Abstract
基因疗法，用于实现由感觉神经性耳聋功能恢复，承诺给予更深入的了解，有助于听力损失潜在的分子和遗传机制。导入载体的进入内耳必须以一种方式在整个耳蜗损伤，同时最大限度地降低到现有结构即广泛分布的试剂来完成。这个手稿描述耳后的手术的方法，可以使用分子，药物，和病毒递送至小鼠10日龄和老年人通过圆窗膜（RWM）用于小鼠耳蜗疗法。这种手术方式，可以快速地直接供货到鼓阶，同时尽量减少失血，避免动物的死亡率。此技术涉及到内和中耳的基本的结构以及颈部肌肉，同时完全保留听力忽略的或没有损害。为了证明这一点的手术技术，囊泡glutam的功效吃转运3敲除（VGLUT3 KO）小鼠将被用作先天性耳聋，它回收输送VGLUT3到内耳后使用腺相关病毒（AAV-1）听力小鼠模型的一个例子。
Introduction
基因治疗一直被建议作为对遗传性听力损失的潜在的治疗，但在这方面的成功一直难以实现1。迄今为止，病毒介导的方法学都占优势由于相对难以接近耳蜗内靶向特定细胞类型的理论能力。两个腺病毒（AV）和腺相关病毒（AAV）也已用于耳蜗基因递送。自动增值服务是在耳蜗为若干原因是有利的。它们是复制缺陷型病毒，并且可以有效的转基因的分子转移到不同类型的细胞，包括神经元，为一些听力损失的原因的一个重要目标。 AAV进入细胞是通过特异性受体介导2;因此，特定的血清型的选择必须是兼容的细胞类型，以被转导。自动增值服务可以有效地转染毛细胞3和掺入到宿主基因组中，导致稳定的，长期的TRA的表达nsgenic蛋白和该单元4的表型变化。而对于短期应用，例如毛细胞再生未必是有利的，长期表达是遗传缺陷稳定救援非常重要的。因为自动增值服务不与任何人疾病或感染相关的，并证明无耳毒性5,6,7，它们是在基因治疗中的用途为听力损失8的遗传形式的理想候选。
转移外源遗传物质导入用病毒载体的哺乳动物内耳已经研究在过去十年中，并成为一个有前途的技术，用于治疗遗传和获得性形式的听力损失9。耳蜗是潜在的基因治疗有几个原因的理想目标：1）它的体积小，就必须在有限的所需要的病毒量; 2）从它的其他器官系统的限制副作用相对隔离;及3）其流体填充腔促进病毒交付整个迷宫10，11,12,13,14，15。
先天性耳聋的小鼠模型允许使用的研究方法很多监测系统的，可复制的方式内耳的发展。虽然鼠标耳蜗的小尺寸确实存在一些手术难度，鼠标作为遗传性听力损失的研究具有极其重要的模式，有几个实验优于其他品种16。小鼠模型允许范围内通过遗传连锁分析，收集了详细的形态学观察，并模拟情景致病特点的评估;正因为如此，它们是很好的候选病毒介导的基因治疗。在小鼠中结合的技术进步的广泛的遗传研究已经使得有可能产生转基因小鼠在整个实验室17,18，19，20,21的可重现方式。 FurthermorE，有两个获得性和遗传听力损失表型小鼠，使严格的测试，在这个动物模型22，23,24存在众多的车型。因此，校正听力使用病毒介导的基因治疗在小鼠模型是在寻求一种治疗人类疾病的适当的第一步骤。
之前我们已经表明，缺乏的水泡谷氨酸转运体3（VGLUT3）转基因小鼠天生聋哑，由于缺乏谷氨酸释放的IHC带状突触25。由于此突变不导致感觉毛细胞的初级变性，这些突变小鼠有潜在其中测试耳蜗基因治疗先天性听力损失的优良模型。
迄今为止，一些病毒递送技术耳蜗基因治疗已被描述，包括圆窗膜扩散，圆窗膜注射，并且经由内耳开窗递送。有强大的IAL优点和每种方法9的缺点。
这里，我们报告为通过圆窗膜（RWM）病毒介导的基因递送到VGLUT3 KO小鼠内耳的外科方法。在耳后RWM注射方法是微创具有优良的听证会保留，并且是比较快的。如我们先前发表的，在为了恢复听力在该小鼠模型中，源自于AAV2载体携带VGLUT3基因（AAV1-VGLUT3）引入这些耳聋小鼠的耳蜗在出生后第12天（P！@），导致听26的恢复。听力在VGLUT3 KO小鼠经听性脑干反应（ABR）验证，而转基因蛋白的表达用免疫荧光（IF）的验证。这种方法因而表明病毒介导的基因疗法可以纠正一个遗传缺陷否则将导致耳聋。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
注：所有的程序和动物处理符合NIH道德准则和加州大学的机构动物护理和使用委员会，旧金山批准的协议要求。
1.准备动物外科手术
- 开展外科手术在干净的专用空间。高压灭菌所有的手术器械，消毒与手术前玻璃珠灭菌。
注：在这个协议中，使用日龄10-12（P10-12）FVB小鼠。不同年龄和小鼠的菌株可用于满足特定项目的需要。年纪比P40小鼠是具有挑战性的，因为泡骨头变得更难。 - 麻醉小鼠腹膜内注射盐酸氯胺酮（100毫克/千克），盐酸赛拉嗪（10毫克/千克），以及乙酰丙嗪（2mg / kg的）的混合物。开始外科准备后，才动物不再响应疼痛刺激，如脚趾捏。如果necessarY，施用麻醉剂鸡尾酒的加强剂量（五分之一原剂量），以恢复原来的麻醉平面。
注：请注意在这一步，因为大多数在这个年龄观察到的死亡率是由麻醉剂过量。 - 涵盖了动物的眼睛有保护眼药膏在麻醉过程中，保持眼睛湿润，抑制动物的眨眼反射。
- 将鼠标与颈部伸展在整个手术过程中的加热垫，直到鼠标完全清醒，防止麻醉后体温过低。
- 剃左侧耳后区域与推剪和消毒用70％乙醇和碘伏手术操作之前。
2.手术过程和载体注射
- 使用耳后的办法，以暴露鼓泡。切开小剪刀皮下组织以露出耳后肌肉。缩回后脂肪组织为th切口电子后侧，分离的肌肉向右侧和左侧垂直于切口以暴露颞骨。确保此切口足够长以提供足够的可视舒适地工作。
- 穿孔鼓室泡与地下25针和通过剥离骨背面以允许接近耳蜗的底转扩大孔根据需要用钳子，然后扩大到足以显现镫骨动脉和圆窗膜（RWM） 。
- 轻轻刺破RWM在中心用硼硅毛细吸管。观察通过RWM在这一点上的流体流出;这是正常的。等到流出稳定（从耳蜗effluxed流体用无菌滤纸干燥）。
注：小心保持和推进玻璃针，使得RWM穿孔是尽可能小时。根据所使用的显微镜，持有使用显微操作或手工移液器用吸管持有人。 - 准备使用移液管拉拔器相同的方式膜片钳移液器制备的移液器用于注射。确保该顶端直径较大（大约15微米直径），以便吸取病毒和缩小是很容易做到。
- 制定1〜2微升AAV1-VGLUT3，AAV1-GFP或AAV2-GFP的到注射吸管。后的流出被稳定（5至10分钟），microinject这个固定体积入鼓阶通过同一孔先前在RWM制成。
- 拉出吸管与一个小插件肌肉后迅速密封该RW利基并与一小滴组织粘合剂放置在肌肉，以避免从圆窗泄漏固定。
注意：密封该孔很好针后都与一个小插件肌肉的删除，以防止从耳蜗-此步骤的任何外淋巴泄漏是非常关键的保护听力。未能完全密封的RWM会导致听力下降一段时间。 - 注射后，覆盖孔在听泡与脂肪组织，返回耳后的肌肉和脂肪组织到它们的正常位置，并缝合在层中的卷绕有6-0或更小的可吸收铬酸缝合。
- 消毒用碘伏伤口。
3.术后护理
- 小鼠放置在一个温暖的笼子里，不随意放置，直到他们完全康复然后再回到与母亲。建议把幼崽回来的母亲之前，请从笼子里的男性。
- 施用皮下卡洛芬（2毫克/千克）对镇痛术后且每隔24小时后3天，以管理炎症和疼痛。每天监测动物遇险，异常消瘦，疼痛，或感染的迹象。通常由手术所有小鼠通常应作用后的第3天。如果遇险或疾病的任何迹象的第3天之后，出现在一个鼠标，考虑安乐死吨他鼠标按机构的指导方针。
耳蜗功能4.评估继病毒输送用听性脑干反应（ABR）录音
注：听性脑干反应（ABR）是一个听觉诱发电位经由头皮下放置电极从大脑中的正在进行的电活动中提取和记录。将动物刺激的声音。将所得记录包括五个波反映在听觉通道的连续点中的第一个10毫秒的电活动开始的听觉刺激后。
- 如在该协议的第1.2节中所述，除了没有乙酰丙嗪麻醉小鼠腹腔注射盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪的混合物。
- 把鼠标放在整个听力测试一个加热垫，直到鼠标完全清醒，防止麻醉后体温过低。
注：使用下面的声音刺激在这个实验中：点击（5毫秒的持续时间; 31赫兹展示率）。 - 放置皮下针状电极在顶点，左耳（参考）的耳廓的下方，下方的对侧耳朵（地）和如先前在一个隔音室27,28描述开始记录的ABR。记录ABR波形，以5 dB声压级间隔时间从最大幅度下降。
- 确定ABR阈病毒分娩后术后早在4天
注：阈值被定义为最低的刺激水平，在该响应的波峰值的I-V显然并目测反复出现。 - 测量波我来分析活动从耳蜗神经。能产生可检测的ABR波形的最低的刺激电平被定义为阈值。
5.转基因耳蜗蛋白表达使用免疫
- 通过intrap的过量麻醉小鼠eritoneal注射盐酸氯胺酮和盐酸赛拉嗪的混合物在本协议第1.2描述，除了没有乙酰丙嗪。
- 斩首后只动物不再响应疼痛刺激，如脚趾捏的头部。
- 解剖耳蜗出来，过程整个安装免疫所描述的26。耳蜗全挂载免疫荧光使用抗VGLUT3和抗肌球蛋白抗体7A的详细协议阿基洛夫等人 ，到2013年29说明。
- 的GFP标记，过夜孵育耳蜗全坐骑在4℃下用兔抗GFP抗体以1：250的稀释。
- 冲洗耳蜗两次，每次10分钟，用PBS再孵育2小时在山羊抗兔IgG缀合的Cy2稀释1：4000于PBS中。
- 冲洗用PBS耳蜗两次，每次10分钟，并孵育它们用DAPI 15分钟。
- 安装在载玻片上的耳蜗，观察UND呃用免疫荧光共焦显微镜。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
为了验证该技术的特点和对耳蜗分子治疗耳后的方法实用，AAV1-VGLUT3，AAV1-GFP和AAV2-GFP分别通过RWM送入P10-12小鼠内耳。该方法证明了内毛细胞内成功的转基因表达（IHC）（VGLUT3 图1和GFP 图2和GFP 图3A），外毛细胞（OHC）（GFP 图2）和支持细胞（GFP 图2和图3A）26没有尔蒂伤害显著的器官。表达GFP不同细胞类型的观察看到在耳蜗整个安装免疫荧光图像（ 图2和图3A）表明，AAV血清型的选择，必须与被转导的细胞类型相兼容。 图1，图2和图3A中 26表现出很好的TRansfection两个IHCS和外毛细胞，以及整个AAV1或AAV2-GFP或AAV1-VGLUT3染后耳蜗分布的转基因蛋白（GFP / VGLUT3）的。 IHCS的AAV1-VGLUT3转染（ 图3B）后表达VGLUT3分布26表明，通过RWM转染是通过整个耳蜗比已经报告更高的转染率接近于病毒递送的位点的其它方法更有效和更均匀的。我们已发现，转染率可通过增大注入内耳病毒的体积（ 图1）26更高效。
我们观察到成功的VGLUT3表达的VGLUT3 KO鼠标IHCS没有耳蜗损害导致我们测试听力通过测量小留学生中救出KO小鼠。 图4A和图4B 26号文件耳后RWM交付AAV1-VGLUT3进入的能力内ê在VGLUT3 KO小鼠AR产生听觉救援先天性听力损失这种小鼠模型。听性脑干反应（ABR）痕迹恢复了获救KO（ 图4A）的VGLUT3和ABR阈值是衡量和媲美看到野生型小鼠（ 图4B）。
图1：后RWM病毒递送至P10-P12 KO 小鼠VGLUT3 IHC染经转染的蜗使用抗MYO7A抗体，毛细胞标记，并针对VGLUT3的抗体进行了检查，在P30通过免疫荧光。 MYO7A和VGLUT3表达只有在WT所有IHCS，而IHCS从基因敲除小鼠只表示MYO7A。获救的鼠标耳蜗表现出一定的IHCS表达VGLUT3，所有IHCS表示MYO7A（行3） 免疫组化 ：内毛细胞。转载与许可26。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2：小鼠耳蜗整个安装免疫后RWM AAV2-GFP递送到野生型P10-P12小鼠 AAV2-GFP被用于使用耳后的方法来鼠标耳蜗评估病毒递送。 AAV2-GFP的递送完成在P10-12和使用抗GFP抗体的转基因GFP表达进行了检查，在耳蜗在P21。 GFP表达（绿色）的野生型小鼠耳蜗全挂载显示外毛细胞（OHC），比内毛细胞（IHC）强GFP表达。
图3：鼠标COC hlear整个安装免疫后RWM AAV1-GFP递送到野生型P10-P12小鼠后AAV1-GFP递送GFP蛋白的耳蜗表达见于内毛细胞（IHC）和支持细胞（A）中 ，但不是外毛细胞，而AAV1-VGLUT3递送到VGLUT3 KO小鼠（B）的耳蜗导致VGLUT3表达仅在IHCS。 IHCS在后AAV1-VGLUT3递送VGLUT3 KO小鼠耳蜗表达VGLUT3数量取决于病毒递送至内耳的量;例如，IHCS的40％表示VGLUT3时0.6微升的病毒注射，而IHCS 100％表示VGLUT3 1微升的病毒被交付之后。有没有在顶点，中圈，或者底座之间VGLUT3表达无差异，当0.6微升病毒注射。重印26的许可。
G“/>
图4：听性脑干反应（ABR）评估后AAV1-VGLUT3交付代表ABR波形获救，野生型小鼠相似;与此相反，没有ABR波形被认为在KO小鼠（A）中 。救出KO小鼠也表现出可测量的ABR阈值。这些ABR阈值分别为媲美的测量所有频率（B）出现在野生型小鼠。 I：ABR波I.重印从26许可请点击此处查看该图的放大版本。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在这项工作中，我们详细地描述了可用于耳蜗基因疗法，以恢复或抢救是受遗传缺陷损害正常听觉功能的目标的技术。因为它通常是无创伤，这种方法是安全的耳蜗的基因转移或其他潜在的分子疗法30。其他的方法对于耳蜗疗法已被描述，其中包括一个腹侧方法24，在小鼠和豚鼠内耳开窗31,32和内淋巴囊递送33。在我们的经验中，耳后的方法是更快，更简单，并具有降低的损伤和动物死亡率。此外，耳后的方法提供了RWM改进可视化创伤的机会较少和听力34,35,36的相关损失。本报告通过论证交付AAV1-VGLUT3进入次记录了技术方面的耳蜗分子治疗耳后的方法和工具经由RWMê内耳，造成两者VGLUT3和GFP（ 图1和图2和图3A）的转基因表达和听力救援先天性听力损失该小鼠模型。此前的研究描述的基因传递方式显示在尔蒂12,37,38,39,40,41器官的关键领域只有有限的转基因表达。这些差异可能是由于病毒制剂的质量，所述病毒载体的效价，用血清型，或病毒递送根本不足以到耳蜗。与此相反，使用这种耳后的方法，我们能够获得非常好的转染率内和外毛细胞和报道基因（GFP）的分布AAV2-GFP的转染（ 图2和图3A）在整个耳蜗后。基于IHCS染AAV1-VGLUT3（ 图3B）的百分比，我们建议经由RWM染更EFF通过整个耳蜗比其他方法，其中包括，在豚鼠，其中报告更高的转染率的底转，靠近病毒应用42的站点中描述ective和均匀的。耳蜗内的GFP / VGLUT3的长期表达，至少在一年半的时间，是从其他动物模型和不同的器官系统38,43得到的数据是一致的。
另外，被转染的耳蜗的组织学分析表明没有证据表明炎症应答，具有优异的保存Corti器的细胞结构，包括血管纹和螺旋神经节神经元26。此外，在对比的是采用的内耳开窗的方法，在本研究中使用的转染RWM没有造成耳蜗损伤，和更高的产量可以被注入31,32。使用这种技术缺乏的创伤被展示等效ABR thresho验证操作和控制的耳朵之间LDS，一发现类似于由夏看到等人 4最后，通过RWM AAV-VGLUT3递送导致的ABR阈值媲美见于WT小鼠（ 图4A和图4B）26。我们已经用这种方法在所有年龄段的小鼠，但它在小鼠比P40技术上具有挑战性，因为老的泡骨头变得更难穿孔和骨折的肺大泡是更加清晰的年纪比年轻小鼠。在老年阶段，如果不采取谨慎出血可如果一块泡骨割裂颈部组织发生。
总之，本报告记录成功的基因转移到多种类型的使用基于AAV的载体耳蜗细胞在小鼠如先前所示。基因递送的这种技术减少了创伤，不会导致听力损失，并可能导致的各种细胞类型的耳蜗，INC内广泛染泸定毛细胞和螺旋神经节神经元。它具有很大的潜在应用的其它类型的听力损失的先天和后天的形式，并且也可应用到各种听力丧失的小鼠模型分子疗法。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ketamine | Butler Schein | ||
| Xylazine | AnaSed | ||
| Acepromazine | Provided by UCSF LARC | ||
| Carprofen analgesia | Provided by UCSF LARC | ||
| Betadine | Betadine Puredue Pharma | ||
| dexamethasone ophthalmic ointment (TobraDex) | Alcon | ||
| Heating pad | Braintree scientific, inc. | ||
| 25G needle | BD | 305127 | |
| Borosilicate capillary pipette | World precision instruments, inc. | 1B100F-4 | |
| Suture PDS*plus Antibacterial | Ethicon | PDP149 | |
| Tissue glue (Vetcode) | Butler Schein | 31477 | |
| Rabbit Anti-GFP antibody | Invitrogen | A11122 | |
| Dissecting microscope | Leica | MZ95 | |
| Flaming/ Brown Micropipette | Sutter Instrument Co | ||
| Puller Model P-97 | |||
| TDT BioSig III System | Tucker-Davis Technologies |
References
- Jero, J., et al. Cochlear gene delivery through an intact round window membrane in mouse. Hum. Gene Ther. 12 (5), 539-548 (2001).
- Nam, H. J., et al. Structure of adeno-associated virus serotype 8, a gene therapy vector. J. Virol. 81 (22), 12260-12271 (2007).
- Ryan, A. F., Mullen, L. M., Doherty, J. K. Cellular targeting for cochlear gene therapy. Adv Otorhinolaryngol. 66, 99-115 (2009).
- Xia, L., Yin, S., Wang, J. Inner ear gene trasfection in neonatal mice using adeno-associate viral vwctor: a comparison of two approaches. PLoS One. 7 (8), e43218 (2012).
- Husseman, J., Raphael, Y. Gene therapy in the inner ear using adenovirus vectors. AdvOtorhinolaryngol. 66, 37-51 (2009).
- Ballana, E., et al. Efficient and specific transduction of cochlear supporting cells by adeno-associated virus serotype 5. Neurosci. Lett. 442 (2), 134-139 (2008).
- Praetorius, M., et al. Adenoviral vectors for improved gene delivery to the inner ear. Hear. Re. 248 (1-2), 31-38 (2009).
- Kay, M. A., Glorioso, C. G., Naldini, L. Viral vectors for gene therapy: the art of turning infectious agents into vehicles of therapeutics. Nature Medicine. 7 (1), 33-40 (2001).
- Ryan, A. F. Gene Therapy and Stem Cell Transplantation: Strategies for Hearing Restoration. Adv Otorhinolaryngol. 66, Karger. Basel. 64-86 (2009).
- Cooper, L. B., et al. AAV-mediated delivery of the caspase inhibitor XIAP protects against cisplatin ototoxicity. Otol. Neurotol. 27 (4), 484-490 (2006).
- Gratton, M. A., Salvi, R. J., Kamen, B. A., Saunders, S. S. Interaction of cisplatin and noise on the peripheral auditory system. Hear. Res. 50 (1-2), 211-223 (1990).
- Lalwani, A. K., Walsh, B. J., Reilly, P. G., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Development of in vivo gene therapy for hearing disorders: introduction of adeno-associated virus into the cochlea of the guinea pig. Gene Ther. 3 (7), 588-592 (1996).
- Kesser, B. W., Hashisaki, G. T., Holt, J. R. Gene Transfer in Human Vestibular Epithelia and the Prospects for Inner Ear Gene Therapy. Laryngoscope. 118 (5), 821-831 (2008).
- Izumikawa, M., et al. Auditory hair cell replacement and hearing improvement by Atoh1 gene therapy in deaf mammals. Nat. Med. 11 (3), 271-276 (2005).
- Praetorius, M., et al. Adenovector-mediated hair cell regeneration is affected. Acta Otolaryngol. 130 (2), 215-222 (2009).
- Friedman, L. M., Dror, A. A., Avraham, K. B. Mouse models to study inner ear development and hereditary hearing loss. Int. J. Dev. Biol. 51 (6-7), 609-631 (2007).
- Chang, E. H., Van Camp, G., Smith, R. J. The role of connexins in human disease. Ear Hear. 24 (4), 314-323 (2003).
- Cohen-Salmon, M., et al. Targeted ablation of connexin26 in the inner ear epithelial gap junction network causes hearing impairment and cell death. Curr. Biol. 12 (13), 1106-1111 (2002).
- Nickel, R., Forge, A. Gap junctions and connexins in the inner ear: their roles in homeostasis and deafness. Curr. Opin. Otolaryngol. Head Neck Surg. 16 (5), 452-457 (2008).
- Lv, P., Wei, D., Yamoah, E. N. Kv7-type channel currents in spiral ganglion neurons: involvement in sensorineural hearing loss. J. Biol. Chem. 285 (45), 34699-34707 (2010).
- Leibovici, M., Safieddine, S., Petit, C. Mouse models for human hereditary deafness. Curr. Top. Dev. Biol. 84, 385-429 (2008).
- Dror, A. A., Avraham, K. B. Hearing loss: mechanisms revealed by genetics and cell biology. Annu. Rev. Genet. 43, 411-437 (2009).
- Richardson, G. P., de Monvel, J. B., Petit, C. How the genetics of deafness illuminates auditory physiology. Annu. Rev. Physiol. 73, 311-334 (2011).
- Jero, J., Tseng, C. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. A surgical approach appropriate for targeted cochlear gene therapy in the mouse. Hearing Research. 151 (1-2), 106-114 (2001).
- Seal, R. P., et al. Sensorineural deafness and seizures in mice lacking vesicular glutamate transporter 3. Neuron. 57 (2), 263-275 (2008).
- Akil, O., et al. Restoration of hearing in the VGLUT3 knockout mouse using virally mediated gene therapy. Neuron. 75 (2), 283-293 (2012).
- Akil, O., et al. Progressive deafness and altered cochlear innervation in knock-out mice lacking prosaposin. J. Neurosci. 26 (5), 13076-13088 (2006).
- Fremeau, R. T., et al. Vesicular glutamate transporters 1 and 2 target to functionally distinct synaptic release sites. Science. 304 (5678), 1815-1819 (2004).
- Akil, O., Lustig, L. R. Mouse Cochlear Whole Mount Immunofluorescence. Bio-protocol. , Available from: http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=332 (2013).
- Kho, S. T., Pettis, R. M., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Cochlea microinjection and its effects upon auditory function in guinea pig. Eur Arch Otorhinolaryngol. 257 (9), 469-472 (2000).
- Iizuka, T., et al. Noninvasive in vivo delivery of transgene via adeno-associated virus into supporting cells of the neonatal mouse cochlea. Hum. Gene Ther. 19 (4), 384-390 (2008).
- Kilpatrick, L. A., et al. Adeno-associated virus-mediated gene delivery into the scala media of the normal and deafened adult mouse ear. Gene Ther. 18 (6), 569-578 (2011).
- Yamasoba, T., Yagi, M., Roessler, B. J., Miller, J. M., Raphael, Y. Inner Ear Transgene Expressionafter Adenoviral Vector Inoculation in the Endolymphatic Sac Hum. Gene Ther. 10 (5), 769-774 (1999).
- Praetorius, M., Baker, K., Weich, C. M., Plinkert, P. K., Staecker, H. Hearing preservation after inner ear gene therapy: the effect of vector and surgical approach. ORL J. Otorhinolaryngol. Relat. Spec. 65 (4), 211-214 (2003).
- Carvalho, G. J., Lalwani, A. K. The effect of cochleaostomy and intracochlear infusion on auditory brain stem response threshold in the guinea pig. Am. J. Otol. 20 (1), 87-90 (1999).
- Kawamoto, K., Oh, S. H., Kanzaki, S., Brown, N., Raphael, Y. The Functional and Structural Outcome of Inner Ear Gene Transfer via the Vestibular and Cochlear Fluids in Mice. Mol. Ther. 4 (6), 575-585 (2001).
- Lalwani, A. K., Han, J. J., Walsh, B. J., Zolotukhin, S., Muzyczka, N., Mhatre, A. N. Green fluorescent protein as a reporter for gene transfer studies in the cochlea. Hear Res. 114 (1-2), 139-147 (1997).
- Lalwani, A. K., et al. Long-term in vivo cochlear transgene expression mediated by recombinant adeno-associated virus. Gene Ther. 5 (2), 277-281 (1998).
- Raphael, Y., Frisancho, J. C., Roessler, B. J. Adenoviral-mediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo. Neurosci. Lett. 207 (2), 137-141 (1996).
- Weiss, M. A., Frisancho, J. C., Roessler, B. J., Raphael, Y. Viral mediated gene transfer in the cochlea. Int. J. Dev. Neurosci. 15 (4=5), 577-583 (1997).
- Pettis, R. M., Han, J. J., Mhatre, A. N., Lalwani, A. K. Intracochlear infusion of recombinant adeno associated virus: Analysis of its dissemination to near and distant tissues. Assoc. Res. Otolaryngol. Abstr. 21, 673 (1998).
- Konish, iM., Kawamoto, K., Izumikawa, M., Kuriyama, H., Yamashita, T. Gene transfer into guinea pig cochlea using adeno-associated virus vectors. J. Gene Med. 10 (6), 610-618 (2008).
- Kaplitt, M. G., et al. Long-term gene expression and phenotypic correction using adeno-associated virus vectors in the mammalian brain. Nature Genetics. 8 (2), 148-154 (1994).
