Isolasjon og immortalization av pasient-avledet cellelinjer fra muskelbiopsi for Disease Modeling

Protocol

MERK: Protokoller for innsamling av menneskelig vev må gjennomgås og godkjennes av Institutional IRB komiteen. Innsamling av kasserte, avidentifisert menneskelig vev har blitt godkjent av Boston Children Hospital og Brigham and Women Hospital IRB komiteer. Metodene som er beskrevet nedenfor er benyttet for isolering av myogeniske celler fra avidentifisert, forkastet vev. De beskrevne metoder er aktuelt for vev hentet fra samtykket pasientmateriale.

1. Cell Isolation

1. Dissosiasjon av muskelbiopsi og rensing av myogeniske celler
   1. Pre-veie en 10 cm vevskulturskål i en vev kultur biosikkerhet hette, og deretter re-veie platen inneholder muskelbiopsi for å beregne mengden av vev som skal dissosiert.
   2. Ved hjelp av sterile skalpeller, kjøttdeig muskelvev fint og tilsett noen dråper sterilt 1x HBSS å hindre vev tørker ut.
   3. Legg 3,5 ml av hver av dispase II og kollagenase D per gram muskelvev for å bli fordøyd. Pipetter hakket vev og enzym-oppløsning gjennom en steril 25 ml pipette et par ganger. Inkuber platen i en vevskulturinkubator ved 37 ° C med 5% _CO2 i 15 minutter og fordøye vev inntil slurryen lett passerer om en steril 5 ml pipette.
      MERK: Tissue dissosiasjon er vanligvis oppnås ved enzymatisk fordøyelse innen 45-90 min. Vennligst referer til 'Representative Results' seksjon for ytterligere detaljer.
   4. Tilsett 2 volumdeler sterilt vekstmedium til dissosiert vev, filter gjennom en 100 um cellefilter over et 50 ml konisk rør og pellets celler i 10 minutter ved 329 x g (~ 1100 rpm), romtemperatur. Vennligst referer til Materialer Table for media komposisjon.
   5. Resuspender pelleten i en volum sterilt vekstmedium og tilsett 7 volumer av røde blodcellelyseløsning. Filtrer løsningen gjennom et 40 um cellefilter, og deretter pellet than celler i 10 minutter ved 329 xg, romtemperatur.
   6. Tell cellene i et hemocytometer og resuspender cellene i HBSS 1x 0,5% BSA ved en konsentrasjon på 1 x 10 ⁶ celler / 100 ul. Sett til side ~ 250.000 celler i et enkelt rør som vil bli brukt som en negativ (uten flekker) kontroll. Sett til side flere ensfargede farget kontroll rør for propidiumjodid og for CD56, som er nødvendig for riktig separasjon av CD56 positive celler ved FACS sortering. Vennligst referer til celle sortering manualer eller ta kontakt med FACS sortering kjerne anlegget eksperter for å sikre hensiktsmessige kontroller er inkludert.
   7. Flekker cellene som skal sorteres med 5 ul / 10 ⁶ celler av anti CD56 antistoff. Inkuber alle prøvene (inklusive kontroller) på is i 30 min.
   8. Vaskeprøver i 10 ml 1 x HBSS og pellets celler i 10 minutter ved 329 x g (~ 1100 rpm) i en avkjølt sentrifuge, 4 ° C temperatur.
   9. Legg propidiumjodid ved en sluttkonsentrasjon på 1 ug / ml i prøven til å være sorted for utelukkelse av døde celler. Rense myogeniske CD56 positive celler fra ikke-myogeniske celler ved hjelp av fluorescens aktivert celle sorter.
2. Dissosiasjon av hudbiopsi
   MERK: Dermal fibroblaster kan isoleres fra en hud slag fra pasienter når muskelbiopsi er ikke tilgjengelige. Dermale fibroblaster kan brukes som biomateriale for mange studier, inkludert transduksjon med myod å generere myogeniske celler. I tillegg kan dermale fibroblaster blir brukt til å generere iPS celler, som kan differensieres i forskjellige celletyper for videre studier.
   1. Transporter hudbiopsi til laboratoriet i transport medium. Når prøven er mottatt, utfører den primære kultur så snart som mulig. Hvis den primære kultur ikke kan etableres på samme dag, lagre prøven ved romtemperatur over natten.
   2. Overfør hudbiopsi til et sterilt 35 mm petriskål i laminær hette.
   3. Skyll huden biopsi i en petriskål med sterile 1x PBS for å fjerne blod og smuss. Fjern fettvev med en steril skalpell.
   4. Tilsett 2 ml kollagenase løsning og hakke vevet med skalpell, inkuberes ved 37 ° C i 45 minutter til 1 time, avhengig av størrelsen av vevet.
   5. Overfør spaltet vevet til et 15 ml konisk rør, skylle petriskål med 2 ml fibroblast kulturmedium to ganger, og samle mediet i samme rør.
   6. Pelletere cellene ved 200 xg i 5 minutter ved romtemperatur.
   7. Kast supernatanten og pelleten vaskes med 3 ml fibroblast medium for å fjerne kollagenase, deretter pellet celler på nytt. Vennligst referer til Materialer Table for media komposisjon.
   8. Gjenta trinn 1.2.7 en gang til.
   9. Re-suspendere pellet i 5 ml fibroblast medium og plateceller på en T25 steril vevskulturkolbe. Inkuber i kolben ved 37 ° C med 5% _CO2.
   10. Vurdere kultur for fibroblast vedlegg og vekst over de neste 1-3 dagene. <br /> MERK: Noen små vev stykker kan også legge til plate og fibroblaster migrere ut av disse vev stykker.
   11. Opprettholde kulturen under de samme vilkår inntil fibroblaster er vokst til ca 80% samløpet.
   12. Samle fibroblaster ved trypsinering og overføre til ferske kulturflasker for ytterligere ekspansjon. Utføre trypsinisering ved vasking av kulturene 3 ganger i 1 x PBS uten Ca ⁺⁺ og Mg ^++. Legg Trypsin-EDTA (se Materialer tabell) til cellene (2 ml / T25 kolbe) i 2 minutter ved 37 ° C.
   13. Splitte frittliggende celler inn flere flasker. Hvis noen vev stykker forbli festet til de opprinnelige T25 kolber, tilsett 5 ml frisk kultur medium til denne kolbe og flere fibroblaster vil migrere ut kontinuerlig.
       NB: Den ekspanderte fibroblast kulturen kan være frosset ned som P1 og lagret i flytende nitrogen for fremtidige eksperimenter.

2. immortalization av myogenic Cells

1. Mateceller 30 min før transfeksjon med 5 ml friskt medium supplert med 10 mM kaffein.
2. Homogenisere en blanding av 2 pg av plasmid DNA fra en midi-prep (CDK4 eller hTERT-plasmid) og PolyJet og inkuber ved romtemperatur i 15 min, som anbefalt av produsenten.
3. Legg plasmidet / PolyJet blandingen til PE-celler over natten.
4. Strøm celler med friskt medium (DMEM medium og 199 i et forhold på 4: 1, supplert med 10% kalveserum). Tolv timer senere, samler den virusholdige supernatant og filtrere den gjennom et 0,45 um porestørrelse filter.
5. Bruker 1 ml av supernatanten oppsamlet å infisere over natten amfotropisk pakkende cellelinje PA317 ⁵ og oppnå en stabil virus-produserende cellelinje etter valg med enten 0,5 mg / ml neomycin (G418) for CDK4 eller 0,5 mg / ml hygromycin for hTERT.
6. Forberede arbeider virussupernatantene ved å dyrke de stabile emballasje celler til nær confluency, deretter høste supernatanten hver morgen, kveld og morgen for tre avlinger.
7. Filtrere virussupernatantene og enten direkte bruke eller dele dem inn i en ml porsjoner og oppbevar ved -80 ° C for senere bruk. Merk at viral supernatant mister 50% infeksjon effektivitet med hver fryse-tine. Husk å bleke-vask før du kaster alt som har rørt ved viruspartikler.
   MERK: Den stabile PA317 virusproduserende cellelinje kan fryses og vedlikeholdes ved -150 ° C for permanent lagring (frysing medium er 10% DMSO, 90% Serum).
8. Plate FACS-rensede myogeniske celler (beskrevet i trinn 1.1 til 1.9) i en tetthet på 5 x 10 ⁴ celler / brønn på 6-brønners plater belagt med 0,1% gelatin. Sikre at cellene er festet til platen før man går videre med den virale infeksjon.
9. Legg 400 mL filtrert, freshly produsert viral supernatant eller frosne porsjoner til hver seks-brønns plate over natten (holde to brønner som kontroller).
10. Endre medium ved å mate cellene med 2,5 ml / brønn av friskt muskel media (4: 1 Dulbeccos modifiserte Eagle medium (DMEM) og Medium 199 supplert med 15% føtalt bovint serum, 0,02 M HEPES buffer; 1,4 mg / l vitamin B12, 0,03 mg / L ZnSO4, 0.055 mg / l deksametason, 2,5 ug / l hepatocytt vekstfaktor og 10 ug / L basic fibroblast growth factor). Kast media og pipetter inneholder viruspartikler i et blekemiddel container. La celler i samme medium for tre dager å komme seg fra infeksjon, og deretter behandle for valg med enten 400 mikrogram / ml neomycin (CDK4 infeksjon) eller 300 mikrogram / ml hygromycin (hTERT infeksjon).
11. Opprettholde celler under medikamentseleksjon inntil cellene i kontroll fatet dysen (1-2 uker).
12. Passage celler før de blir sammenflytende (60-80% confluency, bruker 0,05% trypsin EDTA), selv under selectipå perioden. Replate celler i flere 10cm retter med fersk myoblast medium (som beskrevet i 2.11) supplert med utvalget narkotika. Oppretthold immortaliserte valgte celler som en heterogen populasjon eller klone å oppnå en fullstendig homogen genetisk bakgrunn (samme innsetting av transgenet i hver celle).
13. Utføre klonal seleksjon ved å gjøre følgende:
    1. Seed cellene ved lav tetthet (for eksempel 300 til 500 celler i 10 cm skåler) og opprettholde dem i omtrent to uker, inntil små kolonier er dannet (10-20 celler).
    2. Fjern mesteparten av mediet på dette punktet, slik at bare en tynn film for å hindre at cellene fra å tørke ut.
    3. Plasser en kloning ring (med den ene enden dyppet i silikon vakuum fett) over hver ønsket klone og tilsett noen dråper trypsin / EDTA.
    4. Høste celler når de blir rundet av nøye aspirere cellene ved hjelp av en 1 ml tip eller en Pasteur pipette og overføre dem til den minste tilgjengelige multiwell plate (96 eller 48, 24 eller 12 brønns plater).
    5. Utvide kloner som nødvendig for å hindre lokal konfluens.

Representative Results

Figur 1 viser noen av de viktigste trinnene involvert i primærvev dissosiasjon: den nøyaktige mengden vev veies i et sterilt vev kultur petriskål (figur 1A, B). Vevet ble deretter finfordelt ved hjelp av sterile skalpeller, inntil en vev oppslemming oppnås (figur 1C, D). Etter tilsetning av fordøyelsesenzymer, er primære muskelvev dissosiasjon vanligvis oppnås ved enzymatisk nedbrytning i løpet av 45-90 min. Progresjonen av vev fordøyelsen blir typisk overvåket hver 15-20 min for å hindre overdigestion og celledød. Den enzymatiske fordøyelsen kan være forsiktig pippetert og blandet et par ganger hver 15-20 min. Ved slutten av digereringstrinnet, blir cellene filtrert gjennom et 100 um (figur 1E, F), og deretter et 40 um filter. Avhengig av mengden av utgangs muskelvev og om prøven er hentet fra mildt eller alvorlig rammede muskler, det dissosierte primære cells vil være heterogen. Fig 1G viser et eksempel på mononukleære celler i suspensjonen umiddelbart etter fordøyelsen, mens figur 1 H viser et eksempel på dissosierte primærceller 3-6 timer etter fordøyelse og platekledning i vevskulturskåler. Myogeniske celler vil vanligvis bli blandet med fibroblaster og adipogenic celler. Immunceller kan også være tilstede i de tilfeller hvor betennelsen er forbundet med pasientens sykdom. Derfor kan prospektiv separasjon av de forskjellige celletyper være ønskelig. For potensielle isolering av menneskelige myogeniske celler, har CD56 eller N-CAM vært mye brukt som en pålitelig markør ^6-9. Dette rensing kan være gunstig kort tid etter isolering for anriking av myogeniske stamfedre og før cellen immortalisering prosessen. Alternativt kan immortalisering av primære celler som skal utføres først, kan deretter udødeliggjorte myogeniske celler velges på grunnlag av ekspresjon av CD56 ved FACS. En skjematisk påtrinnene som er nødvendig før FACS sortering og et eksempel på en FACS-profil er illustrert i figur 2. I korthet er primære celler tellet og resuspendert ved høy konsentrasjon som antydet, da det primære antistoff (dvs. anti CD56) ble tilsatt til cellene og inkubert i 30 minutter på is. Etter en vask, blir cellene analysert gjennom en fluorescens-aktivert cellesorterer og renset (figur 2) .Den omtrentlig utbytte på CD56-positive celler varierer fra prøve til prøve, fra 40-70% av de totale mononukleære celler. Avkastningen varierer avhengig av alderen til den enkelte og om myogeniske celler er hentet fra upåvirket eller syk muskel. Upåvirket muskel har vanligvis høy prosentandel av myogeniske celler, mens dystrofiske muskel ofte har lavere prosentandeler av CD56-positive celler. De rensede celler blir sådd ut i fullstendig myogenisk vekstmedium (se Materialer tabell). Celler kan bli passert ved trypsinering når de Reach 60-70% samløpet. CD56 uttrykkende celler er myogenisk og i stand til å danne myotubes in vitro ^10,11 sikret immortalisering av celler myogeniske krever sekvensiell transfeksjon av to gener ^12,13 (som skjematisk vist i figur 3). Cyklinavhengig kinase 4 (CDK4) blir brukt til å overvinne belastningen fra vevskultur på grunn av utilstrekkelig dyrkningsbetingelser, og human telomerase revers transkriptase (hTERT) hindrer telomerer forkortes på grunn av den endereplikafenomenet ^12. Både pre-viral plasmider er i pBAbe ryggrad vektor. Musen CDK4 cDNA konstrukt inneholder neomycin-resistensgenet og hTERT cDNA-konstruksjonen inneholder hygromycin-resistensgenet. Den sistnevnte inneholder også et Herpes Simplex Virus tymidin kinase (TK) kassett og loxP-seter anbrakt i begge ender av hTERT / TK kassett. Dette gjør at fjerning av hele uttrykket enheten etter Cre rekombinase ¹⁴ og mot valget med gancyclovir.

Nylig immortaliserte celler kan opprettholdes som en populasjon hvor virusene er integrert på forskjellige steder, eller klonet, for å oppnå en fullstendig Homogenic genetisk bakgrunn (enkel innsetting i cellegenomet og dens avkom). I de fleste tilfeller å isolere kloner fra et hoved befolkning vil resulterer i små forskjeller mellom kloner avhengig av innføring av kassetten i cellegenomet. I tillegg vil omfattende vevskultur favorisere valget av celler med vekstfordel fremfor de som skiller. Jegsolation av enkelt kloner gjøres ganske enkelt ved såing celler ved lav tetthet (f.eks: 300 til 500 celler i 10 cm retter) og dyrke for ca to uker til små kolonier dannes (10-20 celler). Mesteparten av mediet blir deretter fjernet, slik at bare en tynn film for å hindre at cellene fra å tørke ut. Kloner trypsinisert bruker kloning ringer og deretter utvides etter behov. Utvidet immortaliserte kloner kan bli testet for ekspresjon av vanlige myogeniske celle markører, så som CD56 ved FACS, desmin og myod ekspresjon ved immunofluorescens eller myotube dannelse ved differensiering. Myotubes er mest tydelig når myogeniske konfluente celler (90% konfluens) er plassert i differensieringsmedium (DMEM medium og 199 i et forhold på 4: 1, supplert med 2% hesteserum) etter 3-5 dager (figur 4). Ingen forskjeller ble observert i myotube formasjonen og i myotube sammentrekning evne mellom ikke-immortaliserte kontrollceller og udødeliggjorte celler (Video 1 og 2).

(figur 5). Eksempler på vekstkurver er vist i figur 5A, hvor telomerer forkortes ble observert som celler ble ekspandert for utvidet antall passasjer. Omvendt er vellykket immortalisering assosiert med øket telomerase-aktivitet (figur 5)

Figur 1:.. Illustrasjoner av kritiske trinn for dissosiasjon av primære humane muskelvev (A) med en vekt av den tomme kulturplaten, før vevet plassering og (B) etter plassering av vevet (C) Sterile skalpeller brukes til å hakke vev, til (D) i vevet detselv er redusert til en oppslemming. Kollagenase og dispase tilsettes og vevet er fordøyet etter 45-90 min, deretter fordøyelsen blir filtrert gjennom et nylonnett filter for å kaste avfall (E, F). (G, H) som eksempler på ferskt dissosierte cellene sådd umiddelbart etter dissosiasjon (G ) eller 3 timer etter dissosiasjon, når primærceller begynner å slå seg ned (H).

Figur 2:. Arbeidsflyt av prosedyrer involvert i menneskelig myoblast flekker før rensing via fluorescens aktivert celle sorter De kritiske trinn for farging av humane celler før FACS analyse er uthevet. Eksempler på FACS tomter er også vist. Den negative kontroll (venstre panel) blir brukt til å etablere sorterings porten. I de rette paneler, er positive celler som uttrykker CD56 gated og Percentage av positive celler er vist. Denne strategi kan bli anvendt for å rense myogeniske celler enten før eller etter immortalisering immortalisering prosedyre.

Figur 3: Skjematisk av virusproduksjon for myoblast immortalization. Arbeidsflyten til retrovirus produksjonen brukes til å forevige myoblaster. En plasmidkonstruksjonen inneholder enten CDK4 eller floxed hTERT-TK kassett i en pBabe ryggrad (til venstre) blir transfektert inn i Phoenix ekotropisk (PE) emballasje cellelinje over natten (8-12 timer) ved hjelp PolyJet. Supernatanten overføres deretter etter filtrering på Phoenix amfotropisk pakkende cellelinje (PA317). Supernatanten fra disse celler kan anvendes enten direkte eller cellene kan velges med enten neomycin eller hygromycin å generere en stabil cellelinje for fremtidig bruk. Alikvoter av filtket Supernatanten kan lagres ved -80 ° C for senere bruk (med en tapt på 50% effektivitet). Blekemiddel brukes til å rense hver forbruks brukes på alle punkter av prosedyren.

Figur 4:. Skjematisk av reversibel myoblast immortalization Arbeidsflyt av immortalization prosedyre (øverst): Primære celler er først transfektert med CDK4. Etter Neomycinseleksjon blir myoblaster transfektert med en floxed hTERT kassett som inneholder to valg spisser; HSV-TK og Hygromycin. Dersom det er ønskelig på et senere tidspunkt, kan det hTERT kassetten "floxed" ut ved å uttrykke Cre rekombinase og velge for eksisjon med gancyclovir. Dette gjør at "re-mortalization" av myoblaster og gjenoppstart av telomerer forkortes. Hvis telomerer er 20 kb lang, likevel tillater dette hundrevis av doublings, og unngår t han komplikasjon av over-uttrykk for hTERT. Endelig kan isogene kloner fra den udødelig populasjon isoleres. Den myogenicity av de nylig udødelig celler kan vises ved hjelp av spesifikke markører for muskelceller som desmin (nederst til venstre panel, celler i vekst medium farget med anti-desmin, klone D33, grønn). Denne klonen er så myogenic at differensierte celler blir sett selv om cellene er opprettholdt i spredningsforhold. Når cellene er differensiert i differensiering medium (med 2% hesteserum, midtre og høyre panel) myotube formasjon blir svært omfattende. Nesten alle celler farget med MF20 antistoff til embryonale myosin tung kjede (grønn) og myotubes har flere kjerner av DAPI farging (blå, alle bildene). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

les / ftp_upload / 52307 / 52307fig5highres.jpg "/>
Figur 5: Verifisering av immortalisering prosedyre. (A) Vekstkurver av isogene kloner fra primær myoblast, udødelig befolkningen (myoblast hTERT-CDK4) og re-mortalized klone (Myoblast floxed hTERT-CDK4) er vist som eksempler. Ingen forskjeller i vekstrater var påvisbare før cellene når senescence. Telomerer forkortes ble overvåket som en funksjon av befolknings doublings og telomerlengde ble målt ved TRF. (B) TRF vist er eksempler på tidlige tidspunkter og sent replikering i myoblaster (5 tidspunkter fra PD 13-75), re-mortalized myoblaster etter hTERT eksisjon (3 tidspoeng fra PD 62-152) og udødelig myoblaster (PD 75 og 200). (C) Vellykket hTERT infeksjon settes til en økning i telomerase aktivitet. Telomerase-aktivitet ble vurdert ved ddTRAP (ddTRAP avlesning, rett, kvantifisering av analysen, venstre) ¹⁵ i celler før og etter hteRT infeksjon. hTERT eksisjon avskaffet telomerase-aktivitet til den opprinnelige terskel sett i myoblaster. Resultatene er vist som totale telomerase produkter generert per celle tilsvarende (bakgrunn korrigert). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Vennligst klikk her for å se denne videoen.
Vennligst klikk her for å se denne videoen.

Videoer 1 og 2. Myotubes ble samlet inn celler før og etter immortalization prosessen. Celler ble dyrket til konfluens i vekstmedier og byttet til differensiering materiale i 10 dager. I begge videoene, funksjonelle sammentrekninger av en eller flere myotubes kan påvises. Innspillingen av den spontane rykningerble gjort ved hjelp av en 20X objektiv. Ingen forskjeller ble observert mellom udødeliggjort og ikke-immortaliserte celler.

Discussion

Celler som en nyttig ressurs

Isolering og kultur myogeniske celle populasjoner er svært nyttig ved etablering sykdoms fenotyper eller in vitro modeller av sykdom. Myogenisk celleisolasjon fremgangsmåte som er beskrevet her tillater isolering av myoblaster og fibroblaster fra skjelettmuskelprøver, som deretter kan formeres, differensierte, eller umiddelbart analysert. Myoblast struktur og funksjon kan vurderes gjennom mikroskopisk undersøkelse, vurdering av celleoverlevelse, evaluering av cellefusjon, eller gjennom molekylære studier av RNA eller protein uttrykk. I tillegg kan myoblaster bli differensiert i myotubes som deler mange funksjoner i umodne myofibers, som lar den direkte vurdering av myoblast funksjon i sammenheng med muskelutvikling og restitusjon etter vevsskade. Mens alle disse fenotyper en tendens til å være ganske reproduserbar i tidlige passasjer av myogeniske celler, oppførselen til flere primære myogenic cellelinjer kan bli endret i løpet av mange passasjer. Som et resultat, er det noen ganger ønskelig å udødeliggjøre en gitt myogenisk cellelinje (som beskrevet her), som kan legge til rette for enkel kultur etablering og generering av reproduserbare resultater over et lengre tidsrom.

Utvalg av spesifikke cellepopulasjoner

Denne protokollen beskriver isolering av myogeniske celler fra skjelettmuskulatur vev ved hjelp FACS som en renselse ordningen. Den foreslåtte strategi for valg av celler inkluderer bruk av propidiumjodid (en indikator av døde celler) og CD56 (en markør for myogeniske celler) for å skille levende, myogeniske celler fra døde celler, rusk, og ikke-myogeniske celler. Celler som finnes i CD56 positive befolkningen vil omfatte myogeniske stamfedre stand til å danne myotubes, mens CD56-negative befolkningen vil omfatte ikke-myogeniske celler, inkludert fibroblaster og muligens adipogenic celler. Hver av disse fraksjonene kanvære uavhengig dyrket for å produsere cellekulturer fra myoblaster eller fibroblaster, og muligheten for å etablere parallelle fibroblast-cellekulturer kan være nyttig for uavhengige celler eller DNA-bank øvelser eller som ekstra kontrollforhold for analyser blir utført på myogeniske cellekulturer. Det finnes flere andre alternativer for valg av spesifikke myoblastic og fibrinoblast cellekulturer fra fordøyd muskelvev, i tilfeller hvor FACS sortering er uønsket eller utilgjengelig, som er beskrevet andre steder ^16,17. En alternativ metode for å separere myoblastic og fibrinoblast celler innebærer bruk av differensial vedheftingsegenskaper mellom disse to celletyper for å anrike suksessive passasjer av celler for en gitt celletype. Som fibroblaster følge plast mye lettere enn myoblaster, slik at cellesuspensjoner å ruge på plast i ca 1 time ved etablering eller passering cellene og deretter plating supernatanten på en annen tallerken vil result i fjerning av mange fibroblaster fra cellesuspensjonen ^18.

Nytten av Fibroblaster vs. myoblaster

Muskel biopsier fra pasienter er vanligvis brukt for rensingen av primære muskelceller, men syke myoblaster kan ikke spre seg effektivt, og kan bare gjennomgå noen få antall avdelinger in vitro, noe som krever celle immortalisering for å nå det høye antall avdelinger som er nødvendige. Gitt at begge fibroblaster og myoblaster kan isoleres fra muskelbiopsi, bør begge cellefraksjoner bli frelst fra pasientprøver, som de kan både være nyttig og gir mye allsidighet for nedstrøms applikasjoner. For eksempel kan fibroblaster brukes for generering av induserte pluripotente stamceller (iPSCs), som holder mye løftet for å generere ubegrenset celle tall og potensiale til å bli indusert til å differensiere til flere celle linjene. Disse funksjonene er svært ønskelig for celler hentet fra pasients med sjeldne sykdommer, som kan potensielt bli korrigert in vitro eller brukes i eksperimentelle narkotika screenings i søk etter terapeutiske forbindelser. Udødelig myoblaster kan også brukes i narkotika-basert screening. Fibroblaster kan også være effektivt omdannes til en myogenic skjebne ved infeksjon med et virus som uttrykker myod ^19-21. Denne metoden har blitt effektivt testet ved hjelp av fibroblaster hentet fra pasienter med muskelsykdommer og bekreftet at myod-uttrykke fibroblaster effektivt kan danne myotubes som uttrykker modne muskelproteiner. Dermed kan begge celletyper brukes effektivt i flere nedstrøms applikasjoner og gi uvurderlig materiale for diagnostiske og terapeutiske studier.

Virkningen av immortalization

Immortalisering av normale diploide celler gjør det mulig å fremstille en stabil human cellelinje som kan bli fullstendig karakterisert og undersøkt av mange forskjellige laboratorier. Primærkulturer fra uavhengigisoleringer kan variere og deres generelle proliferativ kapasitet kan være variabel når skaden er introdusert i dissosiasjon prosess eller ved overdigestion, som kan forvrenge kultur atferd. Immortalisering av celler ved hjelp av ekspresjonen av den katalytiske subenhet av telomerase (hTERT) har den fordel å opprettholde en stabil cellulær fenotype og cellene forblir diploid. Det har vært rapporter i mus som telomerase kan modulerer Wnt vei ^22. Vi har ikke observert dette fenomenet i menneskeceller. Men for å unngå slike potensielle komplikasjoner, har hTERT kassetten er flankert med lox sider, slik at den kan fjernes etter at telomerer er blitt strukket. Lange telomerer konferere hundrevis av ekstra seksjoner, vanligvis tilstrekkelig til å utføre de fleste eksperimenter.

Fordi kontinuerlig celle utvidelse gir alltid en selektiv fordel for rask vekst, kan den cellulære fenotype tidvis bli partisk på grunn av overvekst av de mest raskt deleceller, snarere enn de beste differensierende celler. Selv om dette har ennå ikke vist seg å være et betydelig problem ved bruk av den beskrevne fremgangsmåte, kan det avhjelpes ved tining celler som har vært frosset tidlig i sin kultur historie eller ved klonal seleksjon for celler som oppviser den ønskede fenotype.

Til slutt, mens utvidelse av myogeniske celler til nær ubegrenset antall har fordeler for narkotika screening og mulig sykdom modellering, dagens teknikker har også iboende ulemper som hindrer bruk av disse cellene som terapeutisk kjøretøyer i cellebasert terapi, eller som primære diagnostiske verktøy. Både den omfattende in vitro kultur og immortaliseringsmetoder trinnene endrer fenotype av muskelceller i forhold til sin opprinnelige tilstand. Viktigere er disse cellene utvidet i et miljø som er svært forskjellig fra den naturlige miljø av primær satellittceller innenfor sin nisje. Derfor, udødeliggjort celler krever intens sikkerhet testing og muligens utviklinpment av nye teknikker hvis de skal bli re-innføres i human pasientens muskulatur.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Equipment
Tissue culture biosafety hood	Baker Company, Inc.	Model SterilGuard Hood
Benchtop centrifuge, such as Beckman Model	Beckman Coulter	Model Allegra 6R	If cell sorting is performed, a centrifuge with refrigeration is preferred
Microscope	Nikon	Model Eclipse TS100
Tissue culture incubator, connected to a CO2 source	Forma Scientific	Series II
Fluorescence-activated cell sorter (FACS)	Becton Dickinson	Model Aria
Reagents for isolation of primary myoblasts from tissue
Dispase II	Roche Applied Science	#04942078001	Prepare a sock solution of 2.4U/ml in DMEM
Collagenase D	Roche Applied Science	#088882001	Prepare a stock solution of 10 mg/ml
1x Sterile Hank’s Balanced Saline Solution (HBSS), calcium and magnesium free	GIBCO Life Technologies	#14185-052
Bovine serum albumin, fraction V	Sigma	#05470	Prepare a sterile  solution of 1X HBSS 0.5% BSA for FACS sorting
Sterile growth medium for myoblasts: Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) with high glucose (4.5 g) supplemented with 30% fetal bovine serum	GIBCO Life Technologies	11965-092	Contains L- glutamine
RBC lysis solution	Qiagen	158904
Propidium Iodide stock 10mg/ml	Sigma	P4170	Prepare the stock solution by diluting the powder in sterile distilled water
Anti-human CD56 antibody for flow cytometry	Biolegend	318310	APC-conjugated antibody, other labels are avaialable
Reagents for immortalization of primary myoblasts
Ecotropic packaging cell line PE	Cell Biolabs	RV-101
Amphotropic packaging cell line PA3174	Cell Biolabs	RV-102
Pig skin gelatin	Sigma	G1890-500g	Prepare a stock solution of 0.1% gelatin in water. Coat the dish with the solution at 37°C for one hour. Remove the solution and add medium.
PolyJet	Signagen	SL100688
G418	Fisher	345812
Hygromycin	EMD Biosciences	400051
pBabe plasmids containing mCDK4 and hTERT	not commercially available		Stadler et al, 2013
Qiagen plasmid midiprep kit	Qiagen	12143
Medium 199	Life Technologies	Medium 199 (31150022)
Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM)	Life Technologies	DMEM (11965-092)	Mix 4:1 DMEM:199
Myoblast growth medium: 4:1 Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) and Medium 199 supplemented with 15% fetal bovine serum; 0.02 M HEPES buffer; 1.4 mg/L vitamin B12; 0.03 mg/L ZnSO4, 0.055 mg/L dexamethasone, 2.5 μg/L hepatocyte growth factor and 10 μg/L beta fibroblast growth factor.	Life technologie (DMEM, F199); Atlanta Biological (FBS); Invitrogen (Hepes); Fisher (ZincSulfate); Sigma (Vit.B12, Dexamethasone); Chemicon international (HGF); Biopioneer (betaFGF)	#15630-080 (Hepes); #Z68-500 (ZnSO); #V2876.#D4902 (Vit.B12, Dex); GF116 (HGF); HRP-0011 (bFGF).	Prepare media and stock solution Vit. B12 (20mg/ml); ZincSulfate (60µg/ml); Dex (55µg/µl) separately for easier use. HGF stock solution (5µg/ml) and FGF (20µg/ml) should be added freshly every week at the final working concentration.
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010
Myosin heavy chain antibody for immunostaining	Developmental Hybridoma Bank	MF20	Clone MF20
Desmin Antibody for immunostaining	Thermo Scientific	MS-376-S0	Clone D33
Horse serum	Invitrogen	26050-088
Reagents for primary skin fibroblast isolation
Transport medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 0.2% penicillin/streptomycin	RPMI medium 1640: GIBCO Life Technologies	11875-093
Human primary fibroblast culture medium: RPMI 1640 supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% penicillin/streptomycin	Fetal bovine serum: Thermo Scientific	SH30071.03
Collagenase solution: Collagenase type 2 (100 mg) resuspended in 12.5 ml of fibroblast culture medium and filter-sterilized	Worthington	4176
Sterile 1X Phosphate Buffer Saline (PBS) calcium and magnesium free	Lonza	17-516F
Materials for isolation of primary myoblasts
50 ml and 15 ml sterile conical tubes	GeneMate/Bioexpress	C-3394-4 (50 ml) ; C3394-1 (15 ml))
Sterile scalpels	Aspen Surgical	372610
Hemocytometer	Hausser Scientific	1492
Sterile 5, 10, and 25 ml pipettes	Bellco glass	1226-05010 (5 ml); 1200-10010 (10 ml) ;1228-25050 (25 ml)	Reusable pipettes are washed, cotton plugged and autoclaved before use
Sterile tissue culture-treated plastic dishes (10 cm)	BD Falcon	353003
Sterile nylon cell strainers (100 µm and 40 µm size)	BD Falcon	352340 (40µm); 352360 (100µm)
Materials for myoblast immortalization
Sterile 0.45 µm filters	Millipore	SLHV013SL
Cloning rings	Corning	#3166-8	To be cleaned and autoclaved before and after use
Materials for fibroblast cell lines
Sterile 35 mm tissue culture-treated plastic dishes	Greiner bio-one	628160
Sterile scalpels	DeRoyal	D4510A
Sterile T25 tissue culture flasks	Techno Plastic Product, TPP	90026	sold in the USA by MIDSCI
TrypLE express	GIBCO Life Technologies	12605-010