Introduction
समय-समय पर एसिड शिफ़ (पीए) धुंधला व्यापक रूप से पेशी अनुसंधान और निदान में प्रयोग किया जाता है कि एक immunohistochemical तकनीक है। यह भी रक्त के नमूनों पर एक नैदानिक उपकरण के रूप में उपयोग किया जाता है। तकनीक बेरंग शिफ़ के अभिकर्मक जिससे एक गहरी मैजंटा उत्पाद के उत्पादन के साथ प्रतिक्रिया है कि पोलीसेकेराइड बनाने एल्डिहाइड समूहों के भीतर इकाइयों ऑक्सीकरण नमूना है, जो करने के लिए समय-समय पर एसिड समाधान को लागू करने से काम करता है। इस प्रक्रिया के चरणों का चित्र 1 में दिखाया जाता है। दाग ग्लाइकोजन, ग्लाइकोप्रोटीन, glycolipids, mucins, या पोलीसेकेराइड moieties के साथ अन्य अणुओं सहित polysaccharides Magenta, के साथ कुछ भी बदल जाता है।
पीए धुंधला अक्सर मांसपेशी फाइबर में ग्लाइकोजन के स्तर को मापने के लिए प्रयोग किया जाता है। स्नायु ऊतक वर्गों वे मजबूती से स्लाइड के लिए देते हैं और कई धोने और धुंधला चरणों झेलने के रूप में तकनीक के लिए आदर्श होते हैं। ग्लाइकोजन एक उच्च मांग है जो प्रकार द्वितीय मांसपेशी फाइबर, तेजी से चिकोटी में सबसे मौजूद हैअधिकतम प्रदर्शन 1,2 के लिए ग्लाइकोजन की आवश्यकता तेजी से एटीपी उत्पादन के लिए। ग्लाइकोजन ग्लाइकोजन phosphorylase एन्जाइम की क्रिया के माध्यम से नि: शुल्क ग्लूकोज में तोड़ा जा सकता है कि ग्लूकोज की एक branched बहुलक है। बाकी और पोषक तत्वों की प्रचुरता के समय में, ग्लाइकोजन, glycogenesis की प्रक्रिया के माध्यम से मंगाया जाता है, जबकि पोषण की कमी या उच्च ऊर्जा की मांग के समय में; ग्लाइकोजन glycogenolysis द्वारा ग्लूकोज में टूट गया है। रक्त के नमूनों पर के रूप में जल्दी 1950 के चिकित्सक वैज्ञानिकों का पता लगाया है के रूप में पीए धुंधला से विभिन्न रोगों 3-7 में ग्लाइकोजन सामग्री का विश्लेषण करने के लिए। उदाहरण के लिए, Pompe रोग-एक वास्तविक ग्लाइकोजन भंडारण में रोग सफेद रक्त कोशिकाओं को स्वस्थ नियंत्रण 8 से काफी अलग है कि ग्लाइकोजन की बड़ी मात्रा में जमा है।
इस वीडियो लेख परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMC) स्वस्थ मानव विषयों की शिरापरक रक्त से नमूने पर इस्तेमाल के लिए पीए धुंधला के एक अनुकूलित संस्करण को दर्शाता है। पीबीएमसीएस ऐसे प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं और monocytes के रूप में टी लिम्फोसाइट और बी लिम्फोसाइट परिवारों, साथ ही अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं के ज्यादातर लिम्फोसाइटों होते हैं। पहले शुद्धि कदम एरिथ्रोसाइट्स, न्यूट्रोफिल, और अन्य granulocytes हटा। इस तकनीक को पूरे रक्त स्मीयरों का उपयोग कर की तुलना में पीए पॉजिटिव कोशिकाओं के और अधिक मजबूत गणन के लिए अनुमति लिम्फोसाइटों का एक केंद्रित अनुपात पर डेटा प्रदान करता है।
चित्रा 1:। PBMC पर पीए धुंधला के कदम कार्यप्रणाली से कदम (ए) पहले, PBMC के अलगाव Ficoll ढाल के माध्यम से हासिल की है, बाएं पैनल centrifugation के पहले तैयारी से पता चलता है, सही पैनल centrifugation के बाद यह पता चलता है जहां PBMC युक्त buffy कोट ट्यूब के केंद्र में मनाया जाता है। (बी) पृथक PBMCs formalin इथेनॉल लगानेवाला समाधान का उपयोग कर स्लाइड पर तय कर रहे हैंtion। स्लाइड धीरे एक प्लास्टिक धोने की बोतल से आसुत जल के साथ rinsed है। (सी) स्लाइड तो ग्लाइकोजन भंग होगा जो एमिलेज समाधान के साथ भरा एक 100 मिलीलीटर बीकर आधे रास्ते में रखा गया है। स्लाइड धीरे rinsed है। (डी) स्लाइड saccharides के ऑक्सीकरण जगह लेता है, जहां समय-समय पर एसिड समाधान, साथ व्यवहार किया जाता है। स्लाइड्स धीरे rinsed कर रहे हैं; इस अतिरिक्त समय-समय पर एसिड को हटाने और ऑक्सीकरण कदम बंद हो जाएगा। (ई) शिफ़ अभिकर्मक स्लाइड करने के लिए कहा जाता है, यह ऑक्सीकरण चरण के दौरान बनाई गई एल्डीहाइड साथ प्रतिक्रिया होगी। इस बेरंग अभिकर्मक तो एक गहरे लाल मैजंटा उत्पाद में परिणाम होगा। स्लाइड्स धीरे अतिरिक्त शिफ़ अभिकर्मक दूर करने के लिए rinsed हैं।
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Protocol
मानव रक्त के नमूनों के साथ रिसर्च Concordia विश्वविद्यालय आचार समीक्षा बोर्ड, प्रमाण पत्र संख्या 10000618. द्वारा Concordia विश्वविद्यालय आचार समीक्षा बोर्ड, प्रमाण पत्र संख्या 2010BERG द्वारा अनुमोदित किया गया था माउस पेशी पर काम अनुमोदित किया गया था।
पूरे रक्त से 1. PBMC अलगाव
नोट: बाँझ तकनीक और निर्माता-निष्फल उपकरण का उपयोग कर एक जैव सुरक्षा कैबिनेट में इस प्रक्रिया से बाहर ले।
- ध्यान से एक 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में heparinized (विरोधी कौयगुलांट) रक्त संग्रह ट्यूब से पूरे रक्त का 10-15 मिलीलीटर डालना। नाबालिग खून फैल लिए, सफाई ऊतक का उपयोग DDH 2 हे और 70% EtOH के साथ पोंछे।
- फॉस्फेट बफर खारा (पीबीएस 1x) 7.4 पीएच के साथ: 1 के अनुपात में एक एक को शंक्वाकार ट्यूब में रक्त पतला। अधिकतम कुल मात्रा 30 मिलीग्राम से अधिक नहीं है कि सुनिश्चित करें।
- धीरे बुलबुले से बचने के लिए एक सीरम वैज्ञानिक पिपेट बंदूक का इस्तेमाल मिलाएं।
नोट: रक्त एक से बचने के लिए ट्यूब inverting से मिश्रण नहीं हैcentrifugation के दौरान टोपी और बाद में टपका में ccumulation। - एक नया 50 मिलीलीटर क्षमता शंक्वाकार ट्यूब, Ficoll-Paque के 13 मिलीलीटर (सामग्री और उपकरण तालिका देखें) जोड़ें। रैक में ट्यूब सीधा रखें।
- एक हस्तांतरण पिपेट का प्रयोग, पतला रक्त लेने के शीर्ष के निकट ट्यूब के अंदर की दीवार को हस्तांतरण विंदुक टिप को छूने। धीमी गति से और लगातार दबाव के साथ, सूक्रोज परत के शीर्ष पर एक रक्त परत बनाने ट्यूब के अंदर दीवार के साथ खून हस्तांतरण। सभी रक्त का तबादला कर दिया गया है जब तक इस चरण में कई बार करते हैं।
- कसकर ट्यूब टोपी और 5 के लिए मध्यम त्वरण सेट के साथ एक स्विंग रोटर में 700 XG पर 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर ट्यूब अपकेंद्रित्र, और मंदी शून्य पर सेट।
- धीरे-ट्यूब बाहर ले और परतों को परेशान करने के बिना, जैव सुरक्षा कैबिनेट करने के लिए इसे वापस ले लो।
- ध्यान से पीबीएस / प्लाज्मा एक के बीच रखा PBMCs स्थित हैं जहां buffy कोट (पतली बादल छाए रहेंगे सफेद परत), इकट्ठाएन डी Ficoll परतों एक हस्तांतरण पिपेट का उपयोग। सूक्रोज परत संग्रह से बचने और लाल रक्त कोशिका परत को परेशान नहीं करते।
- एक नया 50 मिलीलीटर बाँझ शंक्वाकार ट्यूब में Buffy कोट स्थानांतरण। यह सब PBMC इकट्ठा करने के लिए कदम 1.8 दोहराने के लिए कई बार लग सकता है।
- PBMC के साथ ट्यूब पीबीएस 7.4 पीएच जोड़ें और 45 एमएल निशान को भरें। अच्छी तरह से ट्यूब हिला। भंवर मत करो।
- एक धो लें: अपकेंद्रित्र 15 मिनट के लिए शंक्वाकार ट्यूब के नीचे PBMCs की एक गोली के गठन का पालन 9. करने के लिए निर्धारित अधिकतम त्वरण और मंदी दोनों के साथ 480 XG पर।
- ब्लीच के 10 एमएल के साथ एक प्लास्टिक बीकर में पीबीएस (सतह पर तैरनेवाला) त्यागें।
- धीरे एक लहरदार सतह (यानी, खाली रैक) के खिलाफ 'चालाकी' से सेल गोली थोड़ा ढीला। भंवर मत करो।
- ट्यूब के लिए ताजा पीबीएस 7.4 पीएच के 25 मिलीलीटर जोड़ें। एक से अधिक ट्यूब संसाधित किया जा रहा है, तो इस चरण में एक साथ छर्रों पूल।
- 2 वॉश: अपकेंद्रित्र ट्यूब 12 मिनट के लिए 480 XG वाई में9 के लिए निर्धारित अधिकतम त्वरण और मंदी दोनों वें।
- ब्लीच की धूम के साथ प्लास्टिक बीकर में पीबीएस (सतह पर तैरनेवाला) त्यागें।
- एक लहरदार सतह (यानी, खाली रैक) के खिलाफ धीरे "रैक"। भंवर मत करो।
- ट्यूब के लिए ताजा पीबीएस के 25 मिलीलीटर जोड़ें।
- कोशिकाओं के 50 μl बाहर ले जाओ और व्यवहार्यता गिनती के लिए एक microcentrifuge ट्यूब में हस्तांतरण।
- Trypan नीले (एक व्यवहार्यता दाग) और पिपेट ऊपर के बराबर राशि (50 μl) जोड़ें और नीचे धीरे मिश्रण करने के लिए।
- 10 μl बाहर ले जाओ और एमएल प्रति कोशिकाओं की व्यवहार्यता की जांच करने के लिए एक hemocytometer को हस्तांतरण। कोशिकाओं / एमएल की संख्या रिकॉर्ड।
- कोशिकाओं के वांछित राशि बाहर ले जाओ और 9 के लिए निर्धारित अधिकतम त्वरण और मंदी दोनों के साथ 480 XG पर 12 मिनट के लिए ट्यूब अपकेंद्रित्र।
- ब्लीच के साथ बीकर में पीबीएस (सतह पर तैरनेवाला) त्यागें।
- एक लहरदार सतह (यानी, खाली रैक) के खिलाफ धीरे "रैक"। 8 जोड़ेंट्यूब में पीबीएस के 0 μl।
2. PBMC स्लाइड बनाना
- एक खुर्दबीन स्लाइड पर कोशिकाओं के 80 μl रखें। एक और स्लाइड की मदद से ड्रॉप धब्बा या स्लाइड के दोनों सिरों पर 40 μl प्रत्येक के दो बूँदें जगह है।
- सूखे के लिए जैविक सुरक्षा कैबिनेट में स्लाइड छोड़ दें। पाले सेओढ़ लिया तरफ एक पेंसिल के साथ स्लाइड लेबल।
3. स्लाइड्स पर नमूने फिक्सिंग
- 4.5 मिलीलीटर 99% इथेनॉल के लिए 37% formaldehyde के 0.5 मिलीग्राम के मिश्रण से लगानेवाला समाधान तैयार है।
- स्लाइड्स सूख रहे हैं के बाद, ताजा बना लगानेवाला समाधान के 2 मिलीलीटर बाहर ले और स्लाइड की पूरी सतह कवर किया जाता है तो यह है कि स्लाइड पर डाल देना।
- एक मिनट के लिए स्लाइड पर समाधान के लिए छोड़ दें। नल के पानी के साथ एक मिनट के लिए स्लाइड कुल्ला और शुष्क हवा के लिए छोड़ दें।
4. नकारात्मक नियंत्रण के लिए एमाइलेस समाधान कर
- एमिलेज पाउडर के 0.25 छ लो और डि की 50 मिलीलीटर में भंगसुन्न पानी। एक साफ 100 मिलीलीटर बीकर में समाधान डालो।
- स्लाइड की है कि आधे उपचार प्राप्त करता है और दूसरे आधे अनुपचारित रहता है और फिर कमरे के तापमान (चित्रा 1C) पर 15 मिनट के लिए सेते हैं ताकि बीकर में स्लाइड विसर्जित कर दिया।
- स्लाइड की ओर एमिलेज उपचार प्राप्त कर रहा है, जिस पर एक नोट करें। उपचार और नियंत्रण के बीच सीमा का संकेत स्लाइड की पीठ पर एक लाइन ड्रा।
- एमिलेज समाधान निकालने और शुष्क हवा की स्लाइड छोड़ने के लिए DDH 2 ओ के साथ स्लाइड्स धो लें।
5. आवधिक एसिड शिफ़ (पीए) धुंधला और इमेजिंग प्रदर्शन
नोट: पीए अभिकर्मकों साँस लेना द्वारा विषाक्त कर रहे हैं और संक्षारक हैं, इसलिए कदम एक रासायनिक धूआं हुड में किया जाना चाहिए, और अपशिष्ट उत्पादों को ठीक से संस्थागत दिशा निर्देशों के अनुसार निपटाया जाना चाहिए।
- एक सपाट सतह पर स्लाइड प्लेस और नमूना पर आवधिक एसिड समाधान के 1.50-2.00 मिलीलीटर डालना। Incubaकमरे के तापमान पर 5 मिनट के लिए ते।
- आसुत जल के कई आरोपों में स्लाइड्स कुल्ला।
- स्लाइड पर शिफ़ के अभिकर्मक के 1.50-2.00 मिलीलीटर डालो और 15 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर यह सेते हैं।
- 5 मिनट के लिए आसुत जल के साथ स्लाइड धो लें और शुष्क हवा के लिए छोड़ दें।
- स्लाइड पर 10 μl बढ़ते मीडिया लागू करते हैं और दो छोटे coverslips के साथ कवर, या 50 μl लागू करते हैं और एक बड़े coverslip का उपयोग करें।
- Coverslip के किनारों पर स्पष्ट नेल पॉलिश लागू करें, सूखी रातोंरात करते हैं।
6. 100X उद्देश्य का उपयोग द्विनेत्री प्रकाश माइक्रोस्कोप के साथ छवियों को प्राप्त
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Representative Results
अभिकर्मकों और बुनियादी तकनीक को मान्य करने के लिए, पीए धुंधला माउस soleus मांसपेशी वर्गों पर निर्माता के निर्देशों के अनुसार किया गया था। धुंधला बलिदान के रूप में एक ही दिन में किया गया था और धुंधला के अंतिम चरण में, वर्गों xylene द्वारा तय किया गया। soleus पेशी ~ 35% ग्लाइकोजन पॉजिटिव कोशिकाओं 9 शामिल करने के लिए जाना जाता है। दाग मांसपेशियों की कोशिकाओं कोशिका के भीतर दो अलग पीए पॉजिटिव सुविधाएँ कबरा कणिकाओं प्रदर्शित, और कोशिका झिल्ली (2A चित्रा) demarking एक सतत लाइन। कबरा कणिकाओं की उपस्थिति ग्लाइकोजन भंडार के साथ संगत है, और एक सकारात्मक पेशी सेल परिभाषित करने के लिए इस्तेमाल किया गया था। एमिलेज के साथ नमूने के उपचार के लिए उन्हें ग्लाइकोजन (चित्रा 2B) होने के साथ संगत है, जो कबरा कणिकाओं हटा दिया।
चित्रा 2: PAS- सना माउस मांसपेशी वर्गों प्रकाश माइक्रोस्कोपी के साथ विश्लेषण किया गया। माउस soleus मांसपेशी वर्गों पीए के साथ दाग रहे थे। कुछ नमूने एमिलेज के साथ पूर्व इलाज किया गया। (ए) पीए पॉजिटिव कणों मांसपेशियों की कोशिकाओं के अंदर दिखाई दे रहे थे। मांसपेशी वर्गों पूर्व इलाज एमिलेज के साथ थे जब (बी) कम पीए सकारात्मक कोशिकाओं मनाया गया। कोशिका झिल्ली के आसपास धुंधला एमिलेज उपचार (पैमाने बार = 100 माइक्रोन) के बाद बने रहे। इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
झिल्ली-धुंधला संकेत भी एमिलेज उपचार के बाद बने रहे। जैसी कि उम्मीद थी एमिलेज इलाज किया मांसपेशी वर्गों लगभग 5% पीए पॉजिटिव कोशिकाओं (चित्रा 3), काफी कम था, जबकि गैर-एमिलेज पेशी खंड में पीए पॉजिटिव कोशिकाओं का प्रतिशत, 37% थी।
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चित्रा 3: पीए पॉजिटिव मांसपेशियों की कोशिकाओं की मात्रा का ठहराव पीए सकारात्मक बिना या एमिलेज पूर्व उपचार के साथ एक प्रतिनिधि स्लाइड से गिना गया था कि मांसपेशियों की कोशिकाओं का अनुपात।। जैसी कि उम्मीद थी, मांसपेशियों की कोशिकाओं के 37% ग्लाइकोजन के लिए सकारात्मक थे। एमाइलेस उपचार काफी 4% (* पी <0.001) के लिए पीए संकेत कम कर दिया।
अगला, पीए-धुंधला प्रोटोकॉल खंड में वर्णित के रूप में एक संशोधित तकनीक का उपयोग कर स्वस्थ मानव विषयों की शिरापरक रक्त से PBMC पर प्रदर्शन किया, और चित्रा 1 में सचित्र था। धोने कदम सावधानी से प्रदर्शन किया गया अगर PBMC अच्छी तरह से पालन किया। पीए से सना हुआ PBMCs धुंधला पैटर्न के एक किस्म का प्रदर्शन किया। Granules के साथ छोटे कोशिकाओं (5 माइक्रोन) आसानी से मनाया गया। एक फैलाना धुंधला पैटर्न के साथ बड़ा कोशिकाओं की एक अनुपात भी मनाया गया (चित्रा -4 ए, और इनसेट A.1-6 (4B चित्रा) कम हो।
चित्रा 4:। PBMCs पर मानव PBMCs पर आवधिक एसिड शिफ़ (पीए) धुंधला (ए) पीए-धुंधला प्रदर्शन किया था। दो प्रकार की कोशिकाओं मनाया गया। गैर एमिलेज इलाज किया स्लाइड्स में (A.1-6) छोटे कोशिकाओं (5 माइक्रोन से कम) ग्लाइकोजन के साथ संगत मैजंटा कणों दिखाया। इन कोशिकाओं कोशिकाओं आराम किया जा सकता है। गैर एमिलेज इलाज कोशिकाओं में बड़ा कोशिकाओं (अधिक से अधिक 5 माइक्रोन) फैलाना पीए पॉजिटिव धुंधला था। इन कोशिकाओं लिम्फोसाइटों सक्रिय किया जा सकता है। (बी) PBMCs पूर्व पीए संकेत कम जो धुंधला करने के लिए 15 मिनट के लिए एमिलेज के साथ इलाज किया गया। सात अलग स्वस्थ मानव विषयों के प्रतिनिधि। (सी) पीए और hematoxyलिन धुंधला पूरे रक्त स्लाइड पर किया। तीर कई एरिथ्रोसाइट्स (पैमाने बार = 10 माइक्रोन) से घिरा हुआ एक PBMC से पता चलता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
पीए सकारात्मक था कि अनुपात छोटे कोशिकाओं के लिए 98% और बड़ा कोशिकाओं के लिए 40% थी। एमाइलेस उपचार छोटे कोशिकाओं में पीए संकेत (पी <0.001) का सफाया कर दिया है और काफी 7% (चित्रा 5) के लिए बड़ा कोशिकाओं में पीए संकेत कम हो।
चित्रा 5: पीए पॉजिटिव PBMCs की मात्रा पीए सकारात्मक बिना या एमिलेज पूर्व उपचार के साथ एक प्रतिनिधि स्लाइड से गिना गया था कि PBMCs का अनुपात।। छोटे आकार की कोशिकाओं के 98% पीए के लिए सकारात्मक थे। बड़े कोशिकाओं का 40% पी रहे थेपीए के लिए ositive। एमाइलेस उपचार छोटे कोशिकाओं में पीए संकेत (पी <0.001) का सफाया कर दिया है और काफी 7% (पी <0.001) को बड़ा कोशिकाओं में पीए संकेत कम हो।
PBMCs भी ग्लाइकोजन की राशि के quantitation 10,11 इस्तेमाल किया गया था प्रदान करता है, और पहले से अन्य प्रकार की कोशिकाओं पर 12 जौव में प्रकाशित किया गया है कि एक दूसरे, स्वतंत्र विधि ग्लाइकोजन के अधिकारी है कि पुष्टि करने के लिए। PBMCs hypotonic बफर में lysed रहे थे और ग्लाइकोजन चित्रा 6 के शीर्षक में वर्णित संक्षेप के रूप में अलग हो गया था।
चित्रा 6: हाइड्रोलिसिस एंजाइमों के साथ enzymatic पाचन का उपयोग कर ग्लाइकोजन के मापन। ग्लाइकोजन निर्माता के निर्देशों के अनुसार मापा गया था। संक्षेप में, प्रोटोकॉल अघुलनशील सामग्री की pelleting द्वारा पीछा 1 एक्स 10 6 PBMCs की hypotonic सेल जरूरत पर जोर देताकि ग्लाइकोजन शामिल हैं। गोली धोया और स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री द्वारा मापा जाता है और एक मानक वक्र की तुलना में किया गया था जो ग्लूकोज उपज हाइड्रोलिसिस एंजाइमों के साथ पचा किया गया था। सेल lysate हाइड्रोलिसिस बफर के साथ संकेत दिया अनुपात में पतला था। डाटा तीन प्रयोगों का प्रतिनिधि है। ग्लाइकोजन के महत्वपूर्ण स्तर 1 में पाया गया: एक कमजोर पड़ने (पी = 0.02), और lysate के रूप में बाहर titrated यह संकेत आगे पतला था।
अघुलनशील ग्लाइकोजन कई बार धोया, और फिर हाइड्रोलिसिस एंजाइमों का उपयोग कर पचा गया था। पाचन से मिले ग्लूकोज की मात्रा स्पेक्ट्रोफोटोमेट्री का उपयोग करके मापा और एक मानक वक्र की तुलना में था। एक लाख PBMCs ग्लाइकोजन के 1.19 माइक्रोग्राम प्रति था। सेल lysate के रूप में नीचे titrated ग्लाइकोजन संकेत आगे (चित्रा 6) पतला था।
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Discussion
इस वीडियो लेख की महत्वपूर्ण कदम कोशिकाओं की धुलाई और एमिलेज इलाज के दौरान थे। स्लाइड्स धोने, वहीं महत्वपूर्ण कदम एक प्लास्टिक दब्बू बोतल धोने का उपयोग करने और पानी धीरे स्लाइड पर नमूना के माध्यम से चलाने दे और नमूने पर सीधे लक्ष्य नहीं था। यहां तक कि थोड़ी सी भी प्रत्यक्ष पानी के दबाव स्लाइड से आने के लिए कोशिकाओं का कारण होगा। एक और महत्वपूर्ण कदम ± एमिलेज स्थितियों के लिए एक ही स्लाइड उपयोग करने के लिए किया गया था। PBMCs स्लाइड का पालन कर रहे थे के बाद, स्लाइड ध्यान से इतना धब्बा का केवल आधा एमिलेज समाधान के संपर्क में था एक बीकर में रखा गया था। रक्त कोशिकाओं को एक ही स्लाइड से कर रहे हैं क्योंकि यह कदम इस प्रकार मामूली समय विविधताओं के कारण हो सकता है कि confounding चर कम से कम एक मजबूत नियंत्रण प्रदान करता है। कोशिकाओं कोई उपचार के साथ अच्छी तरह से फंस गया, तो उदाहरण के लिए पाली एल Lysine या पॉलीथीन ग्लाइकोल कोटिंग के साथ शामिल अतिरिक्त लागत और समय warranted नहीं किया जाएगा।
टीआर के माध्यम सेएमिलेज का इष्टतम गतिविधि oubleshooting निर्धारित किया गया था। मांसपेशी वर्गों के लिए, यह एमिलेज का इष्टतम गतिविधि ऊष्मायन के 1 घंटे के भीतर मनाया गया कि नोट किया गया था। पर्याप्त रूप से पीए-संकेत को दूर नहीं किया कम समय एमिलेज पर जबकि अब समय में पेशी वर्गों धीरे-धीरे, स्लाइड दूर छील होगा। PBMC स्लाइड्स के लिए एमिलेज ऊष्मायन के लिए समय केवल 15 मिनट के लिए नीचे (1 घंटा थी) मांसपेशी नमूना समय के सापेक्ष कम किया जा सकता था। अब समय कम समय प्रभावी रूप से पीए-संकेत को प्रभावित नहीं किया था, जबकि PBMCs, स्लाइड से आने के लिए कारण होता है। पीए धुंधला की मानक प्रोटोकॉल के लिए एक संशोधन स्लाइड्स धोने की विधि बदल रहा था। निर्माता के निर्देशों कोशिकाओं स्लाइड से आने के लिए कारण होता है जो पानी के नल, चलने के साथ स्लाइड्स धोने के लिए संकेत दिया। संशोधन कोशिकाओं की रक्षा करने के दब्बू बोतल धोने के साथ स्लाइड्स धोने के लिए किया गया था। महत्वपूर्ण कदम खंड में वर्णित है, यह पानी सीधे लागू करने के लिए नहीं बहुत महत्वपूर्ण थाकोशिकाओं पर दबाव।
इस तकनीक में कुछ सीमाएं हैं। मांसपेशी कोशिका झिल्ली मांसपेशी कोशिका के कोशिका द्रव्य में कबरा कणिकाओं के साथ सना हुआ था। झिल्ली धुंधला एमिलेज के लिए असंवेदनशील था, जबकि कणिकाओं, एमिलेज उपचार और ग्लाइकोजन होने के लिए इसलिए संभावना से सफाया कर रहे थे। कोशिका झिल्ली पर पीए पॉजिटिव कणों की पहचान नहीं जाना जाता है। यह मांसपेशियों के तहखाने (perimysium) झिल्ली हो सकता है। यह झिल्ली मांसपेशी fascicles चारों ओर से घेरे और इसकी वजह से उच्च ग्लाइकोप्रोटीन सामग्री के लिए यह सकारात्मक पीए होने के लिए जाना जाता है। पीए धुंधला की एक और सीमा ग्लाइकोजन कणिकाओं व्यास में कम से कम 50 एनएम पारंपरिक प्रकाश माइक्रोस्कोपी द्वारा दिखाई करने के लिए होना चाहिए। इस प्रकार, छोटे ग्लाइकोजन कणिकाओं एक सेल में मौजूद हो सकता है, लेकिन अभी भी एक पीए परीक्षण पर नकारात्मक रजिस्टर सकता है। इस्तेमाल किया दूसरी विधि एक lysate में ग्लाइकोजन का पता लगाने प्रदान करके इस सीमा पर काबू। एक मानक की अवस्था के साथ संयोजन में इस देते करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता हैग्लाइकोजन की सही मात्रा rmine। इस तकनीक के अत्यधिक मात्रात्मक और granules के आकार के द्वारा सीमित नहीं है, यह अपने आप में कुछ सीमाएं हैं। ग्लाइकोजन कणिकाओं यह संभावना नहीं हाइड्रोलिसिस एंजाइमों को पूरी तरह से एक पूरे ग्लाइकोजन अणु 13 को भंग करते हुए कि कई गौण प्रोटीन और रासायनिक पार से लिंक के साथ जटिल branched संरचनाओं हैं। इस प्रकार, (पीए तकनीक की तरह) एंजाइमी-खोज एक नमूने में ग्लाइकोजन की वास्तविक राशि के तहत प्रतिनिधित्व कर सकते हैं। इस सीमा को संभालने के लिए एक तरीका यह भी छोटी ग्लाइकोजन कणिकाओं 14 का निराकरण जो इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ है। एक ग्लाइकोजन का सबसे व्यापक लक्षण वर्णन के लिए इन तकनीकों, पीए-धुंधला, enzymatic पाचन, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी का एक संयोजन को रोजगार के लिए होगा।
यह लेख और वीडियो PBMCs पर उपयोग के लिए अनुकूलित आवधिक एसिड शिफ़ (पीए) धुंधला तकनीक को दर्शाता है। इस अध्ययन के महत्व का उपयोग कर के चुनाव में देखा जाता हैयह और अधिक व्यावहारिक लिम्फोसाइटों गणना करने के लिए बनाया है, जो रक्त स्मीयर से अधिक PBMCs,। प्रारंभ में, एक क्लासिक रक्त-धब्बा तकनीक का परीक्षण किया गया था, स्लाइड पर कोशिकाओं की लेकिन बहुमत लाल रक्त कोशिकाओं और संभवतः न्यूट्रोफिल (चित्रा 4C) थे। लिम्फोसाइटों ध्यान केंद्रित करने के लिए, PBMCs मानक घनत्व ढाल तकनीक का उपयोग कर खून से शुद्ध किया गया। एक रक्त-स्मीयर के समान तकनीक का उपयोग करना, PBMCs आसानी से कई जोरदार धोने कदम है जो पीए प्रक्रिया की अवधि के लिए पालन किया। पीए तकनीक पतली वर्गों में कटौती और स्लाइड का पालन कर रहे है, जो मांसपेशियों के ऊतकों बायोप्सी में ग्लाइकोजन के स्तर को निर्धारित करने के लिए दशकों के लिए इस्तेमाल किया गया है। पीए धुंधला होने के कारण इसकी उच्च विश्वसनीयता और साहित्य में अपेक्षित परिणाम की उपस्थिति के अन्य कार्बोहाइड्रेट धुंधला रसायनों पर चुना गया था। उम्मीद के रूप में एक चूहे (मुस spretus) मांसपेशी वर्गों कोशिकाओं के 37% पीए पॉजिटिव 9 थे कि, एक सकारात्मक नियंत्रण के रूप में इस्तेमाल किया और पाया गया था। लागत और समय के संदर्भ में, पीबीएम तैयारीसी एक रक्त धब्बा की तुलना में अधिक दुर्वह है, लेकिन वहाँ कई फायदे हैं। सबसे पहले, तैयारी औतोइम्मुिनित पर केंद्र कि परियोजनाओं के लिए ब्याज की कोशिकाओं रहे हैं जो लिम्फोसाइटों, में और अधिक समृद्ध है। रक्त स्मीयर इस्तेमाल किया गया है, तो लिम्फोसाइटों यह चुनौतीपूर्ण ब्याज की सेल को खोजने के लिए कर रही है, अल्पसंख्यक होगा। एक तैयार है और आप कुछ PBMC स्लाइड के साथ मिल जाएगा एक ही नंबर पाने के लिए कहीं अधिक स्लाइड का विश्लेषण करना होगा। शोधकर्ताओं ने टी और बी लिम्फोसाइटों और एन.के. कोशिकाओं एक भूमिका निभाते हैं, जहां एक मधुमेह, आदि एकाधिक काठिन्य, एक प्रकार का वृक्ष, संधिशोथ, प्रकार से संबंधित औतोइम्मुिनित परियोजनाओं में हमारे नए अनुकूलित तकनीक का प्रयोग करने में बहुत दिलचस्पी होगी। बेशक, एरिथ्रोसाइट्स या न्यूट्रोफिल रुचि के हैं जहां अन्य अनुप्रयोगों के लिए रक्त स्मीयर सिफारिश की जाएगी। अन्य लाभ PBMCs इन विट्रो में मानव लिम्फोसाइट जीव विज्ञान का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
चल रहे एक शोध PBMCs में ग्लाइकोजन के स्रोत की जांच कर रहा है। मेँएन भविष्य, यह एकाधिक काठिन्य, 2013 15,16 के रूप में दुनिया भर में एक अनुमान के अनुसार 23 लाख लोगों को प्रभावित करता है कि एक टी लिम्फोसाइट की मध्यस्थता autoimmune रोग के संदर्भ में ग्लाइकोजन सामग्री को मापने के लिए योजना बनाई है। PBMC नमूनों में छोटे और बड़े कोशिकाओं क्या हैं? 5 माइक्रोन पर कोशिकाओं को उनके आराम की स्थिति में ल्य्म्फोइड वंश के साथ संगत कर रहे हैं। टी लिम्फोसाइट, बी लिम्फोसाइटों, प्राकृतिक हत्यारा कोशिकाओं, और अन्य छोटे सबसेट इस आकार सीमा के भीतर हैं। बड़ा PBMCs संभावना माइलॉयड वंश से सक्रिय वे प्रतिरक्षा प्रणाली से भड़काऊ संकेतों को प्राप्त के रूप में बड़ा हो जाना जो लिम्फोसाइटों, और monocytes से बना रहे हैं। ऐसे फ्लोरोसेंट सक्रिय सेल छंटनी या चुंबकीय सक्रिय सेल छँटाई के रूप में उन्नत सेल छँटाई तकनीक आगे ग्लाइकोजन व्यक्त करता है कि सबसेट परिष्कृत करने के लिए आवश्यक हैं।
धुंधला पूरे रक्त पर किया गया था जब hematoxylin काउंटर धुंधला इस्तेमाल किया गया था। इस एरिथ्रोसाइट्स से monocytes (भेद करने के लिए हमें सक्षमचित्रा 4C)। धुंधला PBMCs पर किया गया था जब सभी कोशिकाओं मोनोन्यूक्लियर थे, के बाद से, कोशिकाओं की पहचान करने के लिए hematoxylin साथ दाग मुकाबला करने के लिए कोई ज़रूरत नहीं थी। इसके अलावा hematoxylin कोशिकाओं में पीए संकेत के साथ दखल दे रहा था। सारांश में, हम PBMCs के लिए अनुकूलित एक पीए-धुंधला प्रक्रिया का प्रदर्शन किया है। इस तकनीक स्वरोगक्षमता, संक्रमण और एलर्जी शोध वैज्ञानिकों और चिकित्सकों के लिए उपयोगी है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Periodic Acid Shiff Kit |  Sigma-Aldrich |
395B | Bring to room temperature prior to use. Materials in this kit are toxic and harmful. Use caution. |
| α-Amylase from porcine pancreas | Sigma-Aldrich |
A3176 | |
| Binocular Microscope | Carl Zeiss Microscopy | Axio Lab A0 | |
| Glycogen Assay Kit | Sigma-Aldrich |
MAK016 | |
| Ficoll-Paque PLUS | VWR, GE Healthcare |
17-1440-02 | Nonionic synthetic polymer of sucrose. |
| Centrifuge | For PBMC isolation, swing buckets were used. |
References
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