Minimalt invasiv teknik til injektion i Rat Optic Nerve

Introduction

Synsnerven giver et ideelt sted for centralnervesystemet (CNS) regenerativ forskning, herunder oftalmologiske forhold som optisk neuritis, grøn stær og traumer. Injektioner af en række stamceller har enten vist virkning eller vist lovende i at erstatte tabt myelin, øge axonal tælle og / eller forebyggelse af degenerative sygdomme. ^1,2

Den menneskelige synsnerven indeholder ca. 1,2 mio parallelle axoner rejser fra nethinden til chiasm med en diameter på ca. 3,0-3,5 mm. ³ For at modellere humane sygdomme i laboratoriet, er rotten blevet brugt hyppigt. Den voksne rotte synsnerve indeholder ca. 100.000 axoner inden for en diameter på ca. 0,5 mm. ⁴ En af de største begrænsninger i CNS regenerativ forskning er direkte udbenet adgang. Komplikationer og kirurgiske risici for dyret er højere, når kraniet eller ryghvirvler fjernes. Svarende til fordelene vedminimalt invasive metoder i rygsøjlen, ⁵ direkte optiske nerve injektioner uden at åbne kraniet tilbyder reduceret komplikationer og en hurtigere genopretning.

Denne teknik har været anvendt i tidligere undersøgelser. ⁶ I dette håndskrift og ledsagende video viser vi en minimalt invasiv procedure til at injicere stamceller i rotter synsnerve.

Protocol

BEMÆRK: Alle dyreforsøg blev godkendt af Johns Hopkins Animal Care og brug Udvalg. Anæstesiapparater kræver årligt eftersyn og kalibrering efter behov.

1. Anæstesi og Positionering

1. Anæstesi.
   1. Udfør alle kirurgiske procedurer under anæstesi med 2-3% isofluoran. Bekræft passende anæstesi ved tå pinch og vejrtrækning. Kontrollere, at rotten ikke vige som reaktion på en tå knivspids.
      BEMÆRK: En Flinch angiver anæstesi, der er for sent, og kan kræve længere anæstesi før start eller en højere isofluoran koncentration. En vejrtrækning mindre end 1 åndedrag hver 2 sek er for langsom angivelse af anæstesi er for høj og kan kræve lettelse af den isofluoran koncentration.
   2. Fastgør om nødvendigt dyr for at undgå hoved bevægelse under proceduren. Placer en dråbe af lidocain på den kirurgiske øje. Bruge kunstige tårer hver 10 min at forhindre tørhed, mens under anæstesi. Giveen injektion af buprenorphin på 0,01 mg / kg SC præoperativt og derefter hver 6-8 time efter behov.
2. Positionering.
   1. Placer rotter i en stereotaktisk ramme og holdes varm med en varmepude. Fugt hovedbunden pels med alkohol tage sig for at undgå udsættelse for øjnene. Brug sterile redskaber og steril teknik for at minimere risikoen for postoperative infektioner.

2. Eye Kontrol

1. Placer en 4-0 sutur i den laterale conjunctiva og binde det med nok sutur til at tillade blid trækkraft.

3. Dissektion

1. Initial Dissektion.
   1. Lav en ~ 1 inch incision i huden overliggende orbital højderyg anvendelse af en størrelse 10 skalpel som vist i figur 1. Træk huden og det underliggende fascie og omhyggeligt dissekere væk fascia. For at forhindre overdreven blødning i den kirurgiske, undgå at skære blodkar, mens dissekere fascia. Brug strategisk placed bomuld tips til at give hæmostase.
2. Dybere Dissektion.
   BEMÆRK: Med blid trækkraft på bindehinden trække øjet ned og ud af soklen, vil den overlegne orbital muskel komme til syne. For at blotlægge den optiske nerve, skal denne muskel skæres og retro-orbital fedt fjernet. Fedtstoffet kan kasseres, og bør ikke erstattes efter injektion. Fra dette punkt, bør synsnerven fascia være synlig som et bundt af synsnerven selv, sammen med blodkar indpakket i dura (figur 1).
   1. Lave et lille snit i dura hjælp af skalpel eller en 31 gauge nål affaset for at gøre piercing mindre traumatisk.

4. Pipette Injector

1. Træk et glas mikropipette til en diameter på 50-100 um. At skabe stabilitet, montere mikropipette på et mikromanipulator og tillægger en Hamilton-sprøjte forbundet til en infusionspumpe.
2. Træk perlerne (eller stamceller)rekonstitueret i en 0,5-1,0 pi volumen ind i mikropipette retrograd sammen med 0,5 pi volumen af ​​methyl blå opløsning før og efter.
   BEMÆRK: Et infusionshastigheden indstillet til 0,5-2 ul per min forhindrer traumer til synsnerven.

5. Injektion

1. Sænk spidsen af ​​mikropipette på synsnerven lige over nicked dura.
   BEMÆRK: En lille, men rask bevægelse af glasset spids ind synsnerven resulterer i mindst skade. Som infusionspumpen begynder, bør methyl blå farvestof fremhæve det område af det injicerede synsnerven. Farvestoffet skal forblive lokaliseret i synsnerven uden at lække ud i subarachnoidealrummet.
2. Følg det andet bånd af methyl blå at bestemme, hvornår stamcelle injektionen er afsluttet, og drej infusionspumpen sig og den anden dosis af methyl blå injiceres. Hold mikropipetten stadig inden synsnerven i 2 min for hver 1 pi volumen injiceret i at forhindre højpres udslyngning efter tilbagetrækning af mikropipetten.
   BEMÆRK: En alternativ metode er at forbinde pipettespidsen til en luft fyldt injektionssprøjte, der kan manipuleres manuelt. Uanset hvad, undgå overdreven kraft til at minimere skader på de optiske nerver. Vi anbefaler at indsprøjte ikke mere end 2 pi volumen i hvert synsnerven.

6. Opfølgning

1. Øjeblikkelig.
   1. Når injektionen er afsluttet, fjernes mikropipetten sammen med eventuelle bomuld tips bruges til at give hæmostase. Sutur huden med 3-0 silke og fjern konjunktival sutur.
   2. Hold rotter varme på en varmepude, indtil de kommer ud anæstesi. Lad ikke et dyr uden opsyn, indtil det har genvundet tilstrækkelig bevidsthed til at opretholde brystleje. Må ikke returnere et dyr, der har gennemgået operation for at selskab med andre dyr, indtil fuldt tilbagebetalt.
   3. Hvis dyret udviser tegn på smerte, herunder overdreven sløvhed, ataksi eller besværet Breathing, for passende analgesi med intramuskulær buprenorphin (0,05 mg / kg) op til tre gange dagligt.
2. Langsigtet.
   1. For den næste 24-48 timer, observere rotten for komplikationer ved kirurgi, herunder hævelse eller udflåd fra sår eller andre tegn på smerte, såsom vocalizing, foroverbøjet udseende, ikke-grooming, eller ikke spiser. Overveje samråd med en dyrlæge eller etisk eutanasi som nødvendigt.

Representative Results

Ved afslutningen af ​​eksperimentet blev rotterne aflivet og perfunderet med 4% paraformaldehyd. De optiske nerver blev omhyggeligt dissekeret og monteret til kryostat sektionering. Figur 2 viser et eksempel på en rotte hel synsnerve ved lav effekt, hvor Evans blåt farvestof blev injiceret for at visualisere webstedet. Pilen identificerer den præcise placering af injektionen. Denne dissektion blev gjort inden for et par min af injektionen som vist ved den begrænsede diffusion af farvestoffet ned nerven. Med andre injektioner, har vi observeret en langsom diffusion af farvestoffet i retning optikken chiasm i løbet af flere timer.

Figur 1:. Kirurgisk synsfelt Rotten placeret med at få adgang til den venstre øje i denne figur. En incision over den orbital højderyg og fascialvæv dissekeres ned bag øjet. En konjunktival sutur giver føreren mulighed for at anvende blid trækkraft, der trækker intrakraniel synsnerven til syne uden at åbne kraniet.

Figur 2:. Gross dissektion af injiceret synsnerven Utilizing Evans blåt farvestof, kan injektionsstedet hos synsnerven blive groft visualiseret under et dissektionsmikroskop. I dette billede, blev synsnerven skåret på injektionsstedet for at vise farvestoffet indlejret i synsnerven væv.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lewis rat	Charles River	4	Any rat strain will work.
Anesthesia machine	Surgivet	CDS9000	CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount
Infusion pump	Stoelting	53129
Dissection microscope	National Optical	409-411-1105
Fiber-optic light source	Fisher Scientific	12-562-21
Dissection and Stereotaxic Instrument	Stoelting	51400
Pipette Puller	Kopf	750
Pipettes	World Precision Instruments	18150-6
Disposable scalpel blades	Harvard Apparatus	810-15-021
Iridectomy scissors	Electron Microscopy Sciences	Uniband LA-4XF