Introduction
Etichettatura fine nick Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP (TUNEL) è il processo di utilizzo dell'enzima TdT allegare dUTP al 3 'estremità del doppio e singolo filamento di DNA rompe 12,23. Il metodo TUNEL per il rilevamento di apoptosi e danni al DNA è stato segnalato prima oltre 20 anni fa da Gavrieli et al. 1,12,24. Da allora è stato valutato e ottimizzate in diverse preparazioni di tessuto 7,23,27,40. TUNEL è stato utilizzato per studiare ischemia indotta morte cellulare dei neuroni 6,14,29 e cardiomiociti 43,44, eccitotossico morte neuronale 30,31, e come biomarker nel trattamento dell'artrite 39. E 'stato anche utilizzato come fattore prognostico e marker delle cellule tumorali in diversi tumori umani 2,3,15,32,37,38,42.
Esistono metodi alternativi per il danno al DNA e la rilevazione morte cellulare, ma hanno sfide tecniche e avvertimenti. Southern blotting può essere utilizzato per quantifdanno al DNA y in tutto lisati tissutali 7,9-11, ma questo metodo non fornisce la risoluzione-livello cellulare ed è difficile da quantificare. Il Comet assay è un metodo a base di cellule alternativa che richiede l'estrazione di nuclei conservati dalle cellule 4,20,28,36. Sebbene il saggio comet funziona bene su cellule isolate coltivate, è molto più difficile preparare nuclei intatti dal tessuto muscolare scheletrico 8,21. Come con la macchia del sud, il test della cometa non fornisce informazioni cell-tipo-specifica da un intero tessuto omogenato muscolare. Un'altra alternativa al metodo TUNEL è immunoistochimica utilizzando anticorpi contro il DNA a singolo filamento 25,33,41 o contro le proteine che partecipano a percorsi di DNA di risposta danno e morte cellulare (ad es p53, H2AX, e caspasi) 13,17,22,40. Tali metodi a base di anticorpi richiedono caratterizzazione completa di anticorpi ed eccellente anticorpo specificità per produrre un elevato rapporto segnale-background. Anche quando specEsistono anticorpi IFIC, possono richiedere la denaturazione delle proteine bersaglio mediante procedure di recupero antigene 34,35. Mentre discutiamo qui, il recupero antigene risultati tessuto muscolare in inaccettabilmente alto autofluorescenza. A differenza dei metodi alternativi, TUNEL raggiunge DNA rilevamento dei danni con un segnale alto e basso fondo, eccellente specificità che può essere testato con semplici controlli positivi e negativi, buona penetrazione tissutale, che non richiedono il recupero dell'antigene, e la risoluzione a livello cellulare. Inoltre, il metodo TUNEL dura circa 4 ore per completare, mentre i metodi alternativi in genere richiedono incubazione durante la notte.
Studiamo la morte delle cellule del muscolo scheletrico in un modello murino di atrofia muscolare spinale (SMA) 10 che è stato generato da Hsieh-Li e colleghi 16. Per quantificare cellule apoptotiche nel muscolo, abbiamo sviluppato un metodo di preparazione dei tessuti, la colorazione, e quantificazione che funziona robusto tra i diversi Skelegruppi muscolari Tal in diversi momenti dello sviluppo nei topi. Usiamo un kit TUNEL etichettatura disponibile in commercio e disponibile in commercio software di analisi dell'immagine. Abbiamo anche utilizzato con successo il test TUNEL in combinazione con immunofluorescenza nel midollo spinale 10.
I metodi descritti sono utili per gli investigatori che vogliono valutare la patologia dei tessuti, dei meccanismi della malattia, i meccanismi di invecchiamento, e di sviluppo (pre e post-natale) la morte cellulare nel muscolo scheletrico. La tecnica TUNEL è particolarmente utile per gli studi di danno e riparazione del DNA e morte cellulare in sistemi modello in cui solo un sottoinsieme di celle è colpita e risoluzione livello cellulare è necessaria.
Questo video descrive la dissezione, processazione dei tessuti, sezionamento, e l'etichettatura TUNEL basato sulla fluorescenza del mouse del muscolo scheletrico. Viene inoltre descritto un metodo di semi-automatico del segnale quantificazione TUNEL.
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Protocol
NOTA: Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono state effettuate in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health 26. Il protocollo (MO13M391) è stato approvato dall'Università Animal Care and Use Committee Johns Hopkins.
Sacrificio 1. neonatale mouse, Dissection, e fissazione
- Sacrifica un mouse neonatale da CO 2 inalazione.
- Immediatamente tagliare il arti posteriori sopra il ginocchio. Fino al giorno di circa 7 postnatale, le ossa delle gambe sono abbastanza morbido per tagliare con forbici grandi laboratorio o lama affilata e alla successiva sezione un criostato.
- Posizionare il hindlimb in 10 ml di ghiaccio freddo 4% paraformaldeide in tampone fosfato salino (PBS) in una provetta da 15 ml.
- Immersion fissare il arti posteriori in paraformaldeide per 4-24 ore a 4 ° C. Tessuti embrionali richiede solo alcune ores di fissazione.
- Evitare di fissaggio più di 24 ore, in quanto ciò potrebbe ridurre l'efficienza TUNEL assay.
- Cryoprotect il arti posteriori immergendolo in una soluzione di saccarosio.
- Cambiare paraformaldeide al 10% di saccarosio in PBS nello stesso tubo 15 ml, incubare una notte a 4 ° C.
- Variazione al 30% di saccarosio in PBS, incubare una notte a 4 ° C o fino ai lavandini hindlimb al fondo della provetta. Tissue può essere lasciato nel 30% di saccarosio per un periodo più lungo, a condizione che il saccarosio è stata filtrata sterile.
2. Tissue Embedding
- Riempire uno stampo embedding metà marcato con mezzo di inclusione.
- Inserire hindlimb sopra il mezzo di inclusione, con la parte tagliata il più vicino possibile ad una parete dello stampo. Contrassegnare l'orientamento della arti posteriori sulla parte esterna dello stampo.
- Incorpora diverse arti posteriori e tagliare nello stesso blocco. Tuttavia, è importante assicurare che tutte hindlimbs nel blocco sono orientate parallelamente tra loro per ottenere sezioni in corrispondenza livelli lungo l'asse dell'arto.
- Coprire arti posteriori con mezzo di inclusione. Se zampe posteriori spostano durante il versamento del mezzo, ri-orientare con una pinza a punta smussata o uno stuzzicadenti.
- Lasciare mezzo di inclusione per infiltrarsi tessuto a temperatura ambiente per almeno 15 min.
- Mettere gli stampi direttamente in ghiaccio secco o in isopentano in ghiaccio secco per congelare mezzo di inclusione. Assicurarsi di mantenere il livello di stampi in ogni momento e di evitare lo spostamento del tessuto incorporato.
- Mantenere stampi congelati a -80 ° C fino al momento di taglio, fino a diversi mesi.
3. criosezionamento incorporato Limbs
- Impostare temperatura della camera criostato a -20 ° C, la temperatura dell'oggetto a -18 ° C; regolare la temperatura dell'oggetto verso il basso, se necessario.
- Portate il blocco di tessuto all'interno della camera criostato per almeno 30 min. Blocco corretta temperaturaerature è fondamentale per la qualità sezione.
- Tagliare sezioni trasversali ad uno spessore di 10 micron o meno. Sezioni spesse non saranno pienamente penetrati da reagenti TUNEL. Utilizzare la piastra anti-rollio, pale, e l'angolo della lama (tipicamente 5 °), raccomandato per il criostato.
- Raccogliere sezioni su gelatin- o vetrini vectabond rivestite a temperatura ambiente. Mettere subito in una scatola di diapositive in ghiaccio secco. Conservare la scatola diapositiva in un contenitore separato con ghiaccio secco posto in prossimità del criostato a portata di mano.
- Tagliare sezioni trasversali seriali attraverso l'asse dell'arto, saltare 100-200 micron. Raccogliere almeno 3 sezioni adiacenti a ciascun livello di serie.
4. TUNEL test sulle sezioni degli arti posteriori utilizzando un kit in commercio Disponibile (tutte le misure a temperatura ambiente se non indicato)
- Scongelare vetrini con sezioni a temperatura ambiente e asciugare durante la notte o durante il fine settimana.
- Reidratare sezioni di immersing vetrini in PBS per 2 x 10 min in una vaschetta Coplin. Asciugare con un laboratorio di pulire, rimuovere quanto più liquido intorno alla sezione possibile.
- Sezioni permeabilize
- Utilizzare un non-proteolitici, reattivo a base di saponina commerciale oppure 0,5% e il 0,05% Tween20 Triton X100 in PBS.
- Posizionare il vetrino in una camera umida. Una semplice camera umida è una scatola vuota puntale con un coperchio a tenuta, con acqua sufficiente a coprire appena aggiunto il fondo della scatola.
- Pipetta abbastanza reattivo sul vetrino per coprire la sezione (50 ml è sufficiente per gli arti neonatali del mouse). Non pipettare direttamente sulla sezione, come agitazione ripetuta può provocare la sezione per sollevare la diapositiva.
- Utilizzando pinze a punta smussata, posizionare un piccolo rettangolo di parafilm sulla parte superiore della sezione di diffondere la goccia di reagente e coprire completamente la sezione. Se le bolle si formano sotto la parafilm, delicatamente sollevarlo, asciutto, e riapplicare.
- Incubare i vetrini con permeabilireattivo zione per 1 ora in una camera umida coperta. Se sezioni iniziano a sollevarsi dalla diapositiva, tempo di permeabilizzazione può essere ridotto a 30 min.
- Lavare i vetrini in PBS in una vaschetta Coplin 2 x 5 min. I rettangoli parafilm dovrebbero fluttuare verso l'alto e può quindi essere rimosso e scartato.
- Utilizzando un laboratorio strofinata, asciugare quanto più liquido intorno sezioni possibili.
- DNA etichettatura pausa TdT-mediata
- Seguire le istruzioni del kit per fare 1x buffer di etichettatura TdT, pipetta abbastanza buffer di etichettatura sul vetrino per coprire la sezione di tessuto (50 ml è sufficiente per gli arti neonatali del mouse). Incubare nella camera umida per 5 min. In alternativa, immergere il vetrino in buffer di etichettatura TdT in una vaschetta Coplin.
- Seguire le istruzioni del kit per fare TdT mix di etichettatura. Il kit comprende cobalto, magnesio, manganese e cationi; il catione manganese funziona bene su una varietà di tessuti, compresi i muscoli scheletrici, tiss sistema nervosoUES, il fegato, la pelle e ossa.
- Per un controllo positivo, aggiungere DNase (etichetta "nuclease" nel kit) per il mix di etichettatura TdT. In alternativa, pre-trattamento di una sezione di controllo positivo con DNasi in tampone nucleasi per 1 ora a 37 ° C, secondo le istruzioni del kit. Tenere soluzione DNasi e sezioni DNasi trattati da altre sezioni sperimentali per evitare la contaminazione incrociata.
- Per un controllo negativo, omettere TdT enzima dalla miscela etichettatura.
- Utilizzare un laboratorio wipe per rimuovere la maggior quantità di buffer etichettatura TdT dalla diapositiva possibile. Pipettare TdT mix etichettatura sul vetrino (50 microlitri per sezione), coprire con un nuovo rettangolo di parafilm e incubare in camera umida a 37 ° C per 1 ora.
- Seguire le istruzioni del kit per fare tampone arresto 1x. Utilizzare un laboratorio pulire per rimuovere TdT mix etichettatura dalla diapositiva, e aggiungere 200-300 tampone di arresto microlitri per coprire la sezione di tessuto e incubare in camera umida per 5 min. Al ternativa, immergere il vetrino in buffer di arresto in una vaschetta Coplin.
- Lavare il vetrino 2 x 2 min in PBS. Utilizzare un laboratorio strofinata per rimuovere quanto più PBS dal vetrino possibile.
- Etichettatura fluorescente
- Seguire le istruzioni del kit per la preparazione soluzione di etichettatura fluoresceina etichettare dNTP a rotture del DNA. Soluzione Pipettare sul vetrino (50 microlitri per sezione), coprire con un nuovo rettangolo di parafilm e incubare in camera umida per 20 min.
- Lavare il vetrino per 2 minuti in PBS in una vaschetta Coplin. Utilizzare un laboratorio strofinata per rimuovere il più possibile dal PBS diapositiva.
- Diluire Hoechst 33258 colorazione nucleare a 1 mg / ml in PBS e pipetta sul vetrino (100-200 ml è sufficiente a coprire la sezione). Incubare nella camera umida per 5 min.
- Lavare 3x per 5 min in PBS.
- Coverslip con Antifade mezzi di montaggio fluorescenza e sigillare i bordi con smalto.
- Acquisire le immagini utilizzando un microscopio a fluorescenza convenzionale con DAPI, FITC, e filtri Texas rossi (o equivalenti). Utilizzare un obiettivo più alto ingrandimento (20X o 40X) per verificare che l'etichettatura era successo e nuclei (intatti o frammentati) sono stati etichettati. Un obiettivo 10X è sufficiente per la quantificazione di puncta TUNEL-positive.
- Raccogliere immagini della colorazione Hoechst, TUNEL colorazione, e il segnale autofluorescenti come tre canali a falsi colori separati uniti in una sola immagine. Se l'etichetta fluoroforo TUNEL è verde, segnale di immagine autofluorescenti nel filtro rosso, e viceversa.
- Mantenere tutte le impostazioni di imaging equivalente tra le diapositive per la successiva soglia e quantificazione. Per ogni filtro, i tempi prestabiliti e di esposizione di registrazione, il guadagno, e binning (senza binning è meglio); non utilizzare le impostazioni di esposizione o di guadagno automatico.
- Usa-prove ed errori per trovare esposizione e guadagno impostazioni che meglio catturare la gamma di intenpiazzole in tutti i vetrini colorati. Assicurarsi che non vi siano pixel saturi nelle immagini acquisite, in modo da pregiudizi quantificazione.
- Prendere le immagini di tutto il gruppo muscolare di interesse. Questo può richiedere più immagini da "cuciti" insieme.
Analisi 6. Immagine
- Utilizzare i programmi di analisi delle immagini disponibili in commercio per analizzare le immagini digitali di TUNEL colorazione. Analisi con software commerciale qui è mostrato. In alternativa, il software ImageJ esente da NIH può essere utilizzato per analizzare TUNEL colorazione.
- Macchia una sezione adiacente alla sezione TUNEL macchiato con ematossilina eosina (H & E) e prendere un full-sezione di immagine digitale con un microscopio campo chiaro convenzionale. Usa questa immagine H & E in combinazione con un atlante di anatomia 5,18,19 tracciare le strutture anatomiche da quantificare.
- Con il canale TUNEL spento, tracciare manualmente il contorno dell'area da quantificare, utilizzandoHoechst e canali di autofluorescenza di orientamento. Convertire l'area tracciata in una maschera (un insieme di pixel selezionato coordinate da analizzare).
- Attivare il canale TUNEL. Utilizzando la funzione di intensità thresholding nel programma di analisi delle immagini, impostare la soglia inferiore di escludere tutti i segnali autofluorescenza.
- Applicare le stesse impostazioni di soglia a tutte le immagini del set di studio. Convertire le selezioni thresholded in maschere.
- Per ogni immagine, combinare la maschera zona muscolare e la maschera TUNEL. La nuova maschera combinazione rappresenterà segnale TUNEL all'interno solo l'area del muscolo tracciato.
- Eseguire maschera quantificazione sulla maschera combinazione per determinare il numero di oggetti e l'area del segnale TUNEL all'interno dell'area muscolare tracciata oggetto. Eseguire questo utilizzando la funzione Particle Analyzer in ImageJ.
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Representative Results
Con la colorazione di successo, il segnale TUNEL-positivi dovrebbe essere abbastanza luminoso per isolare da autofluorescenza impostando soglie di intensità. Oggetti TUNEL-positive a basso ingrandimento possono apparire frammenti irregolari come brillanti nel muscolo scheletrico (Figura 1A). Tuttavia, a più alto ingrandimento, si devono osservare alcuni oggetti TUNEL-positivi con la classica morfologia apoptotica, se il tipo di morte cellulare in questione è l'apoptosi (Figura 1B). Il controllo positivo (DNasi aggiunto) deve presentare abbondanti segnale TUNEL-positivi, uniformemente distribuito in tutti i tessuti nella sezione (Figura 1C). Il controllo negativo (TdT enzima omesso reazione) dovrebbe produrre sfondo a bassa intensità e il segnale autofluorescenti solo (Figura 1D). Pelle fornisce un controllo positivo interno in intere sezioni delle gambe, come questo tessuto ha un alto tasso di apoptosi normale (Figura 1A).
Rosso sanguecellule, delle ossa, e le cellule endoteliali possono contribuire significativo segnale autofluorescenti (Figura 2). Si consiglia di immagine ogni sezione in un canale separato senza marcatura fluorescente per garantire che non si sbaglia autofluorescenza per la segnalazione TUNEL positive. Segnale TUNEL-positive Vero dovrebbe avere intensità molto superiore autofluorescenza, in modo che possa essere isolato impostando soglie di intensità dell'immagine (Figura 2A, fila centrale). In alternativa, il canale può essere autofluorescenti digitalmente sottratta dal canale TUNEL cedere segnale TUNEL-positive (Figura 2A, fila inferiore).
Il metodo di etichettatura TUNEL qui descritta è stata utilizzata per quantificare la morte delle cellule del muscolo scheletrico in un modello murino di SMA 10. Etichettatura TUNEL mostra un aumento del numero di profili apoptotici nei muscoli delle gambe dal 5 giorni d'età topi SMA, rispetto ai controlli littermate (Figura 3A). L'aumento dell'apoptosi èquantificabile con il metodo descritto sopra, indicando differenze statisticamente significative in più gruppi muscolari (Figura 3B).
Figura 1: etichettatura TUNEL Rappresentante dei muscoli del mouse arti posteriori. (A) TUNEL-etichettato sezione trasversale del mouse hindlimb mostrando muscolo tibiale anteriore, della tibia, e la pelle. TA - tibiale anteriore, Fdl - flessore lungo delle dita, Edl - estensore lungo delle dita. Verde - TUNEL, blu - nuclei, rosso - il segnale autofluorescenti. Le linee tratteggiate delineano zone muscolari per la quantificazione. Pelle adiacente muscoli arti posteriori fornisce un controllo interno positivo per l'etichettatura TUNEL. Bar Scala = 200 micron. (B) Rappresentante immagini ad alto ingrandimento identificando TUNEL-positivi strutture (verde) in embrionale giorno 13 del mouse muscolo scheletrico come nuclei apoptotici. Bar Scala = 10 micron. A e B modificati da Fayzullina e Martin 2014 10. (C) trasversale sezione del topo hindlimb TUNEL-etichettati dopo il trattamento DNasi per servire come controllo positivo. La maggior parte dei nuclei hanno etichettatura TUNEL luminoso. Barra di scala = 50 micron. (D) Sezione trasversale dello stesso hindlimb mouse come mostrato in C (semi-adiacente a sezione C) TUNEL-marcato con enzima TdT omesso per servire come controllo negativo. Non vi è alcun segnale TUNEL-positive brillante; l'unico segnale verde è autofluorescenza come rilevato dalla colocalizzazione con segnale nel canale rosso. Bar Scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Figura 2: Tissue autofluorescenza deve essere considerato e esclusa dalla quantificazione nell'analisi etichettatura TUNEL. (A) sezione trasversale degli arti posteriori Mouse con etichettatura TUNEL e autofluorescenza: immagine originale (riga in alto), stessa immagine con soglie adjusted (riga centrale), e la stessa immagine con autofluorescenza (rosso) del canale sottratto (fila in basso). Thresholding elimina cellulare più rossi del sangue e autofluorescenza cellule endoteliali, ma non l'artefatto colorazione (punta di freccia, riga centrale). Sottrazione Canale elimina anche l'artefatto colorazione (punta di freccia, riga in basso). Verde - TUNEL, rosso - autofluorescenza, blu - nuclei. Bar Scala = 100 micron. Immagine di ingrandimento superiore di pannello autofluorescenza rosso rettangolo grigio delinea area ingrandita in B. (B) in A. Globuli rossi del sangue e alcune cellule endoteliali (frecce), e un tissue colorazione artefatto (freccia) autofluorescenza in entrambi i filtri fluorescenza rossa e verde. Bar Scala = 50 micron. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Etichettatura TUNEL mostra la morte cellulare nel muscolo scheletrico neonatali topi SMA muscoli arti posteriori più bassi di topi SMA al giorno postnatale 5 sono stati etichettati con il metodo TUNEL (A) etichettatura TUNEL mostra più profili apoptotici in più gruppi muscolari del mouse SMA.. muscolare (a destra) rispetto al controllo littermate (a sinistra). Verde - TUNEL, blu - Hoechst (nuclei), rosso - autofluorescenza. Le linee tratteggiate delineano le zone muscolari quantificati. TA - tibiale anteriore, Fdl - dig flessoreitorum longus, Edl - estensore lungo delle dita. Bar Scala = 200 micron di etichettatura. (B) TUNEL è stata quantificata come un'area di pixel totale di segnale TUNEL normalizzato di un'area di pixel totale del muscolo. Mezzi ± errori standard sono mostrati, n = 4 - 5 topi. La significatività statistica tra SMA e controllo per ogni gruppo muscolare (una coda t-test): * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.001. Questo dato è stato modificato da Fayzullina e Martin 2014 10. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
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Discussion
Un metodo per rilevare e analizzare quantitativamente DNA danni associata apoptosi nel topo muscoli scheletrici è descritto. La procedura prevede la raccolta dei tessuti, TUNEL colorazione, l'acquisizione di immagini digitali, e l'analisi delle immagini. Sono necessarie forniture istologiche comuni e strumenti, e uno speciale kit di TUNEL commerciale è necessario. Gli elementi essenziali necessari grandi apparecchiature sono un criostato, microscopio epifluorescente con capacità di immagine digitale, e un sistema di computer per l'analisi dell'immagine.
Lo sperimentatore deve essere consapevole di potenziali insidie. Tissue autofluorescenza è una delle principali preoccupazioni in imaging di fluorescenza. Negli animali unperfused, rimanendo globuli rossi contribuirà segnale abbastanza alto autofluorescenti. Le cellule endoteliali possono anche essere significativamente autofluorescenti. Pertanto, è importante per confermare che autofluorescenza non si sbaglia per il segnale TUNEL-positive. Questa valutazione è facilmente realizzabile prendendo un'immagine in un canale senza fluorophore, da utilizzare per il confronto e l'eventuale sottrazione dal canale TUNEL-positive. In questo modo, il metodo TUNEL basato sulla fluorescenza è superiore a metodi colorimetrici microscopia campo chiaro che non offrono un controllo interno per la colorazione di fondo.
Il fissaggio del tessuto avrà effetti significativi sul successo di etichettatura TUNEL. E 'meglio per ridurre al minimo il tempo di fissazione in paraformaldeide, non superare 24 ore. Tessuti embrionali e neonatale richiederà tempi di fissazione notevolmente più brevi di 24 ore.
Quando etichettatura TUNEL è successo, il segnale TUNEL-positivo dovrebbe essere molto superiore a sfondo autofluorescenza, in modo che il segnale può essere facilmente isolata dalla intensità soglia gating utilizzando software di analisi dell'immagine. Recupero Antigen utilizzando il protocollo standard di riscaldamento in tampone citrato 27,35 potrebbe leggermente migliorare segnale basso TUNEL se il tempo di riscaldamento è ridotto al minimo (5 min), ma questo pretrattamento diecids per ridurre segnale TUNEL se il riscaldamento è esteso per periodi più lunghi (ad esempio 20 min a 95 ° C). Recupero Antigen aumenterà sfondo autofluorescenza e falsi positivi, e potrebbe dunque vanificare gli eventuali guadagni di rapporto segnale-rumore di un aumento del segnale TUNEL.
Le misurazioni dei segnali TUNEL devono essere normalizzati sia alla zona muscolare totale quantificato o al numero di nuclei per area quantificato. Poiché TUNEL misura nuclei apoptotici, la normalizzazione ideale sarebbe nuclei totali. Tuttavia, anche in relativamente sottili (10 micron) sezioni muscolari, le fibre muscolari ei nuclei sono così numerosi e confezionati in modo da vicino, che è impossibile contare automaticamente nuclei Hoechst-macchiati di algoritmi sogliatura e separazione delle particelle. Conteggio manuale è anche molto alta intensità di lavoro e imprecisa. L'alternativa fattibile è quella di normalizzare all'area muscolare totale.
Il saggio TUNEL, utilizzato con l'elaborazione del tessuto adeguatotecniche e controlli positivi e negativi, è relativamente veloce e riproducibile, metodo quantitativo, per rilevare danno al DNA e morte cellulare nel tessuto. Può essere usato per confermare apoptosi come meccanismo patologico, per identificare i tipi di cellule colpite, e per valutare l'efficacia di trattamenti terapeutici. Questa procedura sarà di valore per i ricercatori nel campo delle malattie del muscolo scheletrico e lesioni, tra cui SMA, SLA, distrofia muscolare, miopatia tossina-indotta, e fisiologia.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 4% Paraformaldehyde in phosphate buffered saline | Electron Microscopy Sciences | 19202 | For procedures described here, 4% solution was prepared fresh from powder. Paraformaldehyde from any supplier may be used. Prepared formaldehyde solution should be stored at 4 °C and should not be used after its expiration date (up to several months). Paraformaldehyde is a carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling paraformaldehyde. |
| Sucrose | Sigma | S0389 | Used for cryoprotecting tissue before freezing. Sucrose from any supplier may be used. |
| O.C.T. compound | Tissue-Tek | 4583 | Embedding medium for cryosectioning. |
| Cryostat | Leica | CM 3050S | A Leica CM3050S cryostat was used for the preparations described here. Any cryostat capable of cutting 10 μm sections may be used. |
| Glass slides, 25 x 75 x 1 mm | Fisher | 12-552-3 | Slides from any supplier may be used. |
| Gelatin | Sigma | G-9391 | Gelatin is used to promote tissue section adhesion to glass slides. To coat glass slides with gelatin, dissolve 2.75 g gelatin and 0.275 g chrome alum in 500 ml distilled water, warm to 60 °C, dip slides for several seconds, and let dry. Gelatin from any supplier may be used. Alternatively, gelatin-precoated slides may be purchased. |
| Chromium(III) potassium sulfate dodecahydrate (chrome alum) | Sigma | 243361 | Chrome alum is added to gelatin solution to promote tissue adhesion on glass slides. It is a possible carcinogen and a toxin by inhalation and skin contact. Please follow precautions specified in the MSDS when handling chrome alum. |
| Vectabond tissue adhesion reagent | Vector Labs | SP-1800 | Optional substrate for better tissue adhesion to glass slides; gelatin-coated slides may be used instead. |
| Tween20 | Sigma | P9416 | A detergent used to permeabilize tissue. Tween20 from any supplier may be used. |
| Triton X100 | Sigma | T8787 | A detergent used to permeabilize tissue. Triton X100 from any supplier may be used. |
| TACS 2 TdT fluorescein in situ apoptosis detection kit | Trevigen | 4812-30-K | Commercial kit for fluorescence-based TUNEL labeling. |
| DNase/nuclease | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
| DNase/nuclease buffer | Trevigen | 4812-30-K | (included with kit) |
| 10x phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Amresco | 780 | Make 1x PBS for washes and dilutions. PBS from any supplier may be used. |
| DNase-free water | Quality Biologicals | 351-029-131 | Water from any supplier may be used. |
| Hoechst 33258 | Sigma | 94403 | Nuclear dye. Any blue fluorescent nuclear dye may be used. As a DNA-binding dye, Hoechst is a suspected carcinogen and should be handled with protective equipment to minimize skin contact. |
| Parafilm M | multiple | 807 | Any other hydrophobic film or cover slip may be used. Available from multiple suppliers. |
| Fluorescent microscope with digital camera | -- | -- | Any fluorescent microscope capable of digitally capturing red, green, and blue fluorescence in separate channels may be used. |
| Vectashield antifade media | Vector Labs | H-1000 | Antifade media from any supplier may be used. |
| glass coverslips, No.1 thickness | Brain Research Labs | 2222-1 | Cover slips from any supplier may be used. The smallest size of 22 x 22 mm is sufficient for neonatal mouse leg sections. |
| Nail polish | Ted Pella | 114-8 | Used to seal coverslips. Nail polish from any supplier (including regular retailers) may be used. Avoid using nail polish with color or additives that may reflect light during fluorescent imaging. |
References
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