Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Flowcytometri Protokoller for Surface og intracellulære Antigen Analyser af neurale Cell Typer

Published: December 18, 2014 doi: 10.3791/52241
Automatic Translation
1, 1,2, 1,3, 1, 1,4
1Emmy Noether-Group for Stem Cell Biology, Department of Molecular Embryology, Institute of Anatomy and Cell Biology, University of Freiburg, 2Spemann Graduate School of Biology and Medicine and Faculty of Biology, University of Freiburg, 3School of Life Sciences, Keele University, 4Center for Biological Signaling Studies (BIOSS), University of Freiburg

Introduction

Flowcytometri er blevet grundigt udnyttet i immunologi, hæmatologi og onkologi at definere cellepopulationer via iboende scatter egenskaber, celleoverfladeantigen ekspression og andre fluorescensparametre 1-3. Vores indsigt i slægt udvikling og sygdom er et resultat at en betydelig grad af den kontinuerlige forfining af denne metode efter dens oprindelige 4,5 gennemførelse. Øget bevidsthed om den kvantitative og den samlede analytiske potentiale flowcytometri nylig tilskyndet sin mere udbredt anvendelse i stamcelleforskning og kan gøre det muligt på samme måde dybe fremskridt i en kortere tidsramme 6. Imidlertid har anvendelsen af ​​flowcytometri til specifikt at analysere og isolere neurale populationer længe været opfattet som udfordrende. I modsætning til hæmatopoietiske celler, som naturligt findes i suspension, er neurale celletyper typisk høstet fra overdrevent komplekse kilder, der kan omfatte glia og forskellige other omkringliggende celler samt et indviklet netværk af proces-bærende neuroner. Følgelig har neurobiologi endnu at gennemføre alsidighed flowcytometri til dets fuldstændige potentiale i daglige forskning rutiner. Men så længe som en levedygtig enkelt cellesuspension kan genereres (og protokoller er blevet udviklet og optimeret til dette formål 7), flowcytometri og fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) kan betragtes som et værdifuldt element i den analytiske repertoire i neurobiologi 8-11.

Figur 1
. Figur 1. Princippet om flowcytometrisk analyse og komponenter i et flowcytometer flowcytometre omfatter tre vigtigste systemer: fluidik, optik og elektronik. En strømlinet flow af celler i suspension (fremstillet ud fra primært væv eller in vitro kultur) opnås ved hylsteret bomuld, lid via hydrodynamisk fokusering, begrænser prøven til dens centrum kerne. De optiske dele er sammensat af lasere, der belyser strømmen af ​​celler og optiske filtre, der dirigerer signalet til passende detektorer. De lyssignaler detekteres konverteres til elektroniske signaler, derefter behandles af en computer og visualiseret på en skærm til dataanalyse og gating. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Brugere af flowcytometriske metoder profit fra mindst en grundlæggende forståelse af de underliggende fundamentale, herunder en cytometer byggesten (til gennemgang se 12,13; se også figur 1). En laserstråle skærer med en hydrodynamisk fokuseret strømningsteknisk strøm, der indeholder de celler i suspension, som igen passerer gennem laserstrålen i "enkelt fil« ene efter den anden. Den interceptipå en celle (eller en anden partikel, for den sags skyld) med laseren resulterer i spredning af lys fra denne forespørgsel punkt. Spredt lys kan detekteres i forlængelse af laser retning (forward scatter forbundet med størrelsen af ​​partiklen), samt vinkelret på dens retning (side scatter, afspejler granulosity af partiklen / celle). Disse førnævnte scatter egenskaber ikke kræver specifik mærkning, hvilket er grunden til en umærket prøve (eller også celleaffald, luftbobler, etc.) vil generere et signal (begivenhed) på bivariate forward scatter versus side scatter plot almindeligvis anvendes til indledende gating. Ved anvendelse af de passende lasere og filtre specifikke for den tilsvarende excitations- og emissionsspektre, kan en celle analyseres for positivitet, lysstyrkeniveau, eller fravær af fluorescerende markører. Størstedelen af ​​flowcytometrisk ansøgninger har fokuseret på karakterisering via celleoverfladeantigener. I modsætning til den hæmatopoietiske lineage har neurale afstamning forblevet mindre udstrækning defineret i henhold til overfladen epitop ekspressionsmønstre 5. En fordel ved at udnytte overfladeantigener er, at levende celler kan underkastes cellesortering paradigmer såsom FACS. I modsætning hertil intracellulær antigenfarvning kræver fiksering og permeabilisering skridt til at mediere epitop-antistof-interaktion, er til hinder for efterfølgende anvendelser, der kræver levedygtige celler. Notatet, stadig Herved vil for mange kvantitative analyser 14 og downstream analyser for RNA og protein-ekspression 15. Hæmatologi, immunologi og onkologi har ofte brugt mere end et dusin markører sammen for at definere bestemte subpopulationer 16. Derudover kan masse cytometri eller CyTOF nu bruges til at analysere op til 30 parametre samtidigt 17,18.

For neurale stamceller applikationer samt primære kulturer 14,19,20 heterogenitet celler ivitro er et almindeligt fænomen 21-23. Cellerne ikke repræsenterer målgruppen af interesse indebærer en potentielt forstyrrende element for eksperimentel udlæsning 24,25. Bekvemt, de forskellige cellulære delmængder stede i en heterogen cellesuspension bære forskellige (kendte eller endnu tydes) antigenekspression profiler, som kan anvendes til at definere de forskellige befolkningsgrupper. Flowcytometri kan derfor spille en afgørende rolle i løsningen af cellulær heterogenitet og dermed lette biomedicinske anvendelser (in vitro-assays, celleterapi) og optimere kvantitativ udlæsning ved at fokusere på de mest relevante delmængde 24,26. Forskellige overflade antigen kombinationer er blevet identificeret i løbet af de sidste par år for at tillade kvantificering og isolering af specifikke neurale celletyper. Dette omfatter CD133 til berigelse af neurale stamceller 27, en kombination af CD15 / CD24 / CD29 overfladeantigener til isolering af NSC, differentieringTed neuron og neurale crest celler 28 eller CD15 / CD24 / CD44 / CD184 / CD271 at isolere neurale og gliale delmængder 25, blandt andre signaturer 29,30. Beyond neuroner, gliale markører indbefatter A2B5 31, CD44 25. NG2 32 og GLAST 33. En nylig publikation har udnyttet midthjernen gulvpladen forløber markør CORIN 34,35 at berige for dopaminerge prækursorer i Parkinson-celle transplantation paradigmer 36. CD-molekyler er ikke kun markører, men funktionelt relevante mediatorer af celle-celle-interaktioner og i en celles evne til at reagere på signaler fra ekstracellulære matrixmolekyler og vækstfaktorer 37. En strategi om yderligere at styrke det arsenal af kombinatoriske CD-antigener til at karakterisere neurale afstamning udvikling er at bruge kendte intracellulære markører til at screene for og definere CD antigen kombinationer for en bestemt celletype af interesse. Vi har for nylig udnyttet en sådan tilgang og identificeret CD49f - / CD200 høje kombinatoriske udtryk mønstre som en ny tilgang til berigelse af neuronale delmængder fra neuralt differentierede induceret pluripotente stamceller dyrkningssystemer 38. Her inkluderer vi og diskuterer sidstnævnte protokol (og valgfrie variationer deraf), hvor overfladen farvning og intracellulær farvning kan anvendes samtidig til at definere neurale celle subpopulationer ved flowcytometri.

Figur 2
Figur 2. Blokdiagram over forsøgsprotokol muligheder. Figuren viser en skematisk gengivelse af de vigtigste trin i protokollen. Valgfri trin (CFSE farvestof eller intracellulære antigen mærkning) er angivet med lysegrå bokse. Efter høstning, er det vigtigt at vurdere levedygtigheden og celleantal af neurale cellesuspensioner før celleoverfladefarvning. Positive somsåvel som negative kontroller bør indgå i tillæg til de prøver af interesse. Prøverne kan analyseres ved flowcytometrisk analyse og / eller anvendes i celle sortering paradigmer. Klik her for at se en større udgave af dette tal.

Mens vi tidligere har brugt primære antistof i kombination med sekundært antistof til intracellulær farvning 38 vi nu indføre ikke-kovalent mærkning af det primære antistof via fluorescerende Fab-fragmenter (Zenon mærkning) som en lille variation, hvorved trinnene cellemanipulationsniveauet 39. Som et yderligere eksempel på protokollens alsidighed, vi ansætter en valgfri mærkning af en eksperimentel delmængde ved carboxyfluorescein succinimidylester (CFSE) før overflade antigen farvning. Sådanne CFSE pre-mærkning muliggør umiddelbar direkte sammenligning af to cellelinier eller eksperimentelle betingelser (CFSE-mærket vs. umærket) inden for en enkelt prøve rør, reducere variansen eller subtile forskelle i inkubationstid og spare antistof. CFSE er en etableret fluorescerende farvestof, der er almindeligt anvendt til cellesporing 40, i proliferation 41,42 og stregkodesystem eksperimenter 43,44. Endelig mens de faktiske sorterings- trin (FACS, immunomagnetisk celle separation eller immunopanning) er ikke en del af denne protokol, i princippet de høst- og mærkningsprocedurer her beskrevne gøre udbytte prøver, der kan udsættes til overfladen antigen eller intracellulære mærkning baseret sortering applikationer 15 25,28.

Med denne artikel, tilstræber vi at: sammenfatte en levedygtig overfladeantigen farvningsprotokol 25,28, opsummere en protokol til påvisning af intracellulære mål samt kombineret overflade og intracellulære antigen analyse 38, præsentere en intracellulær CFSE farvestof etikettering trin 41,45 som en eksperimentel mulighed for comkomparativ analyse af neurale cellepopulationer, og opsummere tilgange til flowcytometrisk analyse (passende kontrol 13,46, gating strategi og datapræsentation 47).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Neural Cell Høst

  1. Vurdering mikroskop:
    1. Før iværksættelse af et eksperiment, kontrollere status for kulturen med lyse-felt eller fasekontrastmikroskopi.
      BEMÆRK: Mens primær neurale væv fremstillet af dissektioner er i princippet lige så modtagelige for flowcytometrianalyse 14,28, bemærk venligst, at protokollen fokuserer på celler fra in vitro neurale cellekulturer.
  2. Høst celler 7:
    1. Skålen / kolbe af adhærente celler med Mg 2+ forsigtigt vaske / Ca2 + fri phosphatbufret saltvand (PBS) ved stuetemperatur (f.eks 5 ml for T75 kolbe, 3 ml per brønd i 6-brønds plade eller 10 ml 10 cm skål).
      BEMÆRK: PBS bruges i hele protokollen er Mg2 + / Ca2 + gratis.
      1. For video eksempel bruger en T75 kolbe af SH-SY5Y neuroblastomaceller ved 80% konfluens. Påfør yderligere vasketrin i tilfælde, hvorbetydelig vragrester er til stede i skålen.
      2. Overvej vaske med serum albumin-holdige PBS 48, Percoll eller Ficoll 49 centrifugering gradienter og / eller kommercielt tilgængelige perler 50,51. Fjernelse af myelin og andre lipid eller andre forurenende stoffer er kritisk, især når voksne primære vævskilder bliver brugt.
    2. Tilføj foropvarmet (37 ° C) trypsin udskiftning på et passende volumen, der dækker hele overfladen af ​​vævet dyrkningsbeholderen.
      BEMÆRK: Du kan også overveje Accutase eller andre enzymatiske fordøjelse muligheder. Denne kritiske skridt kan få negative virkninger overflade epitop-ekspression (se 7).
    3. Inkubér skålen / kolbe ved 37 ° C i 2 - 5 min (afhængig af celletypen) for at tillade celler at løsne. Bank forsigtigt på vævskultur fartøj eller flush med en serologisk pipette for at løsne cellerne. Undgå at fordøjelse (da dette kan forårsage celletab og størkning på senere trin).
    4. Quench trypsin udskiftning ved at tilsætte det dobbelte af volumen flow buffer (2% FBS i PBS) og indsamle cellerne i et 15 ml konisk rør.
    5. Udriv forsigtigt cellesuspensionen ved hjælp af en mikroliter pipette (100 - 1.000 pi) eller en 5 ml serologisk pipette for at fremstille en enkelt cellesuspension.
    6. Centrifugeres cellerne ved 220 x g i 5 min ved 25 ° C. Aspireres forsigtigt supernatanten forlader pellet bag.
    7. Resuspender pellet i et passende volumen af flow buffer, afhængigt af størrelsen af pellet (fx for en sammenflydende T75 kolbe SH-SY5Y celler typisk udbytte er mindst 10 x 10 6 celler, i hvilket tilfælde cellerne resuspenderes i 5 ml flow buffer).
      BEMÆRK: Hvis større klumper eller koagulation overholdes, filtreres gennem et 30-100 um mesh.
  3. Celletælling 52:
    1. Overfør en lille portion af cellesuspensionen til et mikrocentrifugerør og fortyndes på et defineret forhold i et volumen på trypan blå eller en alternativ levedygtighed farvestof før overførsel til et hæmocytometer eller automatisk celletælling system.
    2. Cellesuspensionen til en koncentration på 1 x 10 6 levedygtige celler / ml fortyndes ved tilsætning af det passende volumen af flow buffer eller PBS med 0,1% BSA (hvis fortsætter med CFSE mærkning).
      BEMÆRK: Propidiumiodid, 7-aminoactinomycin D, annexin V og kommercielt tilgængelige kan rettes levedygtighedsassay kits repræsenterer alternative muligheder for at vurdere levedygtigheden af ​​celler. Også apoptoseassays hjælp caspase-3 fluorescens som beskrevet tidligere 53 kan anvendes. Fluorescerende kanaler vil være "besat" af disse reagenser, som kan begrænse mulighederne for efterfølgende trin hvis inkluderet i alle prøver.

2. Intracellulær Dye Mærkning Brug CFSE (figur 3)

  1. Fortynd CFSE til en ønsket stamkoncentration, der let kan anvendes.
    BEMÆRK: Til disse forsøg en bestand koncentration af0,01 mm blev anvendt. Bestem den optimale arbejder koncentration af CFSE empirisk.
  2. Tilsæt 10 pi 0,01 mM CFSE opløsning pr ml celler (afsnit 1.3.2 koncentration på 1 x 10 6 celler / ml i PBS + 0,1% BSA) i en endelig koncentration på 0,1 uM. Kort vortex at blande godt.
    BEMÆRK: CFSE koncentrationer her anvendes, er omkring ti gange lavere end dem, der almindeligvis anvendes i proliferationsassays dermed celletoksicitet af farvestoffet er minimal. Vi har ikke observere negative virkninger på cellelevedygtighed.
  3. Der inkuberes i 5 minutter ved stuetemperatur med konstant rystning (200 rpm). Beskyt mod lys.
  4. Stands farvestoffet ved tilsætning af 5 volumener flow buffer til rørene. Centrifugeres ved 94 x g i 5 minutter ved stuetemperatur.
  5. Supernatanten forlader pellet bag. Resuspender cellerne med 5 volumener flow buffer.
  6. Centrifugeres ved 94 x g i 5 minutter ved stuetemperatur. Supernatanten fjernes, og genopslæmmes cellerne i flow buffer ved en koncentration på 1 x 10 6 celler / ml.
  7. Tilføj et lige antal ufarvede celler af interesse for den farvede celle suspension. Fortsæt til overfladen antigen farvningsprotokol (afsnit 3).

Figur 3
Figur 3. Påvisning af forskellen CD overfladeantigen ekspression mellem to cellelinjer via CFSE farvestof mærkning. SH-SY5Y neuroblastomceller er præ-mærket med CFSE for efterfølgende identifikation i sammenligning med umærkede BJ fibroblaster. Co-farvning af den blandede prøve (højre paneler) med overflademarkører CD24 eller CD54 (både konjugeret til APC) viser, at cellelinier er lette at skelne på grund af CFSE farvning (pile = SH-SY5Y, pilespidser = BJ fibroblaster). Størstedelen af ​​SH-SY5Y-celler udtrykker CD24, men ikke CD54 (ICAM-1). I modsætning hertil BJ fibroblaster (CFSE-negative) er positive for CD54, men stort set negativ for CD24."Https://www.jove.com/files/ftp_upload/52241/52241fig3highres.jpg" target = "_ blank"> Klik her for at se en større udgave af dette tal.

3. celleoverfladefarvning

  1. Label rør herunder prøver og kritiske kontroller (se tabel 1).
Tube no. Prøve navn Antigen-fluorophor Fortynding
1 Ufarvede celler -
2 Enkelt farvede CD24-APC 01:50
3 Enkelt farvede TUJ1-Alexa Fluor 488 nm 1: 2.000
4 Dobbelt farvede CD24-APC 01:50
TUJ1-Alexa Fluor 488 nm 1: 2.000
5 Enkelt farvede Sekundær kun: Alexa Fluor 488 nm 1: 2.000

Tabel 1. L ist af rør, der skal indgå i et typisk flowcytometri eksperiment. Tabellen viser et minimalt sæt prøverør, der kræves for en co-farvning eksperiment der er beskrevet i denne video artikel. En ideel eksperiment skal omfatte alle nødvendige kontroller (negative, positive såvel som kontroller kompensation) for præcis fortolkning af de opnåede resultater.

  1. Tilsæt 100 pi cellesuspension (fra afsnit 2.7 eller 1.3.2) til hver 1,5 ml mikrocentrifugerør.
    BEMÆRK: Sørg for, mindst 0,1 x 10 6 celler er til stede pr 100 pi cellesuspension.
  2. Tilføj fluorofor konjugeret antistof til prøven ved en passende fortynding.
    BEMÆRK: Bestem brugsfortynding for hvert antistof før forsøget. Se tabel 2 for en liste of neurale overfladeantigener.
Antigen Celletype Reference
CD15 Neurale stamceller [28, 67]
CD24 Neuronale celler [28, 68]
CD29 Neurale stamceller [28, 69, 70]
CD44 Gliaceller [25]
CD49f Neurale stamceller [38]
CD56 (NCAM) Neuronale celler [71]
CD133 Neurale stamceller [27]
CD184 Neurale stamceller og gliaceller [25]
CD200 Neuronale celler [38]
CD271 Neuralkam stamceller
A2B5 Gliaceller [31]
CORIN Dopaminerge forstadier [35, 36]
FORSE1 Neurale stamceller (NSC) [72]
GLAST Gliaceller [33]
NG2 Gliaceller [32]

Tabel 2. Valg af neurale overfladeantigener. Denne tabel viser en liste af overfladevand epitoper sig at blive udtrykt af forskellige neurale celletyper at eksemplificere den stigende panel af overfladeantigener til karakterisering af neurale afstamning. Bemærk, at dette valg er langt fra komplet, og at de fleste af disse markører er også udtrykt af en række andre neurale og ikke-neurale celler. Derfor vil kombinationer af flere markører være forpligtet til bedre at definere og isolere de angivne neurale delmængder.

    Inkuber i 30 minutter på en orbitalryster (200 rpm) i mørke.
  1. Flow buffer vask
    1. Der tilsættes 1 ml flow buffer til rørene. Centrifuger ved 380 x g i 4 minutter ved 4 ° C.
    2. Supernatanten forlader pellet bag.
  2. Gentag vasketrinet igen.
  3. Efter den anden vask, dekanter supernatanten og resuspender cellerne i flow buffer til et endeligt volumen på 100 pi.
  4. Brug prøve til flowcytometrisk analyse. Alternativt fortsæt med punkt 4 og 5.
    BEMÆRK: Hvis celler skal sorteres og sættes tilbage i kultur efter FACS (dvs. levedygtige celler suspension uden fiksering eller permeabilisering), gælder aseptisk teknik under høsten, farvning og analytiske trin.

4. Fiksering og Permeabilisering 38

  1. Fiksering hjælp paraformaldehyd (PFA):
    1. Forbered fiksering buffer indeholdende 2% PFA i PBS.
    2. Der tilsættes 500 pi fiksering puffer til 100 pi cellesuspension.
    3. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 15 minutter på en orbitalryster (100 rpm) i mørke.
  2. PBS vask:
    1. Tilsæt 1 ml PBS i røret. Centrifuger ved 380 x g i 3 minutter ved 4 ° C.
    2. Kassér / dekanter supernatanten forlader ca. 100 pi i røret.
  3. Permeabilisering med Tween-20:
    1. Forbered permeabilisering puffer indeholdende 0,7% Tween-20 i PBS.
    2. Der tilsættes 500 pi permeabilisering puffer til 100 pi cellesuspension.
    3. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 15 minutter på en orbitalryster (100 rpm) i mørke.
  4. Vask cellerne en gang med PBS (som beskrevet i afsnit 4.2), og fjern supernatanten fra rørene completely, så kun pellet bag.

5. Intracellulær antigenfarvning 38 (figur 4)

  1. Fremstilling af primært antistof opløsninger:
    1. Fortynd de primære antistoffer i fortyndingsbuffer indeholdende 1% bovint serumalbumin, 10% serum (f.eks normal æsel eller gedeserum) og 0,5% Tween-20 i PBS.
      BEMÆRK: Vælg den serum, der anvendes afhængigt af arten af ​​de sekundære antistoffer blev rejst i.
    2. Alternativt bruge Zenon fluorescein mærkning af det primære antistof i henhold til producentens anvisninger.
      1. Forbered 1 ug af primært antistof i PBS ved en passende fortynding (totalvolumen ≤ 20 pi).
      2. Tilsæt 5 pi Zenon fluorescein IgG mærkningsreagens (komponent A) til antistoffet opløsning.
      3. Inkuber blandingen i 5 minutter ved stuetemperatur.
      4. Tilsæt 5 pi Zenon blokerende reagens (komponent b) til reaktionsblandingen.
      5. Inkuberblandingen i 5 minutter ved stuetemperatur. Påfør antistoffet til prøven inden for 30 min.
  2. Primært antistof-farvning:
    1. Tilsæt 100 pi af det primære antistof løsning cellepelleten og forsigtigt udriv at blande.
    2. Alternativt tilføje Zenon fluoresceinmærket antistof til cellesuspensionen ved passende fortynding.
    3. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 30 minutter på en orbitalryster (200 rpm), beskyttet mod lys. Vask cellerne en gang med PBS (som beskriver i afsnit 4.2), og fjern supernatanten fra rørene helt, så kun pellet bag.
  3. Sekundært antistof farvning (ikke påkrævet for Zenon fluorescein mærkede antistoffer):
    1. Fortynd de sekundære antistoffer i PBS i en passende koncentration.
    2. Tilsæt 100 pi af det sekundære antistof løsning cellepelleten og forsigtigt udriv at blande. Inkuber rørene ved stuetemperatur i 30 minutter på et rysteapparat (200 rpm) i mørke.
  4. Vask prøverne to gange med PBS (som beskrevet i afsnit 4.2).
  5. Vask gang med flow buffer (se afsnit 3.5).
  6. Resuspender cellerne i ca. 150 pi flow buffer og analysere på flowcytometeret.

Figur 4
Figur 4. Co-farvning af overfladevand og intracellulære proteiner. Flowcytometri data eksemplificerer en sammenligning mellem primær + sekundær antistof-baserede versus Zenon fluorescein-baserede intracellulær farvning i kombination med overflade farvning. Eksklusiv positivitet på y-aksen (øverste venstre kvadrant) og x-aksen (nederste højre kvadrant) viser celler farvet for MAP2 og CD24 hhv. Efter co-farvning, kan deles MAP2 og CD24-ekspression ses i øverste højre kvadrant (højre paneler). Sammenligning af anvendelseAlexa Fluor 488. (Top; AF488) versus Zenon fluorescein (nederst) for MAP2 mærkning udbytter lignende resultater Klik her for at se en større udgave af dette tal.

6. flowcytometrisk analyse

  1. Conduct flowcytometrisk analyse umiddelbart efter afslutningen af ​​farvningsprotokol anvendelse af et flowcytometer med passende filtre til signaldetektering. Brug 488 nm blå og 640 nm rød laser med FL-1 (533/30), FL-2 (585/40), og FL-4 (675/25) båndpasfiltre.
  2. Opsætning primære porte baseret på fremad og sidespredning eksklusive snavs og døde celler.
  3. Sæt fluorescens porte til overfladen og intracellulære antigen til ≤0.5% baseret på de ufarvede prøver og kompensation for spektral overlapning bruger enkelte farvede kontroller.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Protokollen præsenteres her giver mulighed for alsidig eksperimentelle tilgange (Figur 2). I sin korteste version (trin 1, 3 og 6), kan det betragtes som en guide for simpel farvning af overfladeantigener. I sin mere kompleks form, kan en række co-mærkning paradigmer med en række af intracellulære antigener forfølges (valgfrit trin 2 og / eller 4 til 5). Desuden trin CFSE-mærkning eksemplificerer dens anvendelighed for celle mærkning / sporing af delpopulationer i celle-celle interaktionsundersøgelser eller flowcytometrisk Stregkodeprodukter eksperimenter (trin 2). Levedygtige cellepopulationer (opnået fra trin 2 og / eller 3) er egnede til cellesortering paradigmer (FACS) og nedstrøms analyse, herunder post-sortering cellekultur. På den anden side, den kombinerede intracellulære og overfladeantigen farvning (trin 3 til 5)giver analytiske udlæsning muligheder i sin egen ret. For eksempel identificerer co-lokalisering af visse cd-antigener på bestemte delmængder af neurale cellepopulationer (anvendes af os i Turaç et al 38 for at identificere CD49f -. / CD200 høje signaturer til neuronal FACS). Disse og andre eksempel neurale markører er angivet i tabel 2, hvoraf CD15, CD29, CD49f og FORSE1 er primært forbundet med neurale stamceller og CD24 og CD56 er rigelige på neuronceller. Mens nogle af disse markører er eksklusive, kan forskellige farvning intensiteter og multivariat udtryk analyse hjælpe med at identificere specifikke markør sæt til analyse og isolering af bestemte neurale subpopulationer.

Figur 3 eksemplificerer typiske resultater fra den kombinatoriske anvendelse af intracellulær farvestof og overfladefarvning. Dataene viser, hvordan to forskellige cellepopulationer nemt kan skelnes ina blandet prøve på grund af den forudgående mærkning af en af ​​populationerne. Her blev SH-SY5Y neuroblastomceller mærket med CFSE, og udviser fluorescens i den grønne kanal (FL1, y-aksen), der er klart adskilt fra den ufarvede anden population, i dette tilfælde BJ fibroblaster. Mens veletableret karakteristisk fibroblast (CD54) og neurale (CD24) markører er vist (til stede på deres respektive målgrupper FL2 eller FL4 fluorescens henholdsvis; x-aksen) analoge metoder kan udnyttes til at screene for yderligere uidentificerede antigener. Desuden kan virkningerne af celle-celle-interaktioner mellem to (eller flere) subpopulationer, der blev mærket til co-kultur eksperimenter forudgående blive undersøgt på denne måde.

Figur 4 viser de ufarvede SH-SY5Y-celler samt prøver farvet for CD24-APC og / eller det intracellulære neuronal MAP2 antigen (FITC kanal) efter fiksering og permeabilisering. Som sidstnævnte kan påvirke scatter egenskaber, baGGRUND fluorescens og overflade epitop farvning, plottene tjene til at dokumentere vedligeholdt overflade udtryk for neural CD24 efter intracellulær farvning. Desuden er co-lokalisering af neuronal MAP2 farvning på fraktionen CD24-positive vist. Det er afgørende for at sikre trofast påvisning af overfladeantigenet ved sammenligning med CD24 overflade-ekspression på levende celler. Desuden specificitet intracellulære opdagelse i baggrunden, ikke-specifikt antistof binding og autofluorescens skal bekræftes. Påvisning af intracellulære antigener via Zenon fluorescens-baserede eller primær + sekundær antistof-baserede strategier giver sammenlignelige resultater, som giver et rationale for at overveje dette mere tidsbesparende tilgang (springe trin 5.3). Når protokollen er robust og giver den kombinerede påvisning af en række overflade og intracellulære markører med begrænset baggrundsfluorescens, anbefales det at nøje overholde de inkubationstider og vasketrinforudsat i protokollen. Desuden er det tilrådeligt at analysere mindst tre uafhængige eksperimentelle gentagelser og at bemærke, at mærkning intensitet og overflade epitop stabilitet kan markør-specifikke og kan kræve yderligere optimering. Når de er etableret for et bestemt mål, på trods af mangler evnen til at analysere morfologiske træk, flowcytometrisk detektion af overfladevand og intracellulære antigener eller intracellulære antigener alene er kompatibel med konventionel fluorescensmikroskopi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Protokollen præsenteres her er veletableret for neurale cellekulturer afledt fra humane stamceller, men kan også anvendes til andre neurale celle kilder, herunder primært væv eller neurale cellelinier. Ud over embryonale kilder, kan neurale stam- eller progenitorceller ekstraheres fra den neurogene områder af voksne hjerne 27. Desuden flowcytometri og FACS kan udnyttes til at kvantificere, analysere og isolere forskellige cellepopulationer, herunder modne neuroner 54, astroglia 33, microglial 55, oligodendrocytter 56 eller endotelceller 57 fra postnatal hjernevæv.

Uanset kilden, at optimale betingelser for fiksering og permeabilisering behov bestemmes for hver celletype eksperimentelt, som overstiger et af de skridt, kunne føre til en massiv ændring af scatter egenskaber påvirker flowcytometrisk udlæsning. Effektivitet af protokollen afhænger også af stability af overflademolekyler skrive permeabilisering. Det skal bemærkes, at forskellige overflade-epitoper kan påvirkes af celle manipulation som en del af proceduren i varierende grader. Også enzymatisk høst med udskiftning eller Liberase-1 trypsin, for eksempel, kan påvirke en række celleoverfladeepitoper men i mindre grad i forhold til brugen af Accutase eller papain 7.

Specifikke epitoper kan blive påvirket af den samme behandling paradigme i varierende grad: mens VCAM-1 (vaskulær celleadhæsions protein-1; CD106) kan blive påvirket af høst, dissociation, fiksering og permeabilisering i en helt følsom måde, ICAM-1 ( intercellulært adhæsionsmolekyle-1; CD54) kan vise en mere robust udtryk mønster bevaret hele proceduren 58.

Mens tidligere enten overflade 25,28 eller intracellulære antigen etikettering 14 er blevet anvendt inden for neurobiologi paradigmer, metoder kombinerer både metoder 38 kan give nye neurale overflade antigen kandidater og give yderligere cytometrisk udlæsning muligheder.

Vi rutinemæssigt foretage overfladen farvning skridt forud for intracellulær antigen farvning og har brugt denne strategi at udvide vores sæt overflademarkører for neuropoiesis 38 ved hjælp af en række humane neurale cellelinjer. Titrering af antistoffer og inkubationstider skal optimeres for de respektive celletyper målepitoper og eksperimentelle paradigme. Ligeledes skal CFSE koncentrationen og mængden af ​​celler pr farvning optimeres for hver cellelinie, da ikke alle cellelinier plet i en identisk måde med den samme mængde CFSE koncentration.

CFSE har en peak excitation på 494 nm og peak emission 521 nm (grøn kanal FL-1-detektor), dermed enhver fluorescens afsmitning på andre kanaler skal kompenseres for at bestemme specifikke fluorescensemission. Alternative farvestoffer, såsom Cell Trace Violet (CTV), Cell Proliferation Dye eFluor 670 (CPD), Horizon V550, Horizon V450 er med held blevet afprøvet og testet til at blive brugt i stedet for CFSE 59,60.

I flowcytometri, er det vigtigt at bestemme den faktiske specifikke fluorescerende signal fra baggrunden. Derfor har de mest hensigtsmæssige kontrolforanstaltninger, som skal nøje udvalgt, og kan omfatte anvendelse af en ikke-neurale eller på anden måde negativ cellelinie at understrege antistofspecificitet (såkaldte interne negative kontroller 38,46). Autofluorescens af hver celle kilde skal tages i betragtning. Isotypekontroller kan betragtes stort set undværes i de fleste neurale detektion celle paradigmer 13,46.

I betragtning af den betydelige variation observeret i cellekultur (især dem, der stammer fra stamceller) og farvningsproceduren, anbefales kraftigt inddragelsen af ​​biologiske gentagelser. Det skal bemærkes, at brugen af ​​genetiske reportere er enanden måde at bruge neurale flowcytometri 61,62. For nylig Maroof et al. Brugte en Nkx2.1-GFP reporter tilgang til at sortere forskellige kortikale-lignende neuronale delpopulationer fra humane embryonale stamceller 63.

En up-and-coming område er repræsenteret ved udforskningen af neurale exosomer i biomedicinske så forskellige områder som tumor biologi og neurodegeneration 64, og flowcytometri af exosomer eller deres isolation ved perle assays giver vigtige redskaber for denne søgen 65. For relaterede video-protokol se 66.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
DMEM/F12 (1:1) (Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12) Life Technologies 11330057
DPBS without Ca2+ Mg2+ Life Technologies 14190169
Fetal bovine serum, qualified, E.U.-approved, South America origin (FBS) Life Technologies 10270-106
MEM Non-essential amino acids (100x) Life Technologies 11140035
TrypLE Express Life Technologies 12604013
Trypan blue solution, 0.4% Life Technologies 15250061
Paraformaldehyde Carl Roth 335.3
Bovine serum albumin (BSA) Fraction V PAA Laboratories, Coelbe K41-001
Tween-20 Detergent Calbiochem 655205
Carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) eBioscience 65-0850-84
DMSO AppliChem A1584
Bottle top filters express plus 0.22 µm, 250 ml Millipore SCGPU02RE
Cell culture treated flasks (T 25) NUNC 156367
Cell culture treated flasks (T 75) NUNC 156499
Conical tubes (15 ml) Greiner Bio-One 188271
Conical tubes (50 ml) Greiner Bio-One 227261
Pasteur pipet, glass (150 mm) STEIN Labortechnik, Remchingen S03710150
Pipet tips (0.1-10 µl) Corning 4125
Pipet tips (1-200 µl) Corning 4126
Pipet tips (100-1000 µl) Corning 4129
Serological pipets, 5 ml Corning 4051
Serological pipets, 10 ml Corning 4101
Serological pipets, 25 ml Corning 4251
Microcentrifuge tubes (0.5 ml) Sarstedt 72,699
Microcentrifuge tubes (1.5 ml) Greiner Bio-One 616201
Microcentrifuge tubes (2.0 ml) Sarstedt 72,695,500
Anti-Human CD24 APC monoclonal antibody eBioscience 17-0247-42 Working dilution 1:50
Anti-Human CD54 PE monoclonal antibody eBioscience 12-0549-42 Working dilution 1:50
Neuronal Class III β-Tubulin (Tuj1) polyclonal antibody Covance PRB-435P Working dilution 1:2,000
Alexa Fluor 488 Donkey anti Rabbit Life Technologies A21206 Working dilution 1:2,000
Zenon® Fluorescein Rabbit IgG Labeling Kit Life Technologies Z-25342
Neubauer-Improved counting chamber Marienfeld 0640010
Vortex Scientific Industries G560E
Thermomixer comfort Eppendorf 5355 000.001
Accuri C6 flow cytometer Becton Dickinson (BD) 653118
Microcentrifuge refrigerated, PerfectSpin 24 R Peqlab 91-PSPIN-24R
Orbital shaker, Unimax 1010 Heidolph 543-12310-00
Centrifuge refrigerated, Rotanta 96 RC Hettich 4480-50
Class II Biological safety cabinet Safe 2020 Thermo Scientific 51026640
CO2 Incubator, Heracell 240i Thermo Scientific 51026331
Vacuum system, Vacusafe comfort Integra Biosciences 158320
Microscope, Axiovert 40 CFL Zeiss 451212
Pipet controller, accu-jet pro Brand 26303
Micropipet, Pipetman neo P20N (2-20 µl) Gilson F144563
Micropipet, Pipetman neo P200N (20-200 µl) Gilson F144565
Micropipet, Pipetman neo P1000N (100-1000 µl) Gilson F144566

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Herzenberg, L. A., et al. The History and Future of the Fluorescence Activated Cell Sorter and Flow Cytometry: A View from. 48 (10), 1819-1827 (2002).
  2. Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Cytometry: today’s technology and tomorrow's horizons. Methods (San Diego, Calif). 57 (3), 251-258 (2012).
  3. Jaye, D. L., Bray, R. A., Gebel, H. M., Harris, W. A. C., Waller, E. K. Translational applications of flow cytometry in clinical practice). J. Immunol. 188 (10), 4715-4719 (2012).
  4. Henel, G., Schmitz, J. Basic Theory and Clinical Applications of Flow Cytometry. Lab Med. 38 (7), 428-436 (2007).
  5. Seita, J., Weissman, I. L. Hematopoietic stem cell: self-renewal versus differentiation. Wiley Interdiscip. Rev. Syst. Biol. Med. 2 (6), 640-653 (2010).
  6. Ulrich, H., Bocsi, J. Phenotypes of stem cells from diverse origin. Cytometry. A. 77 (1), 6-10 (2010).
  7. Panchision, D. M., et al. Optimized flow cytometric analysis of central nervous system tissue reveals novel functional relationships among cells expressing CD133, CD15, and CD24. Stem cells. 25 (6), 1560-1570 (2007).
  8. Meyer, R. A., Zaruba, M. E., McKhann, G. M. Flow cytometry of isolated cells from the brain. Anal. Quant. Cytol. 2 (1), 66-74 (1980).
  9. Junger, H., Junger, W. G. CNTF and GDNF, but not NT-4, support corticospinal motor neuron growth via direct mechanisms. Neuroreport. 9 (16), 3749-3754 (1998).
  10. McLaren, F. H., Svendsen, C. N., Vander Meide, P., Joly, E. Analysis of neural stem cells by flow cytometry: cellular differentiation modifies patterns of MHC expression. J. Neuroimmunol. 112 (1-2), 35-46 (2001).
  11. Wang, S., Roy, N. S., Benraiss, A., Goldman, S. A. Promoter-based isolation and fluorescence-activated sorting of mitotic neuronal progenitor cells from the adult mammalian ependymal/subependymal. 22 (1-2), 167-176 (2000).
  12. Tanke, H. J., vander Keur, M. Selection of defined cell types by flow-cytometric cell sorting. Trends Biotechnol. 11 (2), 55-62 (1993).
  13. Baumgarth, N., Roederer, M. A practical approach to multicolor flow cytometry for immunophenotyping. J. Immunol. Methods. 243 (1-2), 77-97 (2000).
  14. Sergent-Tanguy, S., Chagneau, C., Neveu, I., Naveilhan, P. Fluorescent activated cell sorting (FACS): a rapid and reliable method to estimate the number of neurons in a mixed population. J. Neurosci. Methods. 129 (1), 73-79 (2003).
  15. Ernst, A., et al. Neurogenesis in the striatum of the adult human brain. Cell. 156 (5), 1072-1083 (2014).
  16. Perfetto, S. P., Chattopadhyay, P. K., Roederer, M. Seventeen-colour flow cytometry: unravelling the immune system. Nat. Rev. Immunol. 4 (8), 648-655 (2004).
  17. Bandura, D. R., et al. Mass cytometry: technique for real time single cell multitarget immunoassay based on inductively coupled plasma time-of-flight mass spectrometry. Anal. Chem. 81 (16), 6813-6822 (2009).
  18. Bendall, S. C., et al. Single-cell mass cytometry of differential immune and drug responses across a human hematopoietic continuum. Science. 332 (6030), 687-696 (2011).
  19. Neveu, I., Rémy, S., Naveilhan, P. The neuropeptide Y receptors, Y1 and Y2, are transiently and differentially expressed in the developing cerebellum. Neuroscience. 113 (4), 767-777 (2002).
  20. Pruszak, J., Just, L., Isacson, O., Nikkhah, G. Isolation and culture of ventral mesencephalic precursor cells and dopaminergic neurons from rodent brains. Curr. Protoc. Stem Cell Biol. 2 (Unit 2D.5), (2009).
  21. Suslov, O. N., Kukekov, V. G., Ignatova, T. N., Steindler, D. A. Neural stem cell heterogeneity demonstrated by molecular phenotyping of clonal neurospheres. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99 (22), 14506-14511 (2002).
  22. Bez, A., et al. Neurosphere and neurosphere-forming cells: morphological and ultrastructural characterization. Brain Res. 993 (1-2), 18-29 (2003).
  23. Pruszak, J., Isacson, O. Molecular and cellular determinants for generating ES-cell derived dopamine neurons for cell therapy. Adv. Exp. Med. Biol. 651, 112-123 (2009).
  24. Carson, C. T., Aigner, S., Gage, F. H. Stem cells: the good, bad and barely in control. Nat. Med. 12 (11), 1237-1238 (2006).
  25. Yuan, S. H., et al. Cell-surface marker signatures for the isolation of neural stem cells, glia and neurons derived from human pluripotent stem cells. PloS One. 6 (3), e17540 (2011).
  26. Roy, N. S., Cleren, C., Singh, S. K., Yang, L., Beal, M. F., Goldman, S. Functional engraftment of human ES cell-derived dopaminergic neurons enriched by coculture with telomerase-immortalized midbrain astrocytes. Nat. Med. 12 (11), 1259-1268 (2006).
  27. Uchida, N., et al. Direct isolation of human central nervous system stem cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97 (26), 14720-14725 (2000).
  28. Pruszak, J., Ludwig, W., Blak, A., Alavian, K., Isacson, O. CD15, CD24, and CD29 define a surface biomarker code for neural lineage differentiation of stem cells. Stem Cells. 27 (12), 2928-2940 (2009).
  29. Peh, G. S. -L., Lang, R. J., Pera, M. F., Hawes, S. M. CD133 expression by neural progenitors derived from human embryonic stem cells and its use for their prospective isolation. Stem Cells Dev. 18 (2), 269-282 (2009).
  30. Golebiewska, A., Atkinson, S. P., Lako, M., Armstrong, L. Epigenetic landscaping during hESC differentiation to neural cells. Stem Cells. 27 (6), 1298-1308 (2009).
  31. Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells. Glia. 40 (1), 65-77 (2002).
  32. Nishiyama, A. NG2 cells in the brain: a novel glial cell population. Hum. Cell. 14 (1), 77-82 (2001).
  33. Jungblut, M., et al. Isolation and characterization of living primary astroglial cells using the new GLAST-specific monoclonal antibody ACSA-1. Glia. 60 (6), 894-907 (2012).
  34. Ono, Y., et al. Differences in neurogenic potential in floor plate cells along an anteroposterior location: midbrain dopaminergic neurons originate from mesencephalic floor plate cells. Development. 134 (17), 3213-3225 (2007).
  35. Chung, S., et al. ES cell-derived renewable and functional midbrain dopaminergic progenitors. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108 (23), 9703-9708 (2011).
  36. Doi, D., et al. Isolation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Dopaminergic Progenitors by Cell Sorting for Successful Transplantation. Stem Cell Reports. 2 (3), 337-350 (2014).
  37. Solozobova, V., Wyvekens, N., Pruszak, J. Lessons from the embryonic neural stem cell niche for neural lineage differentiation of pluripotent stem cells. Stem Cell Rev. 8 (3), (2012).
  38. Turaç, G., et al. Combined flow cytometric analysis of surface and intracellular antigens reveals surface molecule markers of human neuropoiesis. PloS One. 8 (6), e68519 (2013).
  39. Buchwalow, I. B., Böcker, W. Chapter 2. Immunohistochemistry: Basics and Methods. , 9-17 (2010).
  40. Tario, J. D., et al. Optimized staining and proliferation modeling methods for cell division monitoring using cell tracking dyes. J. Vis. Exp. (70), e4287 (2012).
  41. Lyons, A. B., Parish, C. R. Determination of lymphocyte division by flow cytometry. J. Immunol. Methods. 171 (1), 131-137 (1994).
  42. Hawkins, E. D., et al. Measuring lymphocyte proliferation, survival and differentiation using CFSE time-series data. Nat. Protoc. 2 (9), 2057-2067 (2007).
  43. Quah, B. J. C., Parish, C. R. The use of carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) to monitor lymphocyte proliferation. J. Vis. Exp. 44, (2010).
  44. Sukhdeo, K., et al. Multiplex flow cytometry barcoding and antibody arrays identify surface antigen profiles of primary and metastatic colon cancer cell lines. PloS One. 8 (1), e53015 (2013).
  45. Jiang, L., et al. Daucosterol promotes the proliferation of neural stem cells. The J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 140, 90-99 (2014).
  46. Hulspas, R., et al. Considerations for the control of background fluorescence in clinical flow cytometry. Cytometry. B. 76 (6), 355-364 (2009).
  47. Moloney, M., Shreffler, W. G. Basic science for the practicing physician: flow cytometry and cell sorting. Annals of Allergy, Asthm., & Immunology: Official Publication of the American College of Allergy, Asthma., & Immunology. 101 (5), 544-549 (2008).
  48. Siebzehnrubl, F. A., et al. Isolation and characterization of adult neural stem cells. Methods Mol. Biol. 750, 61-77 (2011).
  49. Guez-Barber, D., et al. FACS purification of immunolabeled cell types from adult rat brain). J. Neurosci. Methods. 203 (1), 10-18 (2012).
  50. Tham, C. -S., Lin, F. -F., Rao, T. S., Yu, N., Webb, M. Microglial activation state and lysophospholipid acid receptor expression. Int. J. Dev. Neurosci. 21 (8), 431-443 (2003).
  51. Nguyen, H. X., Beck, K. D., Anderson, A. J. Quantitative assessment of immune cells in the injured spinal cord tissue by flow cytometry: a novel use for a cell purification method. J. Vis. Exp. (50), e2698 (2011).
  52. Marchenko, S., Flanagan, L. Counting human neural stem cells. J. Vis. Exp. (7), 262 (2007).
  53. Brunlid, G., Pruszak, J., Holmes, B., Isacson, O., Sonntag, K. C. Immature and neurally differentiated mouse embryonic stem cells do not express a functional Fas/Fas ligand system. Stem Cells. 25 (10), 2551-2558 (2007).
  54. Brewer, G. J. Isolation and culture of adult rat hippocampal neurons. J. Neurosci. Methods. 71 (2), 143-155 (1997).
  55. Cardona, A. E., Huang, D., Sasse, M. E., Ransohoff, R. M. Isolation of murine microglial cells for RNA analysis or flow cytometry. Nat. Protoc. 1 (4), 1947-1951 (2006).
  56. Nielsen, J. A., Maric, D., Lau, P., Barker, J. L., Hudson, L. D. Identification of a novel oligodendrocyte cell adhesion protein using gene expression profiling. J. Neurosci. 26 (39), 9881-9891 (2006).
  57. Daneman, R., et al. The mouse blood-brain barrier transcriptome: a new resource for understanding the development and function of brain endothelial cells. PloS One. 5 (10), e13741 (2010).
  58. Gräbner, R., Till, U., Heller, R. Flow cytometric determination of E-selectin, vascular cell adhesion molecule-1, and intercellular cell adhesion molecule-1 in formaldehyde-fixed endothelial cell monolayers. Cytometry. 40 (3), 238-244 (2000).
  59. Quah, B. J. C., Parish, C. R. New and improved methods for measuring lymphocyte proliferation in vitro and in vivo using CFSE-like fluorescent dyes. J. Immunol. Methods. 379 (1-2), 1-14 (2012).
  60. Lathia, J. D., et al. High-throughput flow cytometry screening reveals a role for junctional adhesion molecule a as a cancer stem cell maintenance factor. Cell Rep. 6 (1), 117-129 (2014).
  61. Ganat, Y. M., et al. Identification of embryonic stem cell-derived midbrain dopaminergic neurons for engraftment. J. Clin. Invest. 122 (8), 2928-2939 (2012).
  62. Hedlund, E., et al. Embryonic stem cell-derived Pitx3-enhanced green fluorescent protein midbrain dopamine neurons survive enrichment by fluorescence-activated cell sorting and function in an animal model of Parkinson’s disease. Stem Cells. 26 (6), 1526-1536 (2008).
  63. Maroof, A. M., et al. Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells. Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).
  64. Chivet, M., Hemming, F., Pernet-Gallay, K., Fraboulet, S., Sadoul, R. Emerging role of neuronal exosomes in the central nervous system. Front. Physiol. 3, 145 (2012).
  65. Graner, M. W., et al. Proteomic and immunologic analyses of brain tumor exosomes. FASEB J. 23 (5), 1541-1557 (2009).
  66. Eldh, M., Lötvall, J. Isolation and characterization of RNA-containing exosomes. J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).
  67. Capela, A., Temple, S. LeX is expressed by principle progenitor cells in the embryonic nervous system, is secreted into their environment and binds Wnt-1. Dev. Biol. 291 (2), 300-313 (2006).
  68. Nieoullon, V., Belvindrah, R., Rougon, G., Chazal, G. mCD24 regulates proliferation of neuronal committed precursors in the subventricular zone. Mol. Cell. Neurosci. 28 (3), 462-474 (2005).
  69. Nagato, M., et al. Prospective characterization of neural stem cells by flow cytometry analysis using a combination of surface markers. J. Neurosci. Res. 80 (4), 456-466 (2005).
  70. Hall, P. E., Lathia, J. D., Miller, N. G. A., Caldwell, M. A., French-Constant, C. Integrins are markers of human neural stem cells. Stem Cells. 24 (9), 2078-2084 (2006).
  71. Hargus, G., et al. Differentiated Parkinson patient-derived induced pluripotent stem cells grow in the adult rodent brain and reduce motor asymmetry in Parkinsonian rats. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 107 (36), 15921-15926 (2010).
  72. Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22 (2), 152-165 (2008).

Tags

Neuroscience CD markører overfladeantigener intracellulære antigener flowcytometri neuroner gliaceller neurale stamceller fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) CD24 CD54 CFSE
Flowcytometri Protokoller for Surface og intracellulære Antigen Analyser af neurale Cell Typer
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., … More

Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow Cytometry Protocols for Surface and Intracellular Antigen Analyses of Neural Cell Types. J. Vis. Exp. (94), e52241, doi:10.3791/52241 (2014).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter