Rilevamento e analisi del danno al DNA nel muscolo scheletrico mouse In Situ Utilizzo del metodo TUNEL

Sommario

Questo video descrive la dissezione, l'elaborazione dei tessuti, il sezionamento e l'etichettatura TUNEL basata sulla fluorescenza del muscolo scheletrico del topo. Descrive inoltre un metodo per l'analisi semi-automatica dell'etichettatura TUNEL.

Abstract

Terminal deoxynucleotidil transferasi (TdT) deossiuridina trifosfato (dUTP) nick end labeling (TUNEL) è il metodo di utilizzo dell'enzima TdT per attaccare covalentemente una forma marcata di dUTP alle estremità 3' di rotture di DNA a doppio e singolo filamento nelle cellule. È un metodo affidabile e utile per rilevare il danno al DNA e la morte cellulare in situ. Questo video descrive la dissezione, l'elaborazione dei tessuti, il sezionamento e la marcatura TUNEL basata sulla fluorescenza del muscolo scheletrico del topo. Descrive anche un metodo di quantificazione semi-automatica del segnale TUNEL. Le normali caratteristiche intrinseche dei tessuti e le condizioni di lavorazione dei tessuti influenzano la capacità dell'enzima TdT di marcare in modo efficiente il DNA. L'elaborazione dei tessuti può anche aggiungere un'autofluorescenza indesiderata che interferirà con il rilevamento del segnale TUNEL. Pertanto, è importante determinare empiricamente i metodi di lavorazione dei tessuti e di marcatura TUNEL che produrranno il rapporto segnale/rumore ottimale per la successiva quantificazione. Il saggio basato sulla fluorescenza qui descritto fornisce un modo per escludere il segnale autofluorescente mediante sottrazione del canale digitale. Il test TUNEL, utilizzato con tecniche e controlli di processamento tissutale appropriati, è un metodo quantitativo relativamente veloce e riproducibile per rilevare l'apoptosi nei tessuti. Può essere utilizzato per confermare il danno al DNA e l'apoptosi come meccanismi patologici, per identificare i tipi di cellule colpite e per valutare l'efficacia dei trattamenti terapeutici in vivo.

Introduzione

Etichettatura fine nick Terminal deossinucleotidil transferasi (TdT) dUTP (TUNEL) è il processo di utilizzo dell'enzima TdT allegare dUTP al 3 'estremità del doppio e singolo filamento di DNA rompe ^12,23. Il metodo TUNEL per il rilevamento di apoptosi e danni al DNA è stato segnalato prima oltre 20 anni fa da Gavrieli et al. ^1,12,24. Da allora è stato valutato e ottimizzate in diverse preparazioni di tessuto ^7,23,27,40. TUNEL è stato utilizzato per studiare ischemia indotta morte cellulare dei neuroni ^6,14,29 e cardiomiociti ^43,44, eccitotossico morte neuronale ^30,31, e come biomarker ....

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure sugli animali descritti in questo protocollo sono state effettuate in conformità con le raccomandazioni della Guida per la cura e l'uso di animali da laboratorio del National Institutes of Health ^26. Il protocollo (MO13M391) è stato approvato dall'Università Animal Care and Use Committee Johns Hopkins.

Sacrificio 1. neonatale mouse, Dissection, e fissazione

1. Sacrifica un mouse neonatale da CO ₂ inalazione.
2. Immediatamente tagliare il arti posteriori sopra il ginocchio. Fino al giorno di circa 7 postnatale, le ossa delle gambe sono abbastanza morbido per tag....

Risultati

Con la colorazione di successo, il segnale TUNEL-positivi dovrebbe essere abbastanza luminoso per isolare da autofluorescenza impostando soglie di intensità. Oggetti TUNEL-positive a basso ingrandimento possono apparire frammenti irregolari come brillanti nel muscolo scheletrico (Figura 1A). Tuttavia, a più alto ingrandimento, si devono osservare alcuni oggetti TUNEL-positivi con la classica morfologia apoptotica, se il tipo di morte cellulare in questione è l'apoptosi (Figura 1B). Il c.......

Discussione

Un metodo per rilevare e analizzare quantitativamente DNA danni associata apoptosi nel topo muscoli scheletrici è descritto. La procedura prevede la raccolta dei tessuti, TUNEL colorazione, l'acquisizione di immagini digitali, e l'analisi delle immagini. Sono necessarie forniture istologiche comuni e strumenti, e uno speciale kit di TUNEL commerciale è necessario. Gli elementi essenziali necessari grandi apparecchiature sono un criostato, microscopio epifluorescente con capacità di immagine digitale, e un sistem.......

Materiali

Elenco dei materiali utilizzati in questo articolo

Nome	Azienda	Numero di catalogo	Commenti
Paraformaldeide al 4% in soluzione salina tamponata con fosfato	Scienze della microscopia elettronica	19202	Per le procedure qui descritte, la soluzione al 4% è stata preparata fresca dalla polvere. Può essere utilizzata paraformaldeide di qualsiasi fornitore. La soluzione di formaldeide preparata deve essere conservata a 4 gradi; C e non deve essere utilizzato dopo la data di scadenza (fino a diversi mesi). La paraformaldeide è un agente cancerogeno e una tossina per inalazione e contatto con la pelle. Si prega di seguire le precauzioni specificate nella scheda di sicurezza quando si maneggia la paraformaldeide.
Saccarosio	Sigma	S0389	Utilizzato per la crioprotezione dei tessuti prima del congelamento. Può essere utilizzato saccarosio di qualsiasi fornitore.
Composto O.C.T.	Tissue-Tek	4583	Terreno di inclusione per criosezione.
Criostato	Leica	CM 3050S	Per i preparativi qui descritti è stato utilizzato un criostato Leica CM3050S. Qualsiasi criostato in grado di tagliare 10 μ possono essere utilizzate sezioni m.
Vetrini in vetro, 25 x 75 x 1 mm	Fisher	12-552-3	È possibile utilizzare vetrini di qualsiasi fornitore.
Gelatina	Sigma	G-9391	La gelatina viene utilizzata per promuovere l'adesione della sezione di tessuto ai vetrini. Per rivestire i vetrini con gelatina, sciogliere 2,75 g di gelatina e 0,275 g di allume di cromo in 500 ml di acqua distillata, scaldare a 60 gradi; C, immergere i vetrini per alcuni secondi e lasciare asciugare. Può essere utilizzata gelatina di qualsiasi fornitore. In alternativa, è possibile acquistare vetrini prerivestiti con gelatina.
Il solfato di potassio di cromo (III) dodecaidrato (allume di cromo)	Sigma	243361	allume di cromo viene aggiunto alla soluzione di gelatina per promuovere l'adesione dei tessuti sui vetrini. È un possibile cancerogeno e una tossina per inalazione e contatto con la pelle. Si prega di seguire le precauzioni specificate nella scheda di sicurezza quando si maneggia l'allume cromato.
Reagente di adesione tissutale Vectabond	Vector Labs	SP-1800	Substrato opzionale per una migliore adesione dei tessuti ai vetrini; in alternativa possono essere utilizzati vetrini rivestiti di gelatina.
Tween20	Sigma	P9416	Un detergente utilizzato per permeabilizzare i tessuti. È possibile utilizzare Tween20 di qualsiasi fornitore.
Triton X100	Sigma	T8787	Un detergente utilizzato per permeabilizzare i tessuti. È possibile utilizzare Triton X100 di qualsiasi fornitore.
rilevamento dell'apoptosi della fluoresceina TACS 2 TdT in situ	Trevigen	4812-30-K	Kit commerciale per la marcatura TUNEL basata sulla fluorescenza.
DNasi/nucleasi	Trevigen	4812-30-K	(incluso nel kit)
DNasi/tampone nucleasi	Trevigen	4812-30-K	(incluso nel kit)
10x soluzione salina tamponata con fosfato (PBS), pH 7,4	Amresco	780	Make 1x PBS per lavaggi e diluizioni. È possibile utilizzare PBS di qualsiasi fornitore.
Acqua priva di DNasi	Qualità Biologici	351-029-131	È possibile utilizzare acqua di qualsiasi fornitore.
Hoechst 33258	Sigma	94403	Colorante nucleare. Può essere utilizzato qualsiasi colorante nucleare fluorescente blu. Come colorante legante il DNA, l'Hoechst è un sospetto cancerogeno e deve essere maneggiato con dispositivi di protezione per ridurre al minimo il contatto con la pelle.
Parafilm M	multiplo	807	È possibile utilizzare qualsiasi altra pellicola idrofoba o vetrino coprioggetto. Disponibile da più fornitori.
Microscopio a fluorescenza con fotocamera digitale			può essere utilizzato qualsiasi microscopio a fluorescenza in grado di catturare digitalmente la fluorescenza rossa, verde e blu in canali separati.
i supporti antidissolvenza Vectashield	Vector Labs	H-1000	Antifade di qualsiasi fornitore.
vetrini coprioggetti, spessore n. 1	Brain Research Labs	2222-1	Possono essere utilizzati vetrini coprioggetti di qualsiasi fornitore. La dimensione più piccola di 22 x 22 mm è sufficiente per le sezioni delle zampe del topo neonatale.
Smalto per unghie	Ted Pella	114-8	Utilizzato per sigillare i vetrini. È possibile utilizzare smalti per unghie di qualsiasi fornitore (compresi i rivenditori regolari). Evitare l'uso di smalti per unghie con coloranti o additivi che possono riflettere la luce durante l'imaging fluorescente.

Kit per il È possibile utilizzare