Introduction
Synnerven är en idealisk plats för centrala nervsystemet (CNS) regenerativ forskning inklusive oftalmologiska tillstånd såsom optikusneurit, glaukom och trauma. Injektioner av olika stamceller har antingen visat effekt eller visat lovande resultat i att ersätta förlorad myelin, ökar axonal räkna och / eller förhindrande av degenerativa sjukdomar. 1,2
Den mänskliga synnerven innehåller cirka 1,2 miljoner parallella axoner reser från näthinnan till chiasm med en diameter på ungefär 3,0-3,5 mm. 3 Om du vill modellera mänskliga sjukdomar i laboratoriet, har råtta använts flitigt. Den vuxna råttan synnerv innehåller cirka 100 tusen axoner inom en diameter på ungefär 0,5 mm. 4 En av de huvudsakliga begränsningarna i CNS regenerativ forskning är direkt benfritt åtkomst. Komplikationer och kirurgiska risker för djur är högre när skallen eller kotor avlägsnas. I likhet med de fördelar somminimalinvasiva metoder i ryggraden, 5 direkta synnerven injektioner utan att öppna skallen erbjuder minskade komplikationer och en snabbare återhämtning.
Denna teknik har använts i tidigare studier. 6 I detta manuskript och medföljande video visar vi en minimalt invasiv procedur för att injicera stamceller i råttans synnerv.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
OBS: Alla djurförsök har godkänts av Johns Hopkins Animal Care och användning kommittén. Anestesiapparater kräver årlig kontroll och kalibrering vid behov.
1. Anestesi och positionering
- Anestesi.
- Utför alla kirurgiska ingrepp under bedövning med 2-3% isofluoran. Bekräfta lämplig nivå av anestesi genom tå nypa och andningsfrekvens. Kontrollera att råttan inte rygga tillbaka som svar på en tå nypa.
OBS: En flinch indikerar anestesi som är för sent och kan kräva längre anestesi innan du börjar eller högre isofluoran koncentration. En andningsfrekvens mindre än 1 andetag varje 2 sek är för långsam indikerar anestesi är för hög och kan kräva lättnader av isofluoran koncentrationen. - Säkra djuret som nödvändigt för att undvika huvudrörelser under förfarandet. Placera en droppe av lidokain på det kirurgiska ögat. Använd artificiella tårar var 10 min för att förhindra torrhet under narkos. Geen injektion av buprenorfin av 0,01 mg / kg SC preoperativt och sedan varje 6-8 h efter behov.
- Utför alla kirurgiska ingrepp under bedövning med 2-3% isofluoran. Bekräfta lämplig nivå av anestesi genom tå nypa och andningsfrekvens. Kontrollera att råttan inte rygga tillbaka som svar på en tå nypa.
- Positionering.
- Placera råttor i en stereotaktisk ram och hålla sig varm med en värmedyna. Blöt hårbotten päls med alkohol att ta hand för att undvika exponering för ögonen. Använd sterila verktyg och steril teknik för att minimera risken för postoperativa infektioner.
2. Ögon Kontroll
- Placera en 4-0 sutur i sidled bindhinnan och knyta den med tillräckligt sutur för att möjliggöra varsam dragkraft.
3. Dissektion
- Initial dissekering.
- Gör en ~ 1 tums snitt i huden som ligger över den kretsande åsen med användning av en storlek 10 skalpell såsom visas i fig 1. Dra in huden och den underliggande fascia och noggrant dissekera bort fascian. För att förhindra överdriven blödning i operations, undvika att skära blodkärl medan dissekera fascian. Använd strategiskt placed bomull tips att ge hemostas.
- Djupare Dissektion.
OBS: Med mild dragkraft på bindhinnan dra ögat ner och ut ur uttaget, kommer den överlägsna orbital muskler kommer i sikte. För att exponera den synnerven, måste denna muskel skäras och retroorbital fett avlägsnas. Fettet kan kasseras och bör inte ersättas efter injektionen. Från denna punkt, bör synnerven fascia vara synlig som en bunt av synnerven själv, tillsammans med blodkärl insvept i dura (Figur 1).- Gör ett litet snitt i dura med användning av skalpell eller en 31 gauge avfasad nål för att göra piercing mindre traumatiskt.
4. Pipettera Injektor
- Dra en glasmikropipett till en diameter av 50-100 pm. För att ge stabilitet, montera mikropipett på en mikromanipulator och binda till en Hamilton spruta kopplad till en infusionspump.
- Dra upp pärlorna (eller stamceller)rekonstitueras i en 0,5-1,0 il volym in mikropipett retrograde tillsammans med 0,5 | j, l volym av metyl blå lösning före och efter.
OBS: En infusionshastighet inställd på 0,5-2 il per minut förhindrar skada på synnerven.
5. Injektion
- Sänk spetsen på mikropipett på synnerven strax ovanför nicked duran.
OBS: En liten, men livlig rörelse hos glasspetsen i synnerven resulterar i minst skada. Eftersom infusionspumpen börjar bör metyl blått färgämne markera området av den injicerade synnerven. Färgen skall förbli lokaliserad inom synnerven utan att läcka ut i subaraknoidalrummet. - Följ det andra bandet av metyl blått för att avgöra när stamcells injektion är klar och vrid infusionspump ut som den andra dosen av metyl blå injiceras. Håll mikropipett fortfarande inom synnerven under 2 minuter för varje 1 il volym injiceras i att förhindra högttryckutkast vid uttag av mikropipetten.
OBS: En alternativ metod är att ansluta pipettspetsen till en luftfylld spruta som kan manipuleras manuellt. Hursomhelst, undvika överdriven kraft för att minimera skador på synnerverna. Vi rekommenderar att injicera högst 2 | il av volymen i varje synnerven.
6. Uppföljning
- Omedelbar.
- När injektionen är klar, ta bort mikropipett tillsammans med eventuella bomulls tips används för att tillhandahålla hemostas. Sutur huden med 3-0 silke och ta conjunctivae sutur.
- Håll råttor varma på en värmedyna tills de dyker upp från narkos. Lämna inte ett djur utan tillsyn tills den har återfått tillräckligt medvetande för att upprätthålla sternala VILA. Skicka inte tillbaka ett djur som har genomgått operation för att företaget av andra djur tills återhämtat sig helt.
- Om djuret uppvisar tecken på smärta, inklusive kraftig letargi, ataxi, eller arbetade breathing, administrera lämplig smärtlindring med intramuskulär buprenorfin (0,05 mg / kg) upp till tre gånger dagligen.
- Långsiktigt.
- För nästa 24-48 timmar, observera råttan för komplikationer av kirurgi inklusive svullnad eller utsläpp från såret eller andra tecken på smärta såsom vocalizing, böjd utseende, icke-grooming, eller inte äta. Tänk samråd med en veterinär eller etisk dödshjälp vid behov.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vid slutet av experimentet avlivades råttorna och perfuserades med 4% paraformaldehyd. Synnerverna noggrant dissekerades och monterad för kryostat snittning. Figur 2 visar ett exempel på en råtta hela synnerven vid låg effekt i vilket Evans blått färgämne injicerades för att visualisera platsen. Pilen identifierar den exakta platsen för injektionen. Denna dissektion gjordes inom ett par minuter av injektionen såsom indikeras av den begränsade diffusionen av färgämnet nedför nerven. I andra injektioner, har vi observerat en långsam diffusion av färgämnet mot synnerven chiasm under loppet av några timmar.
Figur 1:. Kirurgisk synfält Råttan placeras med att komma åt det vänstra ögat i denna figur. Ett snitt görs ovanför omlopps åsen och fascianvävnad dissekeras ned bakom ögat. En konjunktival sutur ger operatören möjlighet att tillämpa skonsam dragkraft som drar intrakraniell synnerven i sikte utan att öppna skallen.
Figur 2:. Brutto dissektion av injicerat synnerven Använda Evans blått färgämne, injektionsstället i synnerven kan grovt visualiseras under ett dissektionsmikroskop. I denna bild, den optiska nerven skuren vid injektionsstället för att visa färgämnet inbäddad i synnerven vävnaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Lewis rat | Charles River | 4 | Any rat strain will work. |
| Anesthesia machine | Surgivet | CDS9000 | CDS 9000 Small Animal Anesthesia Machine - Pole Mount |
| Infusion pump | Stoelting | 53129 | |
| Dissection microscope | National Optical | 409-411-1105 | |
| Fiber-optic light source | Fisher Scientific | 12-562-21 | |
| Dissection and Stereotaxic Instrument | Stoelting | 51400 | |
| Pipette Puller | Kopf | 750 | |
| Pipettes | World Precision Instruments | 18150-6 | |
| Disposable scalpel blades | Harvard Apparatus | 810-15-021 | |
| Iridectomy scissors | Electron Microscopy Sciences | Uniband LA-4XF |
References
- Dahlmann-Noor, A., Vijay, S., Jayaram, H., Limb, A., Khaw, P. T. Current approaches and future prospects for stem cell rescue and regeneration of the retina and optic nerve. Canadian journal of ophthalmology Journal canadien d'ophtalmologie. 45 (4), 333-341 (2010).
- Quigley, H. A., Iglesia, D. S. Stem cells to replace the optic nerve. Eye. 18 (11), 1085-1088 (2004).
- Ghaffarieh, A., Levin, L. A. Optic nerve disease and axon pathophysiology. International review of neurobiology. 105, 1-17 (2012).
- Fukui, Y., Hayasaka, S., Bedi, K. S., Ozaki, H. S., Takeuchi, Y. Quantitative study of the development of the optic nerve in rats reared in the dark during early postnatal life. Journal of anatomy. 174, 37-47 (1991).
- Celestre, P. C., et al. Minimally invasive approaches to the cervical spine. The Orthopedic clinics of North America. 43 (1), 137-147 (2012).
- Hallas, B. H., Wells, M. R. A Novel Technique for Multiple Injections into the Mammalian Optic Nerve. Kopf Carrier. 54, (2001).
- Harvey, A. R., Hellstrom, M., Rodger, J. Gene therapy and transplantation in the retinofugal pathway. Progress in brain research. 175, 151-161 (2009).
- Adachi-Usami, E. Optic neuritis--from diagnosis to optic nerve transplantation. Nippon Ganka Gakkai zasshi. 104 (12), 841-857 (2000).
- Slater, B. J., Vilson, F. L., Guo, Y., Weinreich, D., Hwang, S., Bernstein, S. L. Optic nerve inflammation and demyelination in a rodent model of nonarteritic anterior ischemic optic neuropathy. Investigative ophthalmology & visual science. 54 (13), 7952-7961 (2013).
- Zarbin, M. A., Arlow, T., Ritch, R. Regenerative nanomedicine for vision restoration. Mayo Clinic proceedings. 88 (12), 1480-1490 (2013).
