能²。与哺乳动物最终发育形成的后肾（第三也是最后一个肾脏）相比，斑马鱼前肾的结构相对简单。肾单位是肾脏的功能单位，每个人类肾脏含有50万至100万个肾单位^3,4，每只小鼠肾脏约有1.3万个肾单位⁵，这使得在人类或小鼠肾脏中观察单个肾单位结构变得困难。斑马鱼仅有两个肾单位，而每个斑马鱼肾单位均包含小鼠和人类肾小球及肾小管中存在的所有主要结构成分⁶，并具有类似的特化肾细胞类型。与其他脊椎动物模型（如Xenopus）相比，斑马鱼肾单位更接近哺乳动物肾单位，因其具有封闭的系统⁷。

近年来，斑马鱼基因组已被测序，使得遗传工具、大量突变体资源以及转基因报告基因品系在斑马鱼模型中得到广泛应用。斑马鱼的前肾在受精后12至72小时（hpf）期间形成，可在透明胚胎中轻松观察。Wilms肿瘤蛋白WT1是肾脏发育的关键因子。在wt1b启动子控制下表达绿色荧光蛋白（GFP）的转基因斑马鱼品系Tg(wt1b:GFP)....

方案

注：伦理声明：所有斑马鱼实验均已获得东弗吉尼亚医学院机构动物护理和使用委员会的批准。

1. Morpholino 准备

1. 根据制造商说明，为感兴趣基因设计并合成翻译阻断型（AUG-）和剪接抑制型（Splice-）反义吗啉环寡核苷酸（MO）（图 1A）。请参见表1中的制造商信息。
   注意：MO以冻干粉形式装于玻璃瓶中运输。
2. 向玻璃瓶中加入高质量无菌水，将MO重悬至终浓度为25 μg/μl。确保寡核苷酸完全溶解。若仍有固体残留，将含有储备液的管子在65 °C加热5至10分钟，并短暂涡旋。
3. 将MO储备液在室温下保存。不要在4 °C或-20 °C保存，因为较低温度可能导致MO寡核苷酸结合到容器壁上。每次制备新的MO储备液时，使用分光光度计测量其浓度（请参见表1）。
4. 在注射当天，用高质量无菌水将储备液稀释至所需剂量，制备MO工作液。加入0.5%酚红，使其终浓度达到0.05%。例如，为配制浓度为15 ng/nL的5 μl工作液，需加入3 μl MO储备液、0.5 μl 0.5%酚红和1.5 μl水。
   注意：在此工作浓度下，每次注射一滴（500 pl）含有7.5 ng MO，两滴共含15 ng MO。

2. 注射装置的准备

结果

Wnt5a 通过在单细胞期向斑马鱼胚胎中注射翻译阻断型吗啉代寡核苷酸（AUG-MO）或外显子/内含子边界剪接型吗啉代寡核苷酸（splice-MO），实现基因敲低。AUG-MO 靶向起始密码子，因此可抑制母源性和合子型转录本的翻译 wnt5a 信息。该剪接MO靶向wnt5a的第三个剪接供体位点，仅抑制其合子转录本（图 1A）。AUG 和剪接突变体彼此表型模拟，均表现出多种缺陷，包括尾部向下卷曲及心包水肿（图 1B）。小鼠 Wnt5a mRNA 能部分挽救形态发生素表型（图 4B），表明该表型并非由脱靶效应所致。 Tg(wt1b:GFP) 表达由 wt1b 启动子驱动的 GFP 的转基因斑马鱼，使 GFP 的表达模式重现内源性 wt1b 的表达 wt1b用于描绘前肾结构。 Tg(wt1b:GFP) 在48 hpf时，wnt5a基因敲降后斑马鱼出现肾小球囊肿形成，而仅注射酚红的对照组胚胎则表现出正常的前肾发育，形成“U”形融合的肾小球，并具有向外侧延伸的.......

讨论

多囊肾病（PKD）是人类终末期肾病的主要病因之一，其特征是进行性囊肿形成、肾脏增大以及肾小管发育异常¹⁴。常染色体显性多囊肾病（ADPKD）是一种遗传性疾病，由编码多囊蛋白-1（PC1）的PKD1基因或编码多囊蛋白-2（PC2）的PKD2基因发生突变所致，导致多囊肾的形成。许多其他基因，尤其是编码初级纤毛中蛋白质的基因，也被认为参与了肾囊肿的发生。然而迄今为止，尚无理想的工具用于筛选这些基因。本文描述了一种在斑马鱼中通过基因敲降后快速、简便地观察肾脏囊肿形成的方法。该方法有望用于筛选其他候选的多囊肾病相关基因。

该技术的优点之一在于其简便性。Tg(wt1b:GFP) 斑马鱼中，GFP 在肾小球、肾小管和导管中表达，使其成为研究整个前肾肾脏结构的特别合适的模型。Tg(wt1b:GFP) 斑马鱼可在基因敲低后直接观察前肾结构及肾脏囊肿的形成。此前怀疑Wnt5a敲低可能导致小鼠出现平面细胞极性（PCP）通路缺陷和肾脏囊肿形成。然而，Wnt5a 全身性敲除小鼠在出生后致死，无法用于观察出生后的肾脏.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
0.5% 酚红	Sigma	P0290	注射用显色指示剂
吗啉代寡核苷酸（Morpholino）	Genn Tools, LLC	(customized)	针对目标基因定制设计
预拉制注射针	Tritech Research	MINJ-PP	若需大量注射针，也可购买拉针仪并在实验室自行制备
T7 mMessage 试剂盒	Ambion	1344	用于体外转录合成带帽mRNA，以进行挽救实验
N-苯硫脲	Sigma	P7629	用于防止黑色素形成
三卡因（Tricaine）	Sigma	A5040	又称乙基-3-氨基苯甲酸酯，用于斑马鱼麻醉
甲基纤维素	Sigma	M-0387	用于固定斑马鱼
QIAquick PCR 纯化试剂盒	Qiagen	28104	用于纯化PCR产物以合成带帽RNA
dNTP 混合液	Promega	U1511	用于PCR
Tag DNA 聚合酶	Invitrogen	10342-053	用于PCR
NanoDrop 分光光度计	Thermo Scientific	ND-1000	用于测定吗啉代寡核苷酸和RNA浓度
空气压缩机	Werther International, Inc.	Panther Compact 106	提供注射用气源
Pico 微量注射泵	World Precision Instruments Inc	PV830 Pneumatic PicoPump	也可使用其他类型的显微注射系统
显微操作器	World Precision Instruments Inc	MMJR	右手型（左撇子使用MMJL）
持针器	World Precision Instruments Inc	5430-ALL	用于在显微操作中夹持注射针
杜蒙特镊子（Dumont Tweezers）	Fine Surgical Tools	11253-20	用于折断针尖
体视显微镜	Leica M205C		用于观察和成像斑马鱼胚胎
荧光显微镜	Zeiss Axio Observer D1m		用于成像斑马鱼前肾
毛细管（内径 0.15 mm）	VitroCom	CV1525Q-100	用于测量每次注射液滴的体积