Introduction
Désoxynucléotidyl transférase (TdT) dUTP nick Terminal étiquetage final (TUNEL) est le processus d'utilisation de l'enzyme TdT pour fixer dUTP à 3 'extrémités de double et l'ADN simple brin casse 12,23. La méthode TUNEL pour la détection de l'apoptose et dommages à l'ADN a été signalée il ya plus de 20 ans par Gavrieli et al. 1,12,24. Depuis, il a été évalué et optimisé dans les différentes préparations de tissu 7,23,27,40. TUNEL a été utilisée pour étudier la mort cellulaire induite par l'ischémie des neurones et des cardiomyocytes 43,44 6,14,29, excitotoxique mort des cellules neuronales 30,31, et en tant que biomarqueur pour le traitement de l'arthrite 39. Il a également été utilisé en tant que facteur de pronostic et le marqueur de cellules tumorales dans divers cancers humains 2,3,15,32,37,38,42.
Des méthodes alternatives existent pour dommages à l'ADN et la détection de la mort cellulaire, mais ils ont des défis techniques et mises en garde. Southern blot peut être utilisée pour QUANTIFdommages à l'ADN dans les lysats y tissus entiers 7,9-11, mais cette méthode ne fournit pas la résolution au niveau cellulaire et est difficile à quantifier. Le dosage comète est une méthode à base de cellules de remplacement qui nécessite l'extraction des noyaux de cellules conservées 4,20,28,36. Bien que le test des comètes fonctionne bien sur des cellules isolées en culture, il est beaucoup plus difficile de préparer des noyaux intacts à partir de tissu musculaire squelettique 8,21. Comme Southern blot, le dosage comète ne fournit pas d'informations de type cellule-spécifique de tout un homogénat du tissu musculaire. Une autre alternative à la méthode TUNEL est immunohistochimie utilisant des anticorps contre l'ADN simple brin 25,33,41 ou contre des protéines qui participent dans les voies dommages à l'ADN d'intervention et de mort cellulaire (par exemple p53, H2AX et caspases) 13,17,22,40. De telles méthodes à base d'anticorps nécessite la caractérisation d'anticorps complète et une excellente spécificité de l'anticorps pour donner un rapport signal à bruit de fond. Même lorsque specific anticorps existent, ils peuvent nécessiter une dénaturation de la protéine cible par des procédures de récupération de l'antigène 34,35. Comme nous le verrons ici, la récupération d'antigène dans les résultats de tissu musculaire dans inacceptablement élevé autofluorescence. Contrairement aux autres méthodes, TUNEL atteint dommages détection de l'ADN avec un signal élevé et faible bruit de fond, une excellente spécificité qui peut être testée avec des contrôles simples positifs et négatifs, une bonne pénétration de tissu qui ne nécessitent pas de récupération d'antigène, et la résolution de niveau cellulaire. En outre, la méthode TUNEL faut environ quatre heures pour terminer, alors que les méthodes alternatives nécessitent généralement incubations nuit.
Nous étudions squelettique mort des cellules musculaires dans un modèle murin de l'atrophie musculaire spinale (SMA) 10 qui a été généré par Hsieh-Li et ses collègues 16. Pour quantifier les cellules apoptotiques dans le muscle, nous avons développé une méthode de préparation des tissus, la coloration, et la quantification robuste qui fonctionne à travers skele différenteTal groupes musculaires à différents points de temps de développement chez la souris. Nous utilisons un kit TUNEL d'étiquetage disponible dans le commerce et commercialisés logiciel d'analyse d'image. Nous avons également utilisé avec succès l'essai TUNEL en combinaison avec coloration immunofluorescente dans la 10 moelle épinière.
Les méthodes décrites ici sont utiles pour les enquêteurs qui veulent évaluer la pathologie des tissus, des mécanismes de la maladie, les mécanismes du vieillissement et de développement (pré et post-natal) la mort cellulaire dans le muscle squelettique. La technique TUNEL est particulièrement utile pour l'étude des lésions de l'ADN et la réparation et la mort cellulaire dans des systèmes modèles où seul un sous-ensemble de cellules est affecté résolution au niveau cellulaire et ne est nécessaire.
Cette vidéo décrit la dissection, le traitement des tissus, le sectionnement, et basé sur la fluorescence étiquetage TUNEL du muscle squelettique de souris. Il décrit également un procédé de semi-automatisé TUNEL signal de quantification.
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Protocol
NOTE: Toutes les procédures d'animaux décrits dans le présent protocole ont été réalisées en conformité avec les recommandations du Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire des National Institutes of Health 26. Le protocole (MO13M391) a été approuvé par le Comité Université soin et l'utilisation des animaux Johns Hopkins.
Sacrifice 1. néonatale souris, Dissection, et fixation
- Sacrifiez une souris néonatale par inhalation de CO 2.
- Immédiatement couper la patte arrière au-dessus du genou. Jusqu'au jour environ 7 postnatale, les os de la jambe sont assez doux pour couper à travers avec des ciseaux de laboratoire grandes ou lame tranchante et de l'article par la suite sur un cryostat.
- Placer la patte arrière dans 10 ml de glace froide 4% de paraformaldehyde dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un tube de 15 ml.
- Immersion fixer le membre postérieur au paraformaldéhyde pendant 4-24 heures à 4 ° C. Tissus embryonnaires nécessite seulement plusieurs heuress de la fixation.
- Évitez la fixation de plus de 24 heures, car cela peut réduire l'efficacité de l'essai TUNEL.
- Cryoprotect la patte arrière en l'immergeant dans une solution de saccharose.
- Changer paraformaldehyde à 10% de saccharose dans du STP dans le même tube de 15 ml, incuber une nuit à 4 ° C.
- Changement de saccharose à 30% dans du PBS, incuber une nuit à 4 ° C ou jusqu'à ce que les puits des membres postérieurs au fond du tube. Tissu peut être laissé dans 30% de saccharose pendant une période plus longue, à condition que le saccharose a été stérilisée par filtration.
2. Enrobage des tissus
- Remplir un moule intégration à mi-chemin marqué avec milieu d'inclusion.
- Passer membre postérieur sur le dessus du milieu d'inclusion, avec la face de coupe la plus proche possible à une paroi du moule. Marquer l'orientation de la patte arrière à l'extérieur du moule.
- Incluez plusieurs membres postérieurs et couper dans le même bloc. Cependant, il est important de se assurer que tous hindlimbs dans le bloc sont orientés parallèlement les uns aux autres pour obtenir des sections correspondant à des niveaux le long de l'axe du membre.
- Couvrir avec les membres postérieurs milieu d'inclusion. Si hindlimbs Maj enfoncée tout en versant le milieu, les réorienter avec une pince à bout mousse ou un cure-dent.
- Autoriser milieu d'inclusion pour infiltrer le tissu à la température ambiante pendant au moins 15 min.
- La place moules directement sur la glace sèche ou en isopentane sur glace sèche de geler milieu d'inclusion. Assurez-vous de maintenir le niveau des moules en tout temps et éviter tout déplacement du tissu intégré.
- Gardez moules congelées à -80 ° C jusqu'au moment de couper, pendant plusieurs mois.
3. Cryosectioning embarqué Limbs
- Régler la température de la chambre cryostat à -20 ° C, température de l'objet à -18 ° C; régler la température de l'objet de la manière nécessaire.
- Équilibrer le bloc de tissu à l'intérieur de la chambre de cryostat pendant au moins 30 min. Bloc correcte températurerature est crucial pour la section qualité.
- Couper des sections transversales d'une épaisseur de 10 um ou moins. Sections plus épaisses ne seront pas entièrement pénétré par les réactifs TUNEL. Utilisez la plaque anti-roulis, lames, et l'angle de la lame (typiquement 5 °) recommandé pour le cryostat.
- Recueillir sections SUR DES gelatin- ou lames de verre vectabond revêtus à la température ambiante. Placez immédiatement dans une boîte de diapositives sur glace sèche. Gardez la boîte de diapositive dans un récipient séparé avec de la glace sèche est placé près du cryostat à portée de bras.
- Couper sections transversale série à travers le grand axe de la branche, en sautant 100-200 um. Collectez au moins 3 sections adjacentes à chaque niveau de série.
4. TUNEL Essai sur les articles des membres postérieurs en utilisant un kit disponible dans le commerce (toutes les étapes à la température ambiante, sauf indication contraire)
- Décongeler diapositives avec des sections à température ambiante et sécher pendant la nuit ou le week-end.
- Réhydrater sections par immersing lames dans du PBS pour 2 x 10 min dans une jarre de Coplin. Sécher avec un laboratoire lingette, retirer autant de liquide autour de la section que possible.
- Sections perméabilisent
- Utilisez soit un non-protéolytique, basée saponine-réactif commercial ou 0,5% de Tween 20 et 0,05% de Triton X100 dans du PBS.
- Placer la lame dans une chambre humide. Une chambre d'humidité est simple: une boîte de pointe de la pipette vide avec un couvercle étanche, avec juste assez d'eau ajoutée pour couvrir le fond de la boîte.
- Pipette assez réactif sur la diapositive pour couvrir la section (50 pi est suffisante pour les membres de la souris néonatales). Ne pas pipette directement sur la section, que l'agitation répétée peut provoquer la section de soulever hors de la diapositive.
- En utilisant une pince à bout mousse, placez un petit rectangle de parafilm sur le dessus de la section d'étaler la goutte de réactif et couvrir complètement la section. Si des bulles se forment sous la parafilm, soulevez doucement le tout, sec, et réappliquer.
- Incuber les lames avec permeabiliréactif tion pendant 1 heure dans une chambre d'humidité couverte. Si sections commencent à décoller de la diapositive, le temps de perméabilisation peut être réduite à 30 min.
- Laver les lames dans du PBS dans une jarre de Coplin 2 x 5 min. Les rectangles de parafilm devraient flotter à la surface et peuvent ensuite être enlevé et jeté.
- Utiliser un laboratoire lingette, sécher autant de liquide autour des sections que possible.
- TdT médiation étiquetage de cassure de l'ADN
- Suivez les instructions du kit pour faire 1x tampon de l'étiquetage TdT, tampon d'étiquetage suffisamment de pipette sur la lame pour couvrir coupe de tissu (50 pi est suffisante pour les membres de la souris néonatales). Incuber dans la chambre humide pendant 5 min. Alternativement, immerger la lame dans du tampon de l'étiquetage TdT dans un bocal de Coplin.
- Suivez les instructions du kit pour faire TdT étiquetage mélange. Le kit comprend le cobalt, le magnésium, le manganèse et des cations; le cation manganèse fonctionne bien sur une variété de tissus, y compris le muscle squelettique, le système nerveux tissUES, le foie, la peau et les os.
- Pour un contrôle positif, ajouter DNase (étiqueté «nucléase" dans le kit) à l'étiquetage mélange TdT. Alternativement, pré-traiter une section de contrôle positif à la DNase dans un tampon de nucléase pendant 1 heure à 37 ° C, selon les instructions du kit. Conserver la solution de DNase et les articles de DNase traité loin des autres sections expérimentales pour prévenir la contamination croisée.
- Pour un contrôle négatif, omettre TdT enzyme de la composition de l'étiquetage.
- Utiliser un laboratoire pour effacer d'un tampon d'étiquetage autant TdT de la diapositive que possible. Pipette TdT étiquetage mélange sur la lame (50 pi par section), couvrir avec un nouveau rectangle de parafilm et incuber dans la chambre d'humidité à 37 ° C pendant 1 heure.
- Suivez les instructions du kit pour faire tampon d'arrêt 1x. Utilisez un laboratoire pour effacer d'TdT étiquetage mélange de la diapositive, et ajouter 200-300 tampon d'arrêt ul pour couvrir la section de tissu et incuber dans la chambre de l'humidité pendant 5 min. Al variante, immerger la lame dans du tampon d'arrêt dans une jarre de Coplin.
- Laver la glissière 2 x 2 min dans du PBS. Utiliser un laboratoire pour effacer d'autant PBS de la diapositive que possible.
- Le marquage fluorescent
- Suivez les instructions du kit pour préparer une solution d'étiquetage pour étiqueter fluorescéine dNTP au cassures de l'ADN. solution de pipette sur la lame (50 ul par section), couvrir avec un nouveau rectangle de parafilm, et incuber dans la chambre humide pendant 20 minutes.
- Laver la lame pendant 2 min dans du PBS dans une jarre de Coplin. Utiliser un laboratoire pour effacer d'autant PBS que possible de la diapositive.
- Diluer Hoechst 33258 colorant nucléaire à 1 pg / ml dans PBS et la pipette sur la lame (100-200 pi est suffisant pour couvrir la section). Incuber dans la chambre humide pendant 5 min.
- Laver 3x pendant 5 min dans du PBS.
- Lamelle avec Antifade milieux de montage de fluorescence et de sceller les bords avec du vernis à ongles.
- Acquérir des images en utilisant un microscope à fluorescence conventionnelle avec DAPI, FITC, et des filtres rouge Texas (ou équivalent). Utilisation d'un objectif de grossissement supérieur (20X ou 40X) pour vérifier que l'étiquette a été un succès et noyaux (intacts ou fragmentées) ont été marquées. Un objectif 10X est suffisante pour la quantification des points lacrymaux TUNEL positif.
- Recueillir des images de la coloration Hoechst, coloration TUNEL, et le signal de autofluorescente que trois canaux en fausses couleurs distinctes combinées en une seule image. Si l'étiquette de fluorophore TUNEL est vert, le signal image autofluorescente dans le filtre rouge, et vice versa.
- Conservez tous les paramètres d'imagerie équivalent entre les diapositives pour seuil et la quantification ultérieure. Pour chaque filtre, des heures prédéfinies et d'exposition d'enregistrement, le gain et binning (pas binning est le meilleur); ne pas utiliser les réglages d'exposition ou de gain automatique.
- Utilisez essais et erreurs pour trouver exposition et de gain paramètres qui répondra le mieux capturer la gamme de intensités dans toutes les lames colorées. Assurez-vous qu'il n'y a pas pixels saturés dans les images acquises, que cette volonté biais quantification.
- Prenez des photos du groupe d'intérêt musculaire entière. Cela peut nécessiter plusieurs images à "cousu" ensemble.
Analyse 6. Image
- Utilisez disponibles dans le commerce des programmes d'analyse d'images pour analyser les images numériques de coloration TUNEL. Analyse utilisant un logiciel commercial est montré ici. Alternativement, le ImageJ du logiciel libre du NIH peut être utilisé pour analyser la coloration TUNEL.
- Colorer une section adjacente à la section de TUNEL-colorées à l'hématoxyline et de l'éosine (H & E) et prendre une image numérique à pleine section avec un microscope à fond clair conventionnel. Utilisez cette image H & E en combinaison avec un atlas d'anatomie 5,18,19 pour tracer les structures anatomiques être quantifiés.
- Avec le canal TUNEL éteint, tracer manuellement le contour de la zone à quantifier, en utilisantHoechst et canaux de autofluorescence d'orientation. Convertir la zone tracée dans un masque (un ensemble de pixel sélectionné coordonne à analyser).
- Tournez sur le canal TUNEL. Utilisation de la fonction d'un seuil d'intensité dans le programme d'analyse d'image, réglez le seuil inférieur à exclure tous les signaux d'autofluorescence.
- Appliquer les mêmes paramètres de seuil pour toutes les images dans l'ensemble de l'étude. Convertir sélections seuillées en masques.
- Pour chaque image, mélanger le masque de zone du muscle et le masque TUNEL. Le nouveau masque de combinaison représentera le signal TUNEL dans la zone musculaire tracée seulement.
- Effectuer quantification masque sur le masque de combinaison pour déterminer le nombre d'objets et de la zone du signal TUNEL dans la zone musculaire tracé opposer. Effectuez cette aide de la fonction analyseur de particules dans ImageJ.
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Representative Results
Avec coloration réussie, signal de TUNEL positif doit être assez brillant pour isoler autofluorescence en fixant des seuils d'intensité. Objets TUNEL-positives à faible grossissement peuvent apparaître fragments irréguliers brillants dans le muscle squelettique (Figure 1A). Toutefois, à plus fort grossissement, certains objets TUNEL positif avec la morphologie apoptotique classique doivent être respectées, si le type de mort cellulaire impliquée est l'apoptose (figure 1B). Le contrôle positif (DNase ajouté) doit présenter signal de TUNEL positif abondante, distribuée uniformément dans tous les tissus dans la section (figure 1C). Le contrôle négatif (TdT enzymatique omis de réaction) devrait donner fond de faible intensité et le signal autofluorescente seulement (figure 1D). Peau fournit un contrôle positif interne dans les sections des jambes entières, que ce tissu a un taux élevé de l'apoptose normale (figure 1A).
Rouge sangdes cellules, des os, et les cellules endotheliales peuvent contribuer signal d'auto-fluorescente significatif (figure 2). Il est conseillé à l'image de chaque section dans un canal séparé sans marquage fluorescent pour se assurer que autofluorescence ne se trompe pas pour la signalisation de TUNEL positif. Signal de TUNEL positif Vrai doit avoir une intensité beaucoup plus élevée que l'autofluorescence, de sorte qu'il peut être isolé en fixant des seuils d'intensité de l'image (Figure 2A, rangée du milieu). Alternativement, le canal autofluorescente peut être numériquement soustrait du canal TUNEL pour obtenir signal de TUNEL positif (figure 2A, rangée du bas).
Procédé de marquage TUNEL décrit ici a été utilisé pour quantifier le muscle squelettique mort cellulaire dans un modèle de souris de 10 SMA. Marquage TUNEL montre une augmentation du nombre de profils apoptotiques dans les muscles des jambes à partir de souris âgées de 5 jours SMA, par rapport aux témoins de la même portée (figure 3A). L'augmentation de l'apoptose estquantifiable par le procédé décrit ci-dessus, ce qui indique des différences statistiquement significatives dans de multiples groupes de muscles (figure 3B).
Figure 1: Représentant étiquetage TUNEL des muscles des membres postérieurs de la souris. (A) marqué au TUNEL section transversale de la patte arrière de souris montrant muscle jambier antérieur, du tibia et de la peau. TA - jambier antérieur, Fdl - long fléchisseur des orteils, Edl - long extenseur des orteils. Vert - TUNEL, bleu - noyaux, rouge - signal de autofluorescente. Les lignes en pointillé délimitent les zones musculaires pour la quantification. Peau attenant muscles des membres postérieurs fournit un contrôle positif interne pour le marquage TUNEL. Barre d'échelle = 200 um. (b) représentant des images à très fort grossissement identification TUNEL positif structures (vert) dans l'embryon jours muscle squelettique 13 de la souris comme noyaux apoptotiques. La barre d'échelle = 10 um. A et B modifié depuis Fayzullina et Martin 2014 10. (C) de la section transversale de la patte arrière de la souris TUNEL-étiquetés après le traitement DNase pour servir de contrôle positif. La plupart des noyaux ont lumineux étiquetage TUNEL. La barre d'échelle = 50 um. (D) Coupe transversale de la même patte arrière de la souris comme indiqué dans C (semi-adjacente à la section dans C) TUNEL marqué avec l'enzyme TdT omis de servir de témoin négatif. Il n'y a aucun signal TUNEL positif lumineux; le seul signal autofluorescence verte est détectée par co-localisation avec le signal dans le canal rouge. La barre d'échelle = 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Figure 2: autofluorescence tissulaire doit être examiné et exclu de quantification lors de l'analyse marquage TUNEL. (A) section transversale de la patte arrière de souris avec marquage TUNEL et autofluorescence: image d'origine (rangée du haut), même image avec des seuils ajusté (rangée du milieu), et même image avec autofluorescence (rouge) canal soustraite (rangée du bas). Seuillage élimine cellule la plus rouge de sang et autofluorescence des cellules endothéliales mais pas l'artefact de coloration (tête de flèche, rangée du milieu). la soustraction de canal élimine également l'artefact de coloration (tête de flèche, rangée du bas). Vert - TUNEL, rouge - autofluorescence, bleu - noyaux. Barre d'échelle = 100 um. L'image supérieur de grossissement de panneau de autofluorescence rouge rectangle gris délimite zone agrandie en B. (B) dans un. Les globules rouges et certaines cellules endothéliales (flèches), et un tissue coloration artefact (tête de flèche) autofluorescence dans deux filtres de fluorescence rouge et verte. La barre d'échelle = 50 um. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3: étiquetage de TUNEL montre la mort cellulaire dans le muscle squelettique de souris SMA néonatales muscles du bas des membres postérieurs de souris SMA à jour postnatal cinq ont été marqués par la méthode TUNEL (A) l'étiquetage de TUNEL montre plusieurs profils apoptotiques dans plusieurs groupes musculaires en SMA souris.. musculaire (à droite) par rapport à un contrôle de la même portée (à gauche). Vert - TUNEL, bleu - Hoechst (noyaux), rouge - autofluorescence. Les lignes en pointillé délimitent les zones musculaires quantifiés. TA - jambier antérieur, Fdl - fouille fléchisseuritorum orteils, Edl - long extenseur des orteils. Barres d'échelle = 200 um étiquetage. (B) TUNEL a été quantifiée comme superficie totale de pixel d'un signal TUNEL normalisée à la superficie totale de pixel de muscle. Moyens ± erreurs standards sont présentés, n = 4-5 souris. La signification statistique entre les SMA et de contrôle pour chaque groupe de muscles (un test t bilatéral): * p <0,05, ** p <0,01, *** p <0,001. Ce chiffre a été modifié depuis Fayzullina et Martin 2014 10. Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Une méthode pour détecter et analyser quantitativement dommages à l'ADN associée apoptose dans le muscle squelettique de souris est décrit. La procédure comprend la récolte des tissus, coloration TUNEL, l'acquisition d'image numérique, et l'analyse d'image. Fournitures et des outils histologiques communes sont nécessaires, et un kit spécial commerciale TUNEL est nécessaire. Les grands éléments essentiels de l'équipement nécessaires sont un cryostat, un microscope à épifluorescence avec une capacité d'image numérique, et un système informatique pour l'analyse d'image.
L'expérimentateur doit être conscient des pièges potentiels. autofluorescence tissulaire est une préoccupation majeure dans l'imagerie de fluorescence. Chez les animaux unperfused, restant globules rouges contribuera signaux assez élevé autofluorescente. Les cellules endothéliales peuvent également être considérablement autofluorescente. Par conséquent, il est important de confirmer que autofluorescence ne se trompe pas pour le signal TUNEL positif. Cette évaluation est facilement accompli en prenant une image dans un canal sans fluorophore, à utiliser pour la comparaison et la soustraction possible du canal TUNEL-positives. De cette façon, la méthode TUNEL à base de fluorescence est supérieure aux méthodes de microscopie en fond clair colorimétriques qui ne offrent pas un contrôle interne pour la coloration de fond.
fixation du tissu aura des effets significatifs sur la réussite de marquage TUNEL. Il est préférable de minimiser le temps de fixation en paraformaldehyde, de ne pas dépasser 24 heures. Tissus embryonnaires et néonatale exigera des temps de fixation nettement plus courts de 24 h.
Lorsque le marquage TUNEL est réussie, signal de TUNEL positif devrait être beaucoup plus élevé que autofluorescence fond, de sorte que le signal peut être facilement isolé par l'intensité seuil de déclenchement en utilisant un logiciel d'analyse d'image. restauration des antigènes utilisant le protocole standard de chauffage dans un tampon de citrate 27,35 peut améliorer légèrement faible signal de TUNEL si le temps de chauffage est maintenu à un minimum (5 min), mais ce prétraitement dixds pour réduire le signal TUNEL si le chauffage est prolongée pendant de longues périodes (par exemple 20 min à 95 ° C). la récupération de l'antigène va augmenter fond autofluorescence et faux positifs, et donc peut annuler les gains en rapport signal-bruit de signal accru TUNEL.
Les mesures de signal TUNEL doivent être normalisées, soit à la surface totale du muscle ou quantifié au nombre de noyaux par région quantifiée. Parce TUNEL mesure noyaux apoptotiques, la normalisation idéal serait noyaux totaux. Cependant, même dans les sections musculaires relativement minces (10 um), les fibres musculaires et les noyaux sont si nombreuses et si étroitement emballés, qu'il est impossible de compter automatiquement noyaux Hoechst-colorées par des algorithmes de seuillage et de séparation des particules. Comptage manuel est aussi beaucoup de travail et inexacte. L'alternative possible est de normaliser à la zone musculaire totale.
L'essai TUNEL, utilisé avec le traitement des tissus appropriéedes techniques et des contrôles positifs et négatifs, est une méthode quantitative relativement rapide, reproductible pour détecter les dommages de l'ADN et la mort cellulaire dans le tissu. Il peut être utilisé pour confirmer l'apoptose comme mécanisme pathologique, pour identifier des types de cellules affectées, et pour évaluer l'efficacité des traitements thérapeutiques. Cette procédure sera de valeur pour les chercheurs dans les domaines de la maladie et les blessures musculaires squelettiques, y compris SMA, la SLA, la dystrophie musculaire, la myopathie induite par la toxine, et physiologie de l'exercice.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline | Electron Microscopy Sciences | 19202 | For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used. |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for cryosectioning. |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used. |
| Glass slides, 25 x 75 x 1 mm | Fisher | 12-552-3 | Slides from any supplier may be used. |
| Gelatin | Sigma | G-9391 | Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased. |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) | Sigma | 243361 | Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum. |
| Vectabond tissue adhesion reagent | Vector Labs | SP-1800 | Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead. |
| Tween20 | Sigma | P9416 | A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used. |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used. |
| TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit | Trevigen | 4812-30-K | Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling. |
| DNase/nuclease | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
| DNase/nuclease buffer | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
| 10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Amresco | 780 | Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used. |
| DNase-free water | Quality Biologicals | 351-029-131 | Water from any supplier may be used. |
| Hoechst 33258 | Sigma | 94403 | Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact. |
| Parafilm M | multiple | 807 | Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers. |
| Fluorescent microscope with digital camera | -- | -- | Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used. |
| Vectashield antifade media | Vector Labs | H-1000 | Antifade media from any supplier may be used. |
| glass coverslips, No.1 thickness | Brain Research Labs | 2222-1 | Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections. |
| Nail polish | Ted Pella | 114-8 | Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging. |
References
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