Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس Published: December 16, 2014 doi: 10.3791/52211
Automatic Translation
1, 1
1Division of Neuropathology, Department of Pathology, Pathobiology Graduate Program, Johns Hopkins School of Medicine

Introduction

محطة deoxynucleotidyl ترانسفيراز (TDT) dUTP وضع العلامات نهاية نيك (TUNEL) هو عملية استخدام انزيم TDT إرفاق dUTP إلى 3 'ينتهي من مزدوجة ومفردة الذين تقطعت بهم السبل DNA يكسر 12،23. وذكرت وطريقة TUNEL للكشف عن الخلايا والحمض النووي الضرر لأول مرة منذ أكثر من 20 عاما من قبل Gavrieli وآخرون. 1،12،24. ومنذ ذلك الحين تم تقييمها والأمثل في الأعمال التحضيرية الأنسجة المختلفة 7،23،27،40. وقد استخدم TUNEL لدراسة موت الخلايا الناجم عن نقص التروية من الخلايا العصبية 6،14،29 والعضلية 43،44، excitotoxic المواد موت الخلايا العصبية 30،31، وكما العلامات البيولوجية في علاج التهاب المفاصل 39. كما تم استخدامه كعامل النذير وعلامة الخلايا السرطانية في مختلف السرطانات البشرية 2،3،15،32،37،38،42.

وتوجد طرق بديلة لالحمض النووي من التلف والكشف عن موت الخلايا، ولكن لديهم التحديات التقنية والمحاذير. النشاف الجنوبي يمكن أن تستخدم لquantifذ الحمض النووي من التلف في الأنسجة لست] كاملة 7،9-11، ولكن هذه الطريقة لا توفر الدقة المستوى الخلوي ويصعب قياسها كميا. الفحص المذنب هو طريقة خلية القاعدة البديل الذي يتطلب استخراج نواة من خلايا الحفاظ 4،20،28،36. على الرغم من أن الفحص المذنب يعمل بشكل جيد على خلايا معزولة مثقف، هو أكثر صعوبة لإعداد نواة سليمة من أنسجة العضلات والهيكل العظمي 8،21. كما هو الحال مع اللطخة الجنوبية، ومقايسة المذنب لا يقدم معلومات الخلية من نوع محددة من كله جناسة الأنسجة العضلية. وثمة بديل آخر لطريقة TUNEL هو المناعية باستخدام أجسام مضادة ضد احد الذين تقطعت بهم السبل DNA 25،33،41 أو ضد البروتينات التي تشارك في الحمض النووي ردا الضرر وموت الخلايا مسارات (مثل البروتين p53، H2AX، وcaspases) 13،17،22،40. مثل هذه الأساليب القائمة على الأجسام المضادة تتطلب توصيف دقيق للالأجسام المضادة والأجسام المضادة خصوصية ممتازة لانتاج نسبة عالية الإشارة إلى الخلفية. حتى عندما المواصفاتالأجسام المضادة IFIC موجودة، وأنها قد تتطلب تمسخ من البروتين الهدف من خلال إجراءات استرجاع مستضد 34،35. ونحن نناقش هنا، استرجاع مستضد في نتائج الأنسجة العضلية في تألق ذاتي عالية بشكل غير مقبول. وخلافا للطرق البديلة، TUNEL يحقق DNA الضرر الكشف مع إشارة عالية وخلفية منخفضة، والنوعية الممتازة التي يمكن اختبارها مع ضوابط بسيطة الإيجابية والسلبية، اختراق الأنسجة الجيدة التي لا تتطلب استرجاع مستضد، والدقة المستوى الخلوي. وبالإضافة إلى ذلك، فإن الطريقة TUNEL يستغرق حوالي 4 ساعات لإكمال، في حين أن الطرق البديلة تتطلب عادة حضانات بين عشية وضحاها.

نقوم بدراسة الهيكل العظمي موت الخلايا العضلية في نموذج الفأر من ضمور العضلات الشوكي (SMA) 10 التي تم إنشاؤها بواسطة هسيه لى وزملاؤه 16. لتحديد الخلايا أفكارك في العضلات، قمنا بتطوير طريقة التحضير الأنسجة، وتلطيخ، والكميات التي تعمل بقوة عبر skele مختلفةمجموعات العضلات التل على مختلف النقاط الزمنية التنموية في الفئران. ونحن نستخدم المتاحة تجاريا عدة TUNEL وضع العلامات ومتاحة تجاريا البرمجيات تحليل الصور. وعلينا أيضا أن تستخدم بنجاح الفحص TUNEL في تركيبة مع تلوين مناعي في الحبل الشوكي 10.

الأساليب المذكورة هنا هي مفيدة للمحققين الذين يريدون لتقييم أمراض الأنسجة، وآليات المرض، وآليات الشيخوخة، والتنموية (قبل وبعد الولادة) موت الخلايا في العضلات والهيكل العظمي. تقنية TUNEL مفيدة بشكل خاص للدراسات الحمض النووي من التلف وإصلاح وموت الخلايا في نظم نموذج حيث لا يوجد سوى مجموعة فرعية من الخلايا هي قرار مستوى المتضررين والخلوية ضروري.

هذا الفيديو يصف تشريح، معالجة الأنسجة، باجتزاء، ووضع العلامات TUNEL القائم على مضان من الماوس العضلات والهيكل العظمي. ويصف التقرير أيضا وسيلة لشبه الآلي إشارة الكميات TUNEL.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

ملاحظة: تم تنفيذ جميع الإجراءات الحيوانية وصفها في هذا البروتوكول وفقا للتوصيات الواردة في دليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية من المعاهد الوطنية للصحة 26. وتمت الموافقة على البروتوكول (MO13M391) من قبل لجنة جامعة رعاية الحيوان واستخدام جونز هوبكنز.

1. حديثي الولادة ماوس النحر، تشريح، والتثبيت

  1. التضحية ماوس الأطفال حديثي الولادة عن طريق CO 2 الاستنشاق.
  2. قطع على الفور من على hindlimb فوق الركبة. حتى اليوم ما بعد الولادة حوالي 7، وعظام الساق هي لينة بما يكفي لقطع طريق مع مقص مختبر كبيرة أو شفرة حادة وقسم في وقت لاحق على ناظم البرد.
  3. ضع hindlimb في 10 مل من الجليد الباردة بارافورمالدهيد 4٪ في الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) في أنبوب 15 مل.
  4. الغمر إصلاح hindlimb في امتصاص العرق ل4-24 ساعة في 4 درجات مئوية. الأنسجة الجنينية تتطلب عدة ساعات فقطالصورة للتثبيت.
    1. تجنب تثبيت أطول من 24 ساعة، وهذا قد يقلل TUNEL كفاءة الفحص.
  5. Cryoprotect في hindlimb عن طريق غمر في محلول السكروز.
    1. تغيير بارافورمالدهيد إلى 10٪ سكروز في برنامج تلفزيوني في نفس أنبوب 15 مل، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    2. التغيير إلى 30٪ سكروز في برنامج تلفزيوني، واحتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية أو حتى المصارف hindlimb إلى أسفل الأنبوب. الأنسجة قد يكون غادر في 30٪ سكروز لفترة أطول، شريطة أن يكون السكروز كانت عقيمة-تصفيتها.

2. الأنسجة التضمين

  1. ملء المسمى تضمين العفن في منتصف الطريق مع تضمين المتوسطة.
  2. وضع hindlimb على أعلى من المتوسط ​​التضمين، مع الجانب قطع أقرب وقت ممكن لجدار واحد من العفن. بمناسبة توجه hindlimb في الخارج من القالب.
    1. تضمين عدة hindlimbs وقطع في نفس الكتلة. ومع ذلك، فمن المهم التأكد من أن كل هينموجهة dlimbs في كتلة موازية لبعضها البعض للحصول على الأقسام في مطابقة المستويات على طول محور من أطرافهم.
  3. تغطية hindlimbs مع تضمين المتوسطة. إذا hindlimbs SHIFT أثناء صب المتوسطة، وإعادة توجيه، منهم بالملقط حادة ذات الرؤوس أو المسواك.
  4. يسمح تضمين المتوسطة التسلل إلى الأنسجة في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة على الأقل.
  5. مكان قوالب مباشرة على الثلج الجاف أو في isopentane على الثلج الجاف لتجميد تضمين المتوسطة. تأكد للحفاظ على مستوى قوالب في جميع الأوقات وتجنب التحول من الأنسجة المضمنة.
  6. الحفاظ قوالب المجمدة في -80 درجة مئوية لتصبح جاهزة لقطع، لمدة تصل إلى عدة أشهر.

3. Cryosectioning جزءا لا يتجزأ من أطرافه

  1. ضبط درجة الحرارة الغرفة ناظم البرد إلى -20 ° C، درجة حرارة الجسم إلى -18 ° C. ضبط درجة حرارة الكائن أسفل عند الضرورة.
  2. تتوازن كتلة الأنسجة داخل غرفة ناظم البرد لمدة 30 دقيقة على الأقل. درجة الحرارة كتلة الصحيحةerature هو أمر حاسم لقسم الجودة.
  3. قطع المقاطع العرضية في سمك 10 ميكرون أو أقل. لن يتم اختراقها أقسام سمكا بالكامل من قبل الكواشف TUNEL. استخدام لوحة مكافحة لفة، شفرات، وزاوية شفرة (عادة 5 °) الموصى بها لناظم البرد.
  4. جمع المقاطع على gelatin- أو الشرائح الزجاجية المغلفة vectabond في درجة حرارة الغرفة. وضع على الفور في مربع الشريحة على الثلج الجاف. الاحتفاظ مربع الشريحة في وعاء منفصل مع الثلج الجاف وضعت بالقرب من ناظم البرد في متناول الذراع.
    1. قطع الأجزاء المتسلسلة عرضية من خلال محور طويل من أطرافه، وتخطي 100-200 ميكرون. جمع لا يقل عن 3 أقسام المجاورة في كل مستوى التسلسلي.

4. TUNEL الفحص على أقسام Hindlimb باستخدام أدوات المتاحة تجاريا (جميع الخطوات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر)

  1. ذوبان الجليد الشرائح مع أقسام لدرجة حرارة الغرفة، وبين عشية وضحاها الجاف أو خلال عطلة نهاية الاسبوع.
  2. ترطيب أقسام كتبها immersinز الشرائح في برنامج تلفزيوني لمدة 2 × 10 دقيقة في جرة Coplin. الجافة مع مختبر مسح، وإزالة أكبر قدر من السائل حول القسم ممكن.
  3. أقسام Permeabilize
    1. استخدام إما غير بروتين، كاشف القائم على سابونين تجاري أو 0.5٪ Tween20 و 0.05٪ تريتون X100 في برنامج تلفزيوني.
    2. ضع الشريحة في غرفة الرطوبة. غرفة الرطوبة البسيطة هي مربع ماصة فارغة مع غطاء محكم، مع يضاف الماء ما يكفي لتغطية الجزء السفلي من مربع.
    3. ماصة كاشف كافية على الشريحة لتغطية القسم (50 ميكرولتر كافية لأطرافه الماوس حديثي الولادة). لا ماصة مباشرة على الباب، والتحريض المتكرر قد يؤدي القسم لرفع قبالة الشريحة.
    4. باستخدام ملقط حادة ذات الرؤوس، ضع مستطيل صغير من parafilm على رأس القسم لنشر قطرة من الكاشف وتغطي كامل القسم. إذا تشكل أي فقاعات تحت بارافيلم، ورفع بلطف تشغيله، الجافة، وتطبيق.
    5. احتضان الشرائح مع permeabilization كاشف لمدة 1 ساعة في غرفة الرطوبة مغطاة. إذا بدأت أقسام لرفع الخروج من الشرائح، وربما يتم تخفيض الوقت permeabilization إلى 30 دقيقة.
    6. غسل الشرائح في برنامج تلفزيوني في Coplin جرة 2 × 5 دقائق. يجب المستطيلات بارافيلم تطفو إلى الأعلى، ويمكن بعد ذلك إزالتها والتخلص منها.
    7. باستخدام مختبر قضاء، وتجفيف الكثير من السائل حول أقسام ممكن.
  4. TDT بوساطة الحمض النووي كسر الوسم
    1. اتبع الإرشادات عدة لجعل 1X TDT عازلة وضع العلامات، وماصة المخزن ما يكفي من وضع العلامات على الشريحة لتغطية قسم الأنسجة (50 ميكرولتر كافية لأطرافه الماوس حديثي الولادة). احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. بدلا من ذلك، تزج الشريحة في TDT عازلة وضع العلامات في جرة coplin.
    2. اتبع الإرشادات عدة لجعل TDT وضع العلامات المزيج. وتشمل هذه المجموعة الكوبالت والمغنيسيوم والمنغنيز والكاتيونات. والموجبة المنغنيز يعمل بشكل جيد على مجموعة متنوعة من الأنسجة، بما في ذلك العضلات والهيكل العظمي، TISS الجهاز العصبيUES والكبد والجلد والعظام.
    3. للتحكم إيجابية، إضافة الدناز (المسمى "نوكلياز" في المجموعة) إلى وضع العلامات مزيج TDT. بدلا من ذلك، قبل علاج قسم مراقبة الإيجابي مع الدناز العازلة في نوكلياز لمدة 1 ساعة عند 37 درجة مئوية، وفقا لتعليمات الطقم. حافظ على حل الدناز وأقسام المعالجة الدناز بعيدا عن أقسام تجريبية أخرى لمنع انتقال التلوث.
    4. لسيطرة سلبية، حذف TDT انزيم من مزيج العلامات.
    5. استخدام مختبر محو لإزالة أكبر قدر من TDT عازلة وضع العلامات من الشريحة ممكن. ماصة TDT وضع العلامات مزيج على الشريحة (50 ميكرولتر لكل قسم)، وتغطي مع مستطيل جديد من parafilm، واحتضان في غرفة الرطوبة عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    6. اتبع الإرشادات عدة لجعل عازلة توقف 1X. استخدام مختبر مسح لإزالة TDT وضع العلامات مزيج من الشرائح، وإضافة 200-300 عازلة توقف ميكرولتر لتغطية قسم الأنسجة، واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق. آل ternatively، تزج الشريحة في المخزن توقف في جرة Coplin.
    7. غسل دقيقة الشريحة 2 × 2 في برنامج تلفزيوني. استخدام مختبر محو لإزالة PBS قدر من الشريحة ممكن.
  5. وضع العلامات الفلورية
    1. اتبع الإرشادات عدة لإعداد حل التوسيم فلوريسئين لتسمية dNTPs في فواصل DNA. حل ماصة على الشريحة (50 ميكرولتر لكل قسم)، وتغطي مع مستطيل جديد من parafilm، واحتضان في غرفة الرطوبة لمدة 20 دقيقة.
    2. غسل الشريحة لمدة 2 دقيقة في برنامج تلفزيوني في جرة Coplin. استخدام مختبر محو لإزالة PBS أكبر قدر ممكن من الشريحة.
    3. تمييع هويشت 33258 صمة عار النووية إلى 1 ميكروغرام / مل في برنامج تلفزيوني وماصة على الشريحة (100-200 ميكرولتر كافية لتغطية القسم). احتضان في غرفة الرطوبة لمدة 5 دقائق.
    4. غسل 3X لمدة 5 دقائق في برنامج تلفزيوني.
    5. ساترة مع antifade مضان وسائل الإعلام تصاعد وختم حواف مع طلاء الأظافر.
jove_title "> 5. اقتناء الصور الرقمية

  1. الحصول على الصور باستخدام المجهر الفلورسنت التقليدية مع دابي، FITC، والمرشحات تكساس الأحمر (أو ما يعادلها). استخدام الهدف التكبير العالي (20X 40X أو) للتحقق من أن العلامات كانت ناجحة وكانت وصفت نوى (سليمة أو مجزأة). والهدف 10X كافية لتحديد الكميات من نقاط وTUNEL إيجابية.
  2. جمع الصور من تلطيخ هويشت، TUNEL تلطيخ، وإشارة autofluorescent كما ثلاث قنوات كاذبة اللون منفصلة مجتمعة في صورة واحدة. إذا كانت التسمية fluorophore TUNEL خضراء، إشارة الصورة autofluorescent في مرشح أحمر، والعكس بالعكس.
    1. منع جميع إعدادات التصوير يعادل بين الشرائح لالعتبة والكميات اللاحقة. لكل مرشح، وأوقات محددة مسبقا والتعرض قياسية، ربح، وbinning (أي binning هو أفضل)؛ لا تستخدم إعدادات التعرض أو كسب التلقائي.
    2. استخدام التجربة والخطأ للعثور على التعرض وزيادة الإعدادات التي سوف أفضل التقاط مجموعة من intensities عبر كافة الشرائح الملون. ضمان أنه لا توجد بكسل المشبعة في الصور المكتسبة، وهذه الإرادة التحيز الكميات.
  3. التقاط صور لمجموعة العضلات كامل من الفائدة. وهذا قد يتطلب عدة صور إلى أن "مخيط" معا.

تحليل 6. صورة

  1. استخدام المتاحة تجاريا برامج تحليل الصور لتحليل الصور الرقمية من النفق تلطيخ. ويظهر التحليل باستخدام البرمجيات التجارية هنا. بدلا من ذلك، برنامج يماغيج خالية من NIH يمكن استخدامها لتحليل TUNEL تلطيخ.
  2. وصمة عار قسم مجاور لقسم الملطخة TUNEL مع الهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) واتخاذ القسم كامل الصورة الرقمية مع المجهر brightfield التقليدية. استخدام هذا H & E الصورة في تركيبة مع أطلس التشريح 5،18،19 لتتبع الهياكل التشريحية ليكون كميا.
  3. مع تحول قناة TUNEL قبالة، يدويا تتبع الخطوط العريضة للمنطقة ليكون كميا، وذلك باستخدامهويشت وقنوات تألق ذاتي للاسترشاد بها. تحويل المنطقة تتبع إلى قناع (مجموعة من بكسل اختيار ينسق ليتم تحليلها).
  4. بدوره على قناة TUNEL. باستخدام شدة العتبة وظيفة في برنامج تحليل الصور، تعيين عتبة أدنى لاستبعاد كل إشارة تألق ذاتي.
  5. تطبيق الإعدادات عتبة نفسها لجميع الصور في مجموعة الدراسة. تحويل التحديدات thresholded إلى أقنعة.
  6. لكل صورة، والجمع بين القناع منطقة العضلات وقناع TUNEL. سوف قناع تركيبة جديدة تمثل إشارة TUNEL داخل منطقة العضلات تتبع فقط.
  7. أداء قناع الكميات على القناع تركيبة لتحديد عدد الكائنات وجوه مجال إشارة TUNEL داخل منطقة العضلات تتبعها. تنفيذ هذا باستخدام وظيفة الجسيمات محلل في يماغيج.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

مع تلطيخ ناجحة، يجب أن تكون-TUNEL إيجابي إشارة مشرق بما فيه الكفاية لعزل من تألق ذاتي من خلال وضع عتبات كثافة. الأجسام TUNEL إيجابية في التكبير المنخفض قد تظهر أجزاء غير منتظمة كما مشرق في العضلات والهيكل العظمي (الشكل 1A). ومع ذلك، في أعلى التكبير، وبعض الكائنات TUNEL الإيجابي مع التشكل أفكارك الكلاسيكي ينبغي أن تراعى، إذا كان نوع موت الخلايا المعنية هو موت الخلايا المبرمج (الشكل 1B). مراقبة إيجابية (المضافة الدناز) يجب أن تظهر وفيرة-TUNEL إيجابي إشارة، موزعة بشكل متجانس في جميع الأنسجة في قسم (الشكل 1C). سيطرة سلبية (TDT انزيم حذفت من رد فعل) ينبغي أن تسفر خلفية منخفضة الكثافة وإشارة autofluorescent فقط (1D الشكل). يوفر الجلد عنصر تحكم إيجابية الداخلية في أقسام المحطة بأكملها، وهذا النسيج لديها نسبة عالية من الخلايا العادية (الشكل 1A).

الدم الحمراءالخلايا والعظام والخلايا البطانية يمكن أن تسهم كبيرة إشارة autofluorescent (الشكل 2). فإنه من المستحسن أن صورة كل قسم في قناة منفصلة مع أي وضع العلامات الفلورية لضمان تألق ذاتي ليس مخطئا لإشارات TUNEL إيجابية. وينبغي أن يكون الحقيقية-TUNEL إيجابي إشارة كثافة أعلى بكثير من تألق ذاتي، بحيث يمكن عزلها من خلال وضع عتبات كثافة الصورة (الشكل 2A، الصف الأوسط). بدلا من ذلك، القناة autofluorescent قد تطرح رقميا من قناة TUNEL أن تسفر-TUNEL إيجابي إشارة (الشكل 2A، الصف السفلي).

طريقة وضع العلامات TUNEL الموصوفة هنا قد استخدمت لقياس موت الخلايا العضلات والهيكل العظمي في نموذج الفأر من SMA 10. يظهر وضع العلامات TUNEL زيادة في عدد محات أفكارك في عضلات الساق من 5 أيام الفئران SMA القديمة، مقارنة مع الضوابط littermate (الشكل 3A). الزيادة في موت الخلايا المبرمج هوقابلة للقياس الكمي التي كتبها الطريقة الموصوفة أعلاه، مشيرا إلى فروق ذات دلالة إحصائية في مجموعات العضلات متعددة (الشكل 3B).

الشكل (1)
الشكل 1: وضع العلامات TUNEL الممثل العضلات hindlimb الماوس. وصفت TUNEL (A) المقطع العرضي من الماوس hindlimb تظهر الظنبوبي الأمامي العضلات، والساق، والجلد. TA - الظنبوبي الأمامي، إف دي إل - المثنية لأصابع إبهام اليد، مؤسسة كهرباء لبنان - الباسطة للأصابع الطويلة. الأخضر - TUNEL والأزرق - نوى، الحمراء - إشارة autofluorescent. الخطوط المنقطة ترسم مناطق العضلات لتحديد الكميات. الجلد المجاور العضلات hindlimb يوفر مراقبة إيجابية الداخلية لوضع العلامات TUNEL. شريط النطاق = 200 ميكرومتر. (B) التمثيلية صور عالية التكبير تحديد TUNEL إيجابية الهياكل (الأخضر) في الجنينية يوم 13 الماوس العضلات والهيكل العظمي كما نوى أفكارك. شريط النطاق = 10 ميكرومتر. A و B معدلة من Fayzullina ومارتن 2014 10. (C) المستعرض قسم من الماوس hindlimb TUNEL المسمى بعد العلاج الدناز لتكون بمثابة مراقبة إيجابية. معظم نواة لها وضع العلامات TUNEL مشرق. شريط النطاق = 50 ميكرومتر (D) المقطع العرضي من نفس الماوس hindlimb كما هو مبين في C (شبه المتاخمة للقسم في C) TUNEL المسمى مع TDT انزيم حذفت لتكون بمثابة سيطرة سلبية. لا يوجد أي إشارة TUNEL إيجابية مشرقة. إشارة خضراء الوحيد هو تألق ذاتي كما الكشف عنها بواسطة colocalization مع إشارة في القناة الحمراء. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

2 "FO: محتوى العرض =" 6in "SRC =" / الملفات / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg "العرض =" 600 "/>
الشكل 2: الأنسجة تألق ذاتي يجب النظر ويستثنى من الكميات عند تحليل وضع العلامات TUNEL. (A) ماوس hindlimb المقطع العرضي مع وضع العلامات TUNEL وتألق ذاتي: الصورة الأصلية (الصف العلوي)، وبنفس الصورة مع عتبات المعدلة (الصف الأوسط)، ونفس الصورة مع تألق ذاتي (الحمراء) قناة تطرح (الصف السفلي). العتبة يزيل خلايا الدم الحمراء أكثر وتألق ذاتي الخلايا البطانية ولكن ليس قطعة أثرية تلطيخ (رأس السهم، الصف الأوسط). الطرح القناة أيضا يلغي قطعة أثرية تلطيخ (رأس السهم، الصف السفلي). الأخضر - TUNEL والأحمر - تألق ذاتي والأزرق - نوى. على نطاق وبار = 100 ميكرون. المستطيل الرمادي يحدد منطقة تضخيم في (ب). (ب) ارتفاع تكبير الصورة من لوحة حمراء تألق ذاتي في A. خلايا الدم الحمراء وبعض الخلايا البطانية (الأسهم)، وTISSرق تلطيخ قطعة أثرية (رأس السهم) autofluoresce في كل من المرشحات مضان الحمراء والخضراء. شريط النطاق = 50 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الشكل 3: وضع العلامات TUNEL يظهر موت الخلايا في العضلات والهيكل العظمي من الفئران SMA حديثي الولادة وصفت العضلات hindlimb انخفاض من الفئران SMA في يوم ما بعد الولادة 5 من طريقة TUNEL (A) وضع العلامات TUNEL يظهر ملامح أفكارك متعددة في مجموعات العضلات متعددة في SMA الماوس. العضلات (يمين) مقارنة مع السيطرة littermate (يسار). الأخضر - TUNEL والأزرق - هويشت (النواة) والأحمر - تألق ذاتي. الخطوط المنقطة ترسم المناطق العضلات كميا. TA - الأمامية الظنبوبي، إف دي إل - حفر المثنيةitorum الطويلة، مؤسسة كهرباء لبنان - الباسطة للأصابع الطويلة. الحانات النطاق = تم كميا 200 ميكرون وضع العلامات. (B) كما TUNEL مجموع مساحة بكسل إشارة TUNEL تطبيع إلى إجمالي مساحة بكسل من العضلات. وترد يعني ± الأخطاء المعيارية، ن = 4-5 الفئران. دلالة إحصائية بين SMA والسيطرة على كل مجموعة العضلات (وحيد الطرف اختبار t): * ف <0.05، ** p <0.01، *** P <0.001. تم تعديل هذا الرقم من Fayzullina ومارتن 2014 10. يرجى النقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وهناك طريقة لكشف وتحليل كمي DNA المرتبط ضرر الخلايا في الماوس العضلات والهيكل العظمي وصفها. ويشمل الإجراء الحصاد الأنسجة، TUNEL تلطيخ، واقتناء الصور الرقمية، وتحليل الصور. هناك حاجة إلى إمدادات وأدوات النسيجية المشتركة، وTUNEL عدة التجارية الخاصة أمر ضروري. بنود المعدات الكبيرة الأساسية اللازمة لناظم البرد، المجهر epifluorescent مع القدرة الصورة الرقمية، ونظام الكمبيوتر لتحليل الصور.

وينبغي أن يكون المجرب علم المزالق المحتملة. الأنسجة تألق ذاتي هو مصدر قلق كبير في مجال التصوير مضان. في الحيوانات unperfused، وخلايا الدم الحمراء المتبقية المساهمة عالية نسبيا إشارة autofluorescent. ويمكن أيضا أن الخلايا البطانية autofluorescent بشكل كبير. ولذلك، من المهم للتأكد من أن تألق ذاتي ليس مخطئا لإشارة TUNEL إيجابية. يتم إنجاز هذا التقييم بسهولة عن طريق اتخاذ صورة في قناة بدون فلوريداuorophore، لاستخدامها للمقارنة واحتمال الطرح من قناة TUNEL إيجابية. في هذه الطريقة، طريقة TUNEL القائم على مضان متفوقة على الطرق brightfield المجهري اللونية التي لا تقدم الرقابة الداخلية لتلوين الخلفية.

سوف الأنسجة التثبيت يكون لها آثار كبيرة على نجاح وضع العلامات TUNEL. فمن الأفضل لتقليل وقت التثبيت في امتصاص العرق، لا تتجاوز 24 ساعة. سوف الأنسجة الجنينية وحديثي الولادة تتطلب تثبيت مرات أقصر بكثير من 24 ساعة.

عندما وضع العلامات TUNEL ناجحا، يجب أن تكون-TUNEL إيجابي إشارة أعلى بكثير من تألق ذاتي الخلفية، بحيث إشارة يمكن عزلها بسهولة عن طريق الكثافة عتبة النابضة باستخدام برمجيات تحليل الصور. استرجاع مستضد باستخدام بروتوكول قياسي للتدفئة في المخزن سترات 27،35 قد تحسن قليلا منخفضة إشارة TUNEL إذا بقيت الوقت التدفئة إلى الحد الأدنى (5 دقائق)، ولكن هذه المعالجة عشرةس للحد من إشارة TUNEL إذا تم تمديد التدفئة لفترات أطول (على سبيل المثال 20 دقيقة في 95 ° C). سوف استرجاع مستضد زيادة تألق ذاتي الخلفية وايجابيات كاذبة، وبالتالي قد ينفي أي مكاسب في نسبة الإشارة إلى الضوضاء من زيادة إشارة TUNEL.

يجب تطبيع القياسات إشارة TUNEL إما إلى منطقة العضلات إجمالي quantitated أو إلى عدد من النوى في منطقة quantitated. لأن TUNEL يقيس نوى أفكارك، فإن التطبيع المثالي هو أن يكون مجموع نوى. ومع ذلك، وحتى في رقيقة نسبيا (10 ميكرون) أقسام العضلات، وmyofibers ونوى كثيرة جدا ومعبأة بشكل وثيق، وأنه من المستحيل أن العد نوى هويشت الملون وقبل العتبة وفصل الجسيمات خوارزميات تلقائيا. دليل العد هو أيضا جدا والعمل المكثف وغير دقيقة. البديل الممكن هو تطبيع لمنطقة العضلات الإجمالية.

الفحص TUNEL، وتستخدم مع معالجة الأنسجة المناسبالتقنيات والضوابط الإيجابية والسلبية، هو، قابلة للتكرار، طريقة الكمي السريع نسبيا للكشف عن الحمض النووي من التلف وموت الخلايا في الأنسجة. ويمكن استخدامه لتأكيد موت الخلايا المبرمج كآلية المرضية، لتحديد أنواع الخلايا المتضررة، وتقييم فعالية من العلاجات العلاجية. وهذا الإجراء تكون ذات قيمة للباحثين في مجالات أمراض العضلات والهيكل العظمي والإصابة، بما في ذلك SMA، ALS، ضمور العضلات، التي يسببها السم اعتلال عضلي، وممارسة علم وظائف الأعضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline Electron Microscopy Sciences 19202 For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde.
Sucrose Sigma S0389 Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used.
O.C.T. compound Tissue-Tek 4583 Embedding medium for cryosectioning.
Cryostat Leica CM 3050S A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used.
Glass slides, 25 x 75 x 1 mm Fisher 12-552-3 Slides from any supplier may be used.
Gelatin Sigma G-9391 Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased.
Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) Sigma 243361 Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum.
Vectabond tissue adhesion reagent Vector Labs SP-1800 Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead.
Tween20 Sigma P9416 A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used.
Triton X100 Sigma T8787 A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used.
TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit Trevigen 4812-30-K Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling.
DNase/nuclease Trevigen 4812-30-K (included with kit)
DNase/nuclease buffer Trevigen 4812-30-K (included with kit)
10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 Amresco 780 Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used.
DNase-free water Quality Biologicals 351-029-131 Water from any supplier may be used.
Hoechst 33258 Sigma 94403 Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact.
Parafilm M multiple 807 Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers.
Fluorescent microscope with digital camera  --  -- Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used.
Vectashield antifade media Vector Labs H-1000 Antifade media from any supplier may be used.
glass coverslips, No.1 thickness Brain Research Labs 2222-1 Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections.
Nail polish Ted Pella 114-8 Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
  2. Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
  3. Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
  4. Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
  5. Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83 (2008).
  6. Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
  7. Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
  8. Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
  9. Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
  10. Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329 (2014).
  11. Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
  12. Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
  13. Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
  14. Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
  15. Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
  16. Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
  17. Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
  18. Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
  19. Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
  20. Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
  21. Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
  22. Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
  23. Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
  24. Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
  25. Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
  26. National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
  27. Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
  28. Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
  29. Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
  30. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
  31. Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
  32. Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
  33. Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
  34. Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
  35. Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
  36. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
  37. Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
  38. Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
  39. Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
  40. Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
  41. Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
  42. Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
  43. Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
  44. Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).

Tags

علم وظائف الأعضاء، العدد 94، TUNEL، مضان، العضلات الهيكلية، الحمض النووي من التلف، تحليل الصور، الأنسجة، SMA، ومرض العصبون الحركي
كشف وتحليل الحمض النووي من التلف في العضلات الهيكلية ماوس<em&gt; في الموقع</em&gt; استخدام أسلوب TUNEL
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Fayzullina, S., Martin, L. J.… More

Fayzullina, S., Martin, L. J. Detection and Analysis of DNA Damage in Mouse Skeletal Muscle In Situ Using the TUNEL Method. J. Vis. Exp. (94), e52211, doi:10.3791/52211 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter