Introduction
Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) is het proces van het gebruik van de TdT enzym om dUTP tot 3 hechten 'einden van de dubbele en enkelstrengs DNA breekt 12,23. De TUNEL methode voor de detectie van apoptose en DNA schade werd voor het eerst 20 jaar geleden door Gavrieli et al. 1,12,24. Het is sindsdien geëvalueerd en geoptimaliseerd in verschillende weefselpreparaten 7,23,27,40. TUNEL is gebruikt om ischemie geïnduceerde celdood van neuronen 6,14,29 en 43,44 cardiomyocyten, excitotoxische neuronale celdood 30,31 bestuderen, en als biomarker in artritisbehandeling 39. Er is ook gebruikt als een prognostische factor en tumorcel marker in verschillende menselijke kankers 2,3,15,32,37,38,42.
Alternatieve methoden bestaan voor DNA schade en celdood detectie, maar ze hebben technische uitdagingen en restricties. Southern blotting kan worden gebruikt quantify DNA schade in zijn geheel weefsel lysaten 7,9-11, maar deze methode biedt geen cellulair niveau resolutie en is moeilijk te kwantificeren. De komeettest is een alternatief cel-gebaseerde methode die vereist extraheren bewaarde kernen van cellen 4,20,28,36. Hoewel de comet assay werkt goed op gekweekte geïsoleerde cellen, is het veel moeilijker om intacte kernen bereiden van skeletspierweefsel 8,21. Zoals met Southern blot, ofwel de comet assay niet celtype-specifieke informatie van een hele spierweefsel homogenaat verschaffen. Een ander alternatief voor de TUNEL methode immunohistochemie met antilichamen tegen enkelstrengs DNA 25,33,41 of tegen eiwitten die deelnemen DNA schade respons en celdood routes (bijvoorbeeld p53, H2AX en caspasen) 13,17,22,40. Dergelijke antilichaam gebaseerde methoden vereisen grondige karakterisatie van antilichamen en uitstekende antilichaamspecificiteit een hoge signaal-achtergrond verhouding oplevert. Zelfs wanneer specific antilichamen bestaan, kunnen zij denatureren van het doeleiwit door antigen retrieval procedure 34,35 vereisen. Zoals we hier bespreken, antigen retrieval in spierweefsel leidt tot onaanvaardbaar hoge autofluorescence. In tegenstelling tot de alternatieve methoden, TUNEL behaalt DNA-schade detectie met een hoge signaal en lage achtergrond, uitstekende specificiteit die getest kunnen worden met eenvoudige positieve en negatieve controles, goede weefselpenetratie dat antigen retrieval niet vereist, en cellulair niveau resolutie. Bovendien neemt de TUNEL methode ongeveer 4 uur in beslag, terwijl alternatieve overnacht incubatie vereisen meestal.
We bestuderen skeletspier celdood in een muismodel van spinale musculaire atrofie (SMA) 10 die is gegenereerd door Hsieh-Li en collega 16. Apoptotische cellen te kwantificeren in de spier, hebben wij een werkwijze weefselpreparaat, kleuring en kwantificering die robuust werkt in verschillende skele ontwikkeldTal spiergroepen op verschillende ontwikkelingsstoornissen tijdstippen bij muizen. We maken gebruik van een in de handel verkrijgbaar TUNEL-labeling kit en in de handel verkrijgbare software voor beeldanalyse. We hebben ook met succes gebruikt de TUNEL assay in combinatie met immunofluorescente kleuring in het ruggenmerg 10.
De hier beschreven methoden zijn nuttig voor onderzoekers die willen weefselpathologie mechanismen van ziekten, mechanismen van veroudering en ontwikkelingsstoornissen (pre- en postnatale) celdood in de skeletspier. De TUNEL-techniek is bijzonder nuttig voor studies van DNA schade en herstel en celdood in modelsystemen waar slechts een subset van cellen beïnvloed en celniveau resolutie noodzakelijk.
Deze video beschrijft dissectie, weefsel verwerking, snijden, en fluorescentie gebaseerde TUNEL etikettering van de muis skeletspieren. Het beschrijft ook een werkwijze voor semi-automatische TUNEL signaal kwantificering.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OPMERKING: Alle dierlijke procedures beschreven in dit protocol werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de handleiding voor de zorg en het gebruik van proefdieren van de National Institutes of Health 26 uitgevoerd. Het protocol (MO13M391) werd goedgekeurd door de Johns Hopkins University Animal Care en gebruik Comite.
1. Neonatale Mouse Sacrifice, Dissection en Fixatie
- Offeren een neonatale muis door CO 2 inademing.
- Onmiddellijk afgesneden van de achterbeen boven de knie. Tot ongeveer postnatale dag 7, de botten zijn zacht genoeg om door te snijden met een groot laboratorium schaar of een scherp mes en om vervolgens deel aan een cryostaat.
- Plaats het achterbeen in 10 ml ijskoude 4% paraformaldehyde in fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS) in een 15 ml buis.
- Onderdompeling fix het achterbeen in paraformaldehyde voor 4-24 uur bij 4 ° C. Embryonaal weefsel vereist slechts een aantal uurs van fixatie.
- Vermijd fixatie langer dan 24 uur, omdat dit TUNEL assay efficiëntie kan verminderen.
- Cryoprotect het achterbeen door onderdompeling in sucrose-oplossing.
- Paraformaldehyde tot 10% sucrose in PBS wijzigen op dezelfde 15 ml buis, incubeer overnacht bij 4 ° C.
- Wijziging 30% sucrose in PBS, incubeer overnacht bij 4 ° C of totdat de achterpoot zinkt naar de bodem van de buis. Weefsel kan worden achtergelaten in 30% sucrose gedurende een langere periode, mits de sucrose steriel gefiltreerd is.
2. Tissue Embedding
- Vul een gelabelde inbedding mal helft met inbeddingsmedium.
- Plaats achterbeen bovenop het inbeddingmedium met de snijkant zo dicht mogelijk bij één wand van de matrijs. Markeer de oriëntatie van het achterbeen aan de buitenzijde van de matrijs.
- Meerdere achterpoten insluiten en snijd in hetzelfde blok. Het is echter belangrijk dat alle hindlimbs in het blok evenwijdig aan elkaar secties krijgen op overeenkomen niveaus langs de as van de ledemaat.
- Bedek achterpoten met inbeddingsmedium. Als achterpoten verschuiven tijdens het gieten het medium, heroriënteren ze met stompe getipt tang of een tandenstoker.
- Laat inbeddingmedium de weefsels infiltreren bij kamertemperatuur gedurende ten minste 15 min.
- Plaats mallen direct op droog ijs of in isopentaan op droog ijs te bevriezen inbedmedium. Zorg ervoor dat de mallen niveau te allen tijde te houden en het verschuiven van de ingebed weefsel te voorkomen.
- Bewaar bevroren schimmels bij -80 ° C tot klaar te snijden, tot enkele maanden.
3. cryosectioning Embedded Ledematen
- Stel cryostaatkamer temperatuur tot -20 ° C, object temperatuur tot -18 ° C; passen temperatuur object af als dat nodig is.
- Evenwicht het weefsel blok in de cryostaatkamer gedurende ten minste 30 min. Juiste blok temperature is van cruciaal belang voor de afdeling kwaliteit.
- Snijd dwarsdoorsneden bij een dikte van 10 urn of minder. Dikkere secties zullen niet volledig worden gepenetreerd door TUNEL reagentia. Gebruik de anti-roll plaat, messen, en bladhoek (typisch 5 °) aanbevolen voor de cryostaat.
- Verzamel secties op gelatine of vectabond beklede glasplaatjes bij kamertemperatuur. Direct te plaatsen in een dia doos op droog ijs. Bewaar de doos dia in een aparte bak met droog ijs geplaatst in de buurt van de cryostaat binnen handbereik.
- Snijd dwars seriecoupes door de lange as van de ledematen, sla 100-200 urn. Vang minimaal 3 aangrenzende secties bij elke seriële niveau.
4. TUNEL Assay op achterbeen Secties Met behulp van een los verkrijgbare kit (alle stappen bij kamertemperatuur tenzij anders vermeld)
- Ontdooien dia's met secties tot kamertemperatuur en droog 's nachts of in het weekend.
- Rehydrateren secties door immersing objectglaasjes in PBS gedurende 2 x 10 min in een Coplin jar. Droog met een lab te vegen, het verwijderen van zoveel vloeistof rond de sectie mogelijk.
- Permeabilize secties
- Gebruik een niet-proteolytisch, saponine gebaseerde commerciële reagens of 0,5% Tween 20 en 0,05% Triton X100 in PBS.
- Plaats de dia in een vochtige kamer. Een eenvoudige vochtige kamer een lege pipet tip doos met een strakke deksel, met net genoeg water toegevoegd aan de bodem van de doos bedekken.
- Pipet genoeg reagens op de dia ter dekking van de sectie (50 ul is voldoende voor neonatale muis ledematen). Niet direct pipet op de afdeling, zoals herhaalde agitatie de sectie kan veroorzaken op te heffen van de dia.
- Met behulp van stompe getipt tang, plaats een kleine rechthoek van parafilm op de top van de sectie te spreiden de druppel reagens en volledig bedekken de sectie. Eventuele luchtbellen te vormen onder de parafilm, til het uit, droog, en opnieuw toe te passen.
- Incubeer dia's met permeabilisatie reagens gedurende 1 uur in een overdekte vochtige kamer. Indien delen beginnen opstijgen van de glijbaan kan permeabilisatie worden teruggebracht tot 30 minuten.
- Was de dia's in PBS in een Coplin pot 2 x 5 min. De parafilm rechthoeken zullen zweven naar de top en kan dan worden verwijderd en weggegooid.
- Met behulp van een lab doekje, droog zoveel vloeistof rond de secties mogelijk.
- TdT-gemedieerde DNA-etikettering break
- Volg de instructies van de kit om 1x TdT- etikettering buffer, pipet genoeg etikettering buffer te maken op de dia om weefselcoupe dekken (50 ul is voldoende voor neonatale muis ledematen). Incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min. Als alternatief, dompel de dia in TdT etikettering buffer in een Coplin pot.
- Volg kit instructies om TdT- etikettering mix te maken. De kit bevat kobalt, magnesium en mangaan kationen; het mangaankation werkt goed op een verscheidenheid van weefsels, zoals skeletspier, zenuwstelsel tissUE, lever, huid en botten.
- Voor een positieve controle, voeg DNase (gemerkt 'nuclease "in de kit) aan de TdT labeling mix. Alternatief vooraf reinigen positieve controle gedeelte met DNase in nuclease buffer gedurende 1 uur bij 37 ° C, volgens de kit instructies. Houd DNase oplossing en DNase behandeld secties uit de buurt van andere experimentele secties om kruisbesmetting te voorkomen.
- Voor een negatieve controle, weglaten TdT enzym uit de etikettering mix.
- Gebruik een lab doekje om zoveel TdT- etikettering buffer van de glijbaan mogelijk te verwijderen. Pipetteer TdT labeling mix op de schuif (50 ul per groep), bedekken met een nieuwe rechthoek parafilm en incubeer in de vochtige kamer bij 37 ° C gedurende 1 uur.
- Volg de instructies van de kit om 1x stop buffer te maken. Gebruik een lab doekje om TdT labeling mix van de glijbaan verwijderen en voeg 200-300 pi stopbuffer de weefselsectie bedekken en incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min. Al ternatively, dompel de dia in stop buffer in een Coplin pot.
- Was de dia 2 x 2 min in PBS. Gebruik een lab doekje om zo veel PBS te verwijderen uit de dia mogelijk.
- Fluorescentielabelling
- Volg kit instructies om fluoresceïne etikettering oplossing voor te bereiden om dNTPs etiketteren DNA-breuken. Pipet oplossing op de glijbaan (50 ul per sectie), dek af met een nieuwe rechthoek van parafilm en incubeer in de vochtige kamer gedurende 20 minuten.
- Wash glijbaan voor 2 min in PBS in een Coplin pot. Gebruik een lab doekje om zoveel PBS verwijderen mogelijk van de glijbaan.
- Verdun Hoechst 33258 nucleaire vlek 1 ug / ml in PBS en pipet op de slede (100-200 gl voldoende punt dekken). Incubeer in de vochtige kamer gedurende 5 min.
- Was 3x gedurende 5 minuten in PBS.
- Dekglaasje met antifade fluorescentie montage media en verzegelen randen met nagellak.
- Acquire beelden met behulp van een conventionele fluorescentiemicroscoop met DAPI, FITC en Texas Red filters (of gelijkwaardig). Gebruik een hogere doelstelling vergroting (20X of 40X) om te controleren of de etikettering was succesvol en kernen (intact of gefragmenteerd) werden bestempeld. Een 10X objectief is voldoende voor kwantificering van TUNEL-positieve puncta.
- Verzamel beelden van de Hoechst kleuring, TUNEL kleuring, en autofluorescente signaal als drie afzonderlijke valse kleuren kanalen gecombineerd in één afbeelding. Als de TUNEL fluorofoor label is groen, afbeelding autofluorescente signaal in de rode filter, en vise versa.
- Houd alle beeldvormende instellingen gelijkwaardig tussen dia's voor volgende drempeling en kwantificering. Voor elk filter, preset en blootstelling opnemen tijden, winst, en binning (geen binning is het beste); denk automatische belichting of gain-instellingen niet gebruiken.
- Gebruik trial-and-error om de blootstelling en de gain-instellingen die het beste het bereik van inten zal vangen vindensiteiten in alle gekleurde coupes. Zorg ervoor dat er geen verzadigde pixels in de verkregen beelden, omdat dit vooroordeel kwantificatie.
- Neem foto's van het hele spiergroep van belang. Dit kan meerdere afbeeldingen moeten worden "gestikt" samen.
6. beeldanalyse
- Gebruik in de handel verkrijgbaar beeldanalyse programma om digitale beelden van TUNEL kleuring te analyseren. Analyse met behulp van commerciële software is hier te zien. Als alternatief kan de gratis software ImageJ van NIH worden gebruikt om TUNEL kleuring te analyseren.
- Stain een deel grenst aan het-TUNEL gekleurd gedeelte met hematoxyline en eosine (H & E) en neem een digitale afbeelding op ware gedeelte met een conventionele helderveld microscoop. Met dit beeld H & E in combinatie met een anatomische atlas 5,18,19 om de anatomische structuren te kwantificeren sporen.
- Met de TUNEL kanaal uitgeschakeld, handmatig de omtrek van het gebied op te sporen moeten worden gekwantificeerd, met behulpHoechst en autofluorescence kanalen voor begeleiding. Zetten de getraceerd gebied in een masker (een set van geselecteerde pixelcoördinaten te analyseren).
- Zet de TUNEL kanaal. Met behulp van de intensiteit drempelen functie in de beeldanalyse programma, zet de lagere drempel om alle autofluorescence signaal uit te sluiten.
- Pas dezelfde drempel instelling voor alle beelden in de studie set. Omzetten thresholded selecties in maskers.
- Voor elk beeld, combineer de spier gebied masker en de TUNEL masker. De nieuwe combinatie masker zal TUNEL signaal binnen de getraceerd spieren enige gebied te vertegenwoordigen.
- Voeren masker kwantificatie van de combinatie masker om aantal objecten te bepalen en object oppervlakte van de TUNEL signaal binnen de getraceerd spier gebied. Voer deze met behulp van de Particle Analyzer functie in ImageJ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Met succesvolle kleuring, moet TUNEL-positief signaal helder genoeg om te isoleren van autofluorescentie door het instellen van de intensiteit drempels zijn. TUNEL-positieve objecten bij een lage vergroting kan verschijnen als lichte onregelmatige fragmenten in de skeletspier (Figuur 1A). Bij hogere vergroting, sommige TUNEL-positieve objecten met klassieke apoptotische morfologie worden waargenomen als het type celdood betrokken is apoptose (Figuur 1B). De positieve controle (DNase toegevoegd) moet overvloedige TUNEL-positief signaal, gelijkmatig verdeeld over alle weefsels in de sectie (figuur 1C) vertonen. De negatieve controle (TdT enzym weggelaten reactie) moet een lage intensiteit achtergrond en autofluorescente signaal alleen (figuur 1D) opleveren. Skin geeft een interne positieve controle geheel pootdelen, aangezien dit weefsel heeft een hoog normale apoptose (Figuur 1A).
Rode bloedcellen, bot en endotheelcellen kunnen aanzienlijke autofluorescente signaal (figuur 2) dragen. Het is raadzaam beeld elke sectie in een apart kanaal zonder fluorescentielabelling dat autofluorescentie zorgen niet verward TUNEL positieve signalering. True TUNEL-positieve signaal moet veel hogere intensiteit dan autofluorescentie hebben, zodat het door het intensiteitsdrempels (Figuur 2A, middelste rij) kunnen worden geïsoleerd. Alternatief kan de autofluorescerende kanaal digitaal worden afgetrokken van de TUNEL kanaal naar TUNEL-positieve signaal (figuur 2A, onderste rij) verkregen.
De TUNEL labeling hier beschreven methode werd gebruikt om skeletspier celdood te kwantificeren in een muismodel van SMA 10. TUNEL labeling toont een toename van het aantal apoptotische profielen beenspieren van 5 dagen oud SMA muizen, vergeleken met littermate controles (Figuur 3A). De toename van apoptosekwantificeerbaar door de werkwijze hierboven beschreven, wijst statistisch significante verschillen in meerdere spiergroepen (figuur 3B).
Figuur 1: Vertegenwoordiger TUNEL etikettering van de muis achterbeen spieren. (A) TUNEL-gemerkte dwarsdoorsnede van muizen achterbeen tonen tibialis anterior spier, tibia en huid. TA - tibialis anterior, Fdl - flexor digitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Groen - TUNEL, blauw - kernen, rood - autofluorescente signaal. Gestippelde lijnen bakenen spier gebieden voor kwantificatie. Huid aangrenzende achterbeen spieren biedt een interne positieve controle voor TUNEL etikettering. Schaal bar = 200 micrometer. (B) Vertegenwoordiger sterk vergrotende beelden identificeren TUNEL-positieve structuren (groen) in embryonale dag 13 muis skeletspieren als apoptotische kernen. Schaalbalk = 10 um. A en B modificatie van Fayzullina en Martin 2014 10. (C) Dwarsdoorsnede van muizen achterbeen TUNEL-gemerkte na DNase behandeling om te dienen als een positieve controle. De meeste kernen hebben een lichte TUNEL etikettering. Schaalbalk = 50 um. (D) dwarsdoorsnede van dezelfde muizen achterbeen zoals in C (twee aangrenzende sectie C) TUNEL-gelabeld met TdT-enzym weggelaten om te dienen als een negatieve controle. Er is geen heldere TUNEL-positief signaal; het enige groene signaal autofluorescence zoals gedetecteerd door colokalisatie met signaal in het rode kanaal. Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
2 "fo: content-width =" 6in "src =" / files / ftp_upload / 52211 / 52211fig2highres.jpg "width =" 600 "/>
Figuur 2: Tissue autofluorescence moet worden beschouwd en uitgesloten van kwantificatie bij het analyseren van TUNEL etikettering. (A) Mouse achterbeen dwarsprofiel met TUNEL etikettering en autofluorescence: hetzelfde beeld met aangepaste drempels (middelste rij) originele foto (bovenste rij), en hetzelfde beeld met autofluorescence (rood) kanaal afgetrokken (onderste rij). Thresholding elimineert de meeste rode bloedcellen en endotheelcellen autofluorescentie maar niet de kleuring artefact (pijlpunt, middelste rij). Kanaal aftrekken elimineert ook de kleuring artefact (pijlpunt, onderste rij). Groen - TUNEL, rood - autofluorescence, blauw - kernen. Schaal bar = 100 micrometer. Afbeelding hogere vergroting van rode autofluorescence paneel grijze rechthoek bakent gebied vergroot in de B. (B) in A. Rode bloedcellen en sommige endotheelcellen (pijlen) en een tissue vlekken artefact (pijlpunt) autofluoresce in zowel rode en groene fluorescentie filters. Schaal bar = 50 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Figuur 3: TUNEL etikettering toont celdood in de skeletspieren van neonatale SMA muizen Lagere achterbeen spieren van SMA muizen op postnatale dag 5 werden bestempeld door de TUNEL methode (A) TUNEL etikettering toont meerdere apoptotische profielen in meerdere spiergroepen in SMA muis.. spier (rechts) vergeleken met controle nestgenoten (links). Groen - TUNEL, blauw - Hoechst (kernen), rood - autofluorescentie. Gestippelde lijnen bakenen de spier gebieden gekwantificeerd. TA - tibialis anterior, Fdl - flexor digitorum longus, Edl - extensor digitorum longus. Schaalbalken = 200 micrometer. (B) TUNEL etikettering werd gekwantificeerd als totale pixel gebied van TUNEL signaal genormaliseerd naar totale pixel gebied van spier. Gemiddelden ± standaardfouten worden getoond, n = 4-5 muizen. Statistische significantie tussen SMA en controle voor elke spiergroep (eenzijdige t-test): * p <0,05, ** p <0.01, *** p <0,001. Dit cijfer is gewijzigd van Fayzullina en Martin 2014 10. Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Een methode voor het opsporen en kwantitatief analyseren van DNA-schade die apoptose in muis skeletspieren wordt beschreven. De procedure omvat weefsel oogsten, TUNEL kleuring, digitaal beeld acquisitie, en beeldanalyse. Gemeenschappelijke histologische leveringen en gereedschappen nodig, en een bijzondere economische TUNEL kit noodzakelijk. De essentiële grote apparatuur items die nodig zijn een cryostaat, epifluorescerende microscoop met digitaal beeld vermogen, en een computer systeem voor beeldanalyse.
De onderzoeker moet zich bewust zijn van de mogelijke valkuilen. Weefsel autofluorescentie is een grote zorg in fluorescentie beeldvorming. In unperfused dieren, de resterende rode bloedcellen zal vrij hoog autofluorescente signaal te dragen. Endotheliale cellen kunnen ook significant worden Autofluorescente. Daarom is het belangrijk dat autofluorescentie bevestigen niet verward TUNEL-positieve signaal. Deze beoordeling is eenvoudig te realiseren door het nemen van een beeld in een kanaal zonder fluorophore, te worden gebruikt voor vergelijking en eventuele aftrekken van de TUNEL-positieve kanaal. Op deze manier wordt de fluorescentie gebaseerde TUNEL methode superieur aan colorimetrische helderveld microscopie methoden die een interne controle voor achtergrondkleuring bieden wel.
Fixatie van het weefsel zal aanzienlijke gevolgen voor het succes van TUNEL etikettering hebben. Het beste is om fixatie te minimaliseren in paraformaldehyde, 24 uur niet te overschrijden. Embryonale en neonatale weefsel fixatietijden significant korter dan 24 uur vereist.
Wanneer TUNEL labeling succesvol is, moet TUNEL-positieve signaal veel hoger dan achtergrond autofluorescentie, zodat het signaal gemakkelijk kan worden geïsoleerd door intensiteit drempelwaarde gating met beeldanalyse software. Antigen retrieval met behulp van de standaard protocol van de verwarming in citraatbuffer 27,35 kunnen enigszins verbeteren laag TUNEL signaal als opwarmtijd wordt tot een minimum beperkt (5 min), maar deze voorbehandeling tienDS TUNEL signaal te verlagen als verwarming verlengd langere periode (bijvoorbeeld 20 min bij 95 ° C). Antigeenterugtrekking achtergrondinformatie autofluorescentie en valse positieven te vergroten en zo kan elke winst in signaal-ruisverhouding van verhoogde TUNEL signaal teniet.
De TUNEL signaalmetingen worden genormaliseerd hetzij het totale spiergebied gekwantificeerd of het aantal kernen per oppervlakte gekwantificeerd. Omdat TUNEL meet apoptotische kernen, zou de ideale normalisering zijn totaal kernen. Zelfs relatief dunne (10 urn) spier secties, de spiervezels en kernen zijn zo talrijk en verpakt zo nauw, dat het onmogelijk is om automatisch tellen Hoechst-gekleurde kernen van drempelwaarden en deeltjesscheiding algoritmen. Handmatig tellen is ook zeer arbeidsintensief en onnauwkeurig. De haalbaar alternatief normaliseren totale spiergebied.
De TUNEL test, met de passende weefselverwerkingtechnieken en positieve en negatieve controles, is een relatief snelle, reproduceerbare, kwantitatieve werkwijze voor het detecteren van DNA schade en celdood in weefsel. Het kan worden gebruikt om apoptose te bevestigen als een pathologische mechanisme, de te behandelen celtypen te identificeren, en om de efficiëntie van therapeutische behandelingen te evalueren. Deze procedure zal van waarde zijn voor onderzoekers op het gebied van de skeletspieren ziekten en letsel, met inbegrip van SMA, ALS, spierdystrofie, toxine-geïnduceerde myopathie zijn en inspanningsfysiologie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline | Electron Microscopy Sciences | 19202 | For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used. |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for cryosectioning. |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used. |
| Glass slides, 25 x 75 x 1 mm | Fisher | 12-552-3 | Slides from any supplier may be used. |
| Gelatin | Sigma | G-9391 | Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased. |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) | Sigma | 243361 | Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum. |
| Vectabond tissue adhesion reagent | Vector Labs | SP-1800 | Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead. |
| Tween20 | Sigma | P9416 | A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used. |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used. |
| TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit | Trevigen | 4812-30-K | Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling. |
| DNase/nuclease | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
| DNase/nuclease buffer | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
| 10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Amresco | 780 | Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used. |
| DNase-free water | Quality Biologicals | 351-029-131 | Water from any supplier may be used. |
| Hoechst 33258 | Sigma | 94403 | Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact. |
| Parafilm M | multiple | 807 | Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers. |
| Fluorescent microscope with digital camera | -- | -- | Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used. |
| Vectashield antifade media | Vector Labs | H-1000 | Antifade media from any supplier may be used. |
| glass coverslips, No.1 thickness | Brain Research Labs | 2222-1 | Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections. |
| Nail polish | Ted Pella | 114-8 | Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging. |
References
- Ansari, B., Coates, P. J., Greenstein, B. D., Hall, P. A. In situ end-labelling detects DNA strand breaks in apoptosis and other physiological and pathological states. 170 (1), 1-8 (1993).
- Ben-Izhak, O., Laster, Z., Akrish, S., Cohen, G., Nagler, R. M. TUNEL as a tumor marker of tongue cancer. Anticancer Res. 28 (5B), 2981-2986 (2008).
- Colecchia, M., et al. Detection of apoptosis by the TUNEL technique in clinically localised prostatic cancer before and after combined endocrine therapy. 50 (5), 384-388 (1997).
- Collins, A. R. The comet assay for DNA damage and repair: principles, applications, and limitations. Mol. Biotechnol. 26 (3), 249-261 (2004).
- Delaurier, A., et al. The Mouse Limb Anatomy Atlas: an interactive 3D tool for studying embryonic limb patterning. 8, 83 (2008).
- Torres, C., Munell, F., Ferrer, I., Reventos, J., Macaya, A. Identification of necrotic cell death by the TUNEL assay in the hypoxic-ischemic neonatal rat brain. Neurosci. Lett. 230 (1), 1-4 (1997).
- Didenko, V. V. In Situ Detection of DNA Damage : Methods and Protocols. , Humana Press. 978-970 (2002).
- Edelman, J. C., Edelman, P. M., Kniggee, K. M., Schwartz, I. L. Isolation of skeletal muscle nuclei. J. Cell Biol. 27 (2), 365-378 (1965).
- Facchinetti, A., Tessarollo, L., Mazzocchi, M., Kingston, R., Collavo, D., Biasi, G. An improved method for the detection of DNA fragmentation. J. Immunol. Methods. 136 (1), 125-131 (1991).
- Fayzullina, S., Martin, L. J. Skeletal muscle DNA damage precedes spinal motor neuron DNA damage in a mouse model of spinal muscular atrophy (SMA). PLoS.One. 9 (3), e93329 (2014).
- Ferrer, I., et al. Naturally occurring cell death in the developing cerebral cortex of the rat. Evidence of apoptosis-associated internucleosomal DNA fragmentation. Neurosci. Lett. 182 (1), 77-79 (1994).
- Gavrieli, Y., Sherman, Y., Ben-Sasson, S. A. Identification of programmed cell death in situ via specific labeling of nuclear DNA fragmentation. J. Cell Biol. 119 (3), 493-501 (1992).
- Gown, A. M., Willingham, M. C. Improved detection of apoptotic cells in archival paraffin sections: immunohistochemistry using antibodies to cleaved caspase 3. J. Histochem. Cytochem. 50 (4), 449-454 (2002).
- Hara, A., et al. Neuronal apoptosis studied by a sequential TUNEL technique: a method for tract-tracing. Brain Res. Brain Res. Protoc. 4 (2), 140-146 (1999).
- Harn, H. J., et al. Apoptosis occurs more frequently in intraductal carcinoma than in infiltrating duct carcinoma of human breast cancer and correlates with altered p53 expression: detected by terminal-deoxynucleotidyl-transferase-mediated dUTP-FITC nick end labelling (TUNEL). Histopathology. 31 (6), 534-539 (1997).
- Hsieh-Li, H. M., et al. A mouse model for spinal muscular atrophy. Nat. Genet. 24 (1), 66-70 (2000).
- Huerta, S., Goulet, E. J., Huerta-Yepez, S., Livingston, E. H. Screening and detection of apoptosis. J. Surg. Res. 139 (1), 143-156 (2007).
- Iwaki, T., Yamashita, H., Hayakawa, T. A color atlas of sectional anatomy of the mouse. 1, 1st edn, Braintree Scientific. Japan. (2001).
- Kaufman, M. H. The atlas of mouse development. , 1st edn, Academic Press. London. (1992).
- Koppen, G., Angelis, K. J. Repair of X-ray induced DNA damage measured by the comet assay in roots of Vicia faba. Environ. Mol. Mutagen. 32 (2), 281-285 (1998).
- Kuehl, L. Isolation of skeletal muscle nuclei. Methods Cell Biol. 15, 79-88 (1977).
- Kuo, L. J., Yang, L. X. Gamma-H2AX - a novel biomarker for DNA double-strand breaks. In Vivo. 22 (3), 305-309 (2008).
- Labat-Moleur, F., et al. TUNEL apoptotic cell detection in tissue sections: critical evaluation and improvement. J. Histochem. Cytochem. 46 (3), 327-334 (1998).
- Modak, S. P., Bollum, F. J. Detection and measurement of single-strand breaks in nuclear DNA in fixed lens sections. Exp. Cell Res. 75 (2), 307-313 (1972).
- Naruse, I., Keino, H., Kawarada, Y. Antibody against single-stranded DNA detects both programmed cell death and drug-induced apoptosis. Histochemistry. 101 (1), 73-78 (1994).
- National Research Council (US) Committee for the Update of the Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. , 8th edn, National Research Council. Washington, D.C.. (2011).
- Negoescu, A., et al. In situ apoptotic cell labeling by the TUNEL method: improvement and evaluation on cell preparations). J. Histochem. Cytochem. 44 (9), 959-968 (1996).
- Ostling, O., Johanson, K. J. Microelectrophoretic study of radiation-induced DNA damages in individual mammalian cells. Biochem. Biophys. Res. Commun. 123 (1), 291-298 (1984).
- Phanithi, P. B., Yoshida, Y., Santana, A., Su, M., Kawamura, S., Yasui, N. Mild hypothermia mitigates post-ischemic neuronal death following focal cerebral ischemia in rat brain: immunohistochemical study of Fas, caspase-3 and TUNEL. Neuropathology. 20 (4), 273-282 (2000).
- Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Excitotoxic neuronal death in the immature brain is an apoptosis-necrosis morphological continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 70-87 (1997).
- Portera-Cailliau, C., Price, D. L., Martin, L. J. Non-NMDA and NMDA receptor-mediated excitotoxic neuronal deaths in adult brain are morphologically distinct: further evidence for an apoptosis-necrosis continuum. J. Comp Neurol. 378 (1), 88-104 (1997).
- Ravi, D., Ramadas, K., Mathew, B. S., Nalinakumari, K. R., Nair, M. K., Pillai, M. R. De novo programmed cell death in oral cancer. Histopathology. 34 (3), 241-249 (1999).
- Sakaki, T., Kohmura, E., Kishiguchi, T., Yuguchi, T., Yamashita, T., Hayakawa, T. Loss and apoptosis of smooth muscle cells in intracranial aneurysms. Studies with in situ DNA end labeling and antibody against single-stranded DNA. Acta Neurochir.(Wien). 139 (5), 469-474 (1997).
- Shi, S. R., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry: past, present, and future. J. Histochem. Cytochem. 45 (3), 327-343 (1997).
- Shi, S. R., Imam, S. A., Young, L., Cote, R. J., Taylor, C. R. Antigen retrieval immunohistochemistry under the influence of pH using monoclonal antibodies. J. Histochem. Cytochem. 43 (2), 193-201 (1995).
- Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Exp. Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).
- Sirvent, J. J., Aguilar, M. C., Olona, M., Pelegri, A., Blazquez, S., Gutierrez, C. Prognostic value of apoptosis in breast cancer pT1-pT2). A TUNEL, p53, bcl-2, bag-1 and Bax immunohistochemical study. Histol.Histopathol. 19 (3), 759-770 (2004).
- Skyrlas, A., Hantschke, M., Passa, V., Gaitanis, G., Malamou-Mitsi, V., Bassukas, I. D. Expression of apoptosis-inducing factor (AIF) in keratoacanthomas and squamous cell carcinomas of the skin. Exp. Dermatol. 20 (8), 674-676 (2011).
- Smith, M. D., Weedon, H., Papangelis, V., Walker, J., Roberts-Thomson, P. J., Ahern, M. J. Apoptosis in the rheumatoid arthritis synovial membrane: modulation by disease-modifying anti-rheumatic drug treatment. Rheumatology.(Oxford). 49 (5), 862-875 (2010).
- Stadelmann, C., Lassmann, H. Detection of apoptosis in tissue sections). Cell Tissue Res. 301 (1), 19-31 (2000).
- Schans, G. P., van Loon, A. A., Groenendijk, R. H., Baan, R. A. Detection of DNA damage in cells exposed to ionizing radiation by use of anti-single-stranded DNA monoclonal antibody. Int. J. Radiat. Biol. 55 (5), 747-760 (1989).
- Watanabe, I., et al. Detection of apoptotic cells in human colorectal cancer by two different in situ methods: antibody against single-stranded DNA and terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP-biotin nick end-labeling (TUNEL) methods. Jpn. J. Cancer Res. 90 (2), 188-193 (1999).
- Watanabe, T., et al. Apoptosis signal-regulating kinase 1 is involved not only in apoptosis but also in non-apoptotic cardiomyocyte death. Biochem. Biophys. Res. Commun. 333 (2), 562-567 (2005).
- Yaoita, H., Ogawa, K., Maehara, K., Maruyama, Y. Attenuation of ischemia/reperfusion injury in rats by a caspase inhibitor. Circulation. 97 (3), 276-281 (1998).
