Abstract
Experimentelle Untersuchung erlebt ein verstärktes Interesse an der Entwicklung und Anwendung von neuen und oftmals komplex, Closed-Loop-Protokolle, wobei der Reiz aufgebracht hängt in Echtzeit auf die Reaktion des Systems. Neueste Anwendungen reichen von der Umsetzung der Virtual-Reality-Systeme zur Untersuchung von motorischen Reaktionen sowohl in Mäusen 1 und 2 in Zebrafisch, zu kontrollieren, von Anfällen folgenden kortikalen Hub mit 3 Optogenetik. Ein wesentlicher Vorteil der Closed-Loop-Verfahren beruht auf der Fähigkeit der Sondierung höherdimensionalen Eigenschaften, die nicht direkt zugänglich sind oder die auf mehreren Variablen, wie zum Beispiel neuronale Erregbarkeit 4 und Zuverlässigkeit ab, während gleichzeitig die Maximierung des experimentellen Durchsatzes. In diesem Beitrag wird und im Kontext von zellularen Elektrophysiologie, wie man eine Vielzahl von geschlossenen Kreisprotokolle zum Studium der Antworteigenschaften pyramidalen Neurone, rec Anwendung beschreiben wirintrazellulär mit der Patch-Clamp-Technik in akuten Hirnschnitten aus dem somatosensorischen Kortex von jungen Ratten orded. Da kein im Handel erhältlich oder Open-Source-Software bietet alle Funktionen, die für die effiziente Durchführung der hier beschriebenen Experimente erforderlich, wurde eine neue Software-Toolbox namens LCG 5 entwickelt, dessen modularer Aufbau maximiert die Wiederverwendung von Computer-Code und erleichtert die Umsetzung der neuen experimentellen Paradigmen. Stimulationswellenformen werden mit einem kompakten Meta-Beschreibung angegeben und vollständige experimentelle Protokolle sind in textbasierten Konfigurationsdateien beschrieben. Zusätzlich hat LCG eine Befehlszeilenschnittstelle, die für die Wiederholung von Studien und Automatisierung der Versuchsprotokolle geeignet ist.
Introduction
In den letzten Jahren wurde die Elektro zellulären vom traditionellen offenen Schleife Paradigma in Spannungs- und Stromklemme-Experimente zu modernen Closed-Loop-Protokolle verwendet entwickelt. Die bekannteste Technik mit geschlossener Schleife ist vielleicht das dynamische Klemm 6,7, die die synthetische Injektion von künstlichen spannungsgesteuerten Ionenkanälen ermöglicht, die neuronalen Membran Spannung 8 zu bestimmen, die eingehende Untersuchung der Wirkungen von nicht-deter Flimmern auf Ionenkanäle auf neuronale Antwort Dynamik 9 sowie die Erholung in vitro realistischer in vivo- wie synaptische Hintergrundaktivität 10.
Andere Closed-Loop-Paradigmen, die vorgeschlagen wurden, umfassen die Blindklemme 11, um in vitro zu studieren die Erzeugung von selbsterhaltende Dauertätigkeit, und die Antwort zu klemmen 4,12, um die zugrunde liegenden zellulären Mechanismen zu untersuchen neuronale Erregbarkeit.
NHALT "> Hier beschreiben wir ein leistungsfähiges Framework, das die Anwendung ermöglicht eine Vielzahl von Closed-Loop elektro Protokolle im Rahmen der Ganzzell-Patch-Clamp-Aufnahmen in akuten Hirnschnitten durchgeführt. Wir zeigen, wie man somatische Membranspannung mit Hilfe von Patch-Clamp-Aufnahmen aufzeichnen in Pyramidenzellen aus dem somatosensorischen Kortex von jungen Ratten und gelten drei Closed-Loop-Protokolle mit LCG, ein Kommandozeilen-basierte Software-Toolbox im Labor für Theoretische Neurobiologie und Neuroengineering entwickelt.Kurz gesagt, die beschriebenen Protokolle, sind erstens die automatische Injektion einer Reihe von Stromklemme Reizwellenformen, für die Charakterisierung einer großen Anzahl von aktiven und passiven Membraneigenschaften relevant. Diese wurden vorgeschlagen, um die elektrophysiologische Phänotyp einer Zelle in Bezug auf seine Ansprecheigenschaften zu einer stereotypen Reihe von Reizwellenformen zu erfassen. Bekannt als der E-Code einer Zelle (siehe zB & #160; 13,14) wird eine solche Sammlung von elektrischen Antworten von verschiedenen Laboratorien verwendet, um objektiv zu klassifizieren Neuronen auf der Grundlage ihrer elektrischen Eigenschaften. Dies beinhaltet die Analyse der stationären Eingangs-Ausgangs-Übertragungsverhältnis (fI Kurve) durch eine innovative Technik, die den geschlossenen Regelkreis, Echtzeit-Steuerung der Rate der Brenn mittels eines Proportional-Integral-Differential (PID) -Controller beinhaltet zweitens die Erholung von realistisch in vivo -ähnlichen Hintergrund synaptische Aktivität in in vitro Präparate 10 und drittens dem künstlichen Verbindung in Echtzeit von zwei gleichzeitig aufgenommenen Pyramidenzellen mittels einer virtuellen GABAergen Intern, die durch den Computer simuliert wird.
Zusätzlich implementiert LCG die Technik als aktive Elektrode Kompensation (AEC) 15, die die Umsetzung dynamische Klemm Protokolle mit einer einzigen Elektrode ermöglicht bekannt. Dies ermöglicht Ausgleichs unerwünschten Wirkungen (artifacts) der Aufzeichnungselektrode, die, wenn sie für die Bereitstellung von intrazellulärer Stimuli verwendet wird, auftreten. Das Verfahren basiert auf einem nicht-parametrischen Schätzung der äquivalenten elektrischen Eigenschaften des Aufzeichnungskreis.
Die in diesem Dokument beschriebenen Techniken und experimentelle Protokolle können ohne weiteres in üblichen Open-Loop-Spannungs- und Stromklemme-Experimente angewendet werden und kann auf andere Präparate, wie extrazelluläre oder intrazelluläre 4,16 Aufnahmen in vivo 17,18 verlängert werden. Die sorgfältige Montage der Einrichtung für ganze Patch-Clamp-Elektrophysiologie ist ein sehr wichtiger Schritt für stabile, qualitativ hochwertige Aufzeichnungen. Im Folgenden gehen wir davon aus, dass eine solche Versuchsanordnung ist es, den Experimentator bereits verfügbar, und unsere Aufmerksamkeit auf die Verwendung von LCG beschreiben. Der Leser wird auf 19 bis 22 für weitere Tipps rund um die Optimierung und Fehlersuche hingewiesen.
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Protocol
Das hier beschriebene Protokoll entspricht den Empfehlungen und Richtlinien der Ethikkommission der Abteilung Biomedizinische Wissenschaften der Universität Antwerpen. Dieses Protokoll erfordert die Herstellung von nicht-fühlenden Materials aus dem explantierten Gehirn juveniler Wistar-Ratten, die von zugelassenen humane Sterbehilfe Techniken erhalten.
1. Ausrüstung Vorbereitung
- Installation und Konfiguration der Datenerfassung und Stimulationssystem.
- Verwenden Sie einen Personalcomputer (PC) mit einem Datenerfassung (DAQ) Karte von Comedi unterstützt ausgestattet, um Signale zu erfassen und senden analoge Steuerspannungen an den elektrophysiologischen Verstärker.
HINWEIS: Comedi ist ein Linux-Modul und Bibliothek, die eine Vielzahl von Datenerfassungskarten aus den gängigsten Herstellern unterstützt: besuchen http://www.comedi.org für weitere Informationen. - Falls ein computergesteuertes Patch-Clamp-Verstärkers in Gebrauch ist, verwenden einen zweiten PC neben den ein an den Verstärker gewidmetKontrolle.
Anmerkung: Während letztere kann ein herkömmliches Betriebssystem ausgeführt wird, wird die zusätzliche PC sein, die in Echtzeit mit Hilfe eines speziellen Betriebssystems. Unter diesen Bedingungen ist es zweckmäßig, einen einzigen Monitor, Maus und Tastatur an den zusätzlichen PC angeschlossen zu verwenden, während eine Verbindung von einem Remote-Desktop-Anwendung auf dem dedizierten PC. - Laden Sie das ISO-Image der Live-CD, die eine Echtzeit-Linux-Betriebssystem mit LCG vorinstalliert aus http://www.tnb.ua.ac.be/software/LCG_Live_CD.iso und brennen Sie sie auf eine leere CD oder USB-Stick " .
- Legen Sie einfach die CD in das Laufwerk des PC mit dem DAQ-Karte und starten Sie es. Alternativ installieren LCG von seinem Online-Quell-Repository auf einem PC mit dem Betriebssystem Linux (zB Debian oder Ubuntu). Wenden Sie sich im Online-Handbuch für Details über den Einbauvorgang. Das Handbuch ist in http://danielelinaro.github.io/dynclamp/lcg_manual.pdf Internetseite.
- Booten Sie von der Live-CD: this wird automatisch ein komplett konfiguriertes System zu laden. Um dies zu tun, legen Sie das LCG-Live-CD in das CD-ROM-Laufwerk und starten Sie den Computer von der CD; wählen Sie das Echtzeit-Kernel (Standardoption), sobald das Boot-Menü angezeigt wird, und warten Sie, bis das System initialisiert werden.
- Kalibrieren Sie den DAQ-Karte, indem Sie an der Eingabeaufforderung:
sudo comedi_calibrate
oder
sudo comedi_soft_calibrate
je nachdem, ob die Datenerfassungsplatine unterstützt Hardware- oder Software-Kalibrierung, bzw. (verwenden Sie den Befehl sudo comedi_board_info um Informationen auf dem Brett zu erhalten). - Stellen Sie die entsprechende Analog-Digital- und Digital-Analog-Umwandlungsfaktoren: das erfordert, die Zugriff auf das Handbuch des Mobilelektrophysiologischen Verstärker und insbesondere auf seine Spezifikationen auf der Umrechnungsfaktoren.
- Verwenden Sie einen Texteditor, um die entsprechenden Zahlenwerte in der Datei /home/user/.lcg-env für die Umgebungsvariablen angeben, AI_CONVERSION_FACTOR_CC, AI_CONVERSION_FACTOR_VC, AO_CONVERSION_FACTOR_CC, AO_CONVERSION_FACTOR_VC.
ANMERKUNG: Diese stellen den Eingang (AI) und Ausgang (AO) Verstärkungen für Stromklemme (CC) und die Spannungsklemme (VC) Modi und die Umrechnungsfaktoren zwischen den Spannungsbefehlen durch den Computer zur Verfügung gestellt und dem aktuellen bzw. Spannungen, die durch den Verstärker erzeugt wird verbunden. - Alternativ können Sie die LCG-Skript zur Verfügung gestellt (LCG-find-Umwandlung-Faktoren), um die Umrechnungsfaktoren in seinem System zu finden.
HINWEIS: Die berechneten Werte von LCG-find-Umwandlung-Faktoren sind Vermutungen, die in einigen Fällen erforderlich, numerisch Stumpf zu sein oder abgerundet, um die genauen Werte der Umrechnungsfaktoren zu reflektieren. - Zur Nutzung LCG-find-Umwandlung-Faktoren, starten Sie, indem Sie den "Modellzelle", die oft mit dem Verstärker zu dem entsprechenden heads gekauft. Dann öffnen Sie ein Terminal auf dem Linux-Rechner, auf dem Sie ausgeführt werden die Live-CD und geben Sie den folgenden Befehl an der Shell-Eingabeaufforderung:
lcg-find-Umwandlung-Faktoren -i $ HOME / .lcg-env -o $ HOME / .lcg-env
HINWEIS: In beiden Fällen (dh manuelle Änderung /home/user/.lcg-env oder Verwendung LCG-find-Umwandlung-Faktoren), in der Nähe, und öffnen Sie das Terminal, damit die Änderungen wirksam werden. - Wenn mehrere headstages verwendet werden, legen Sie die Umrechnungsfaktoren auf die gleichen Werte in allen Kanälen; wenn dies nicht möglich ist, finden Sie in der LCG Online-Handbuch zu verstehen, wie man mehrere Umrechnungsfaktoren in LCG-Stimulus oder wie verwenden, um Konfigurationsdateien, die die Bedürfnisse des Benutzers besser entsprechen zu produzieren.
- Verwenden Sie einen Personalcomputer (PC) mit einem Datenerfassung (DAQ) Karte von Comedi unterstützt ausgestattet, um Signale zu erfassen und senden analoge Steuerspannungen an den elektrophysiologischen Verstärker.
2. Herstellung von Akute Hirnschnitten aus dem somatosensorischen Kortex
- Herstellung von Lösungen für die Elektrophysiologie.
- Bereiten künstliche Cerebrospinalflüssigkeit (ACSF) durch Mischen (in mM) 125 NaCl, KCl 2,5, 1,25 NaH 2 PO 4, 26 NaHCO 3, 25 Glucose, 2 CaCl 2, und 1 MgCl 2. Bereiten 10x Lager-Lösungen für die ReduzierungVorbereitungszeit am Tag des Experiments. Vorbereitung 2 L, von denen eine für die Herstellung der Scheiben und der andere für die Aufzeichnung verwendet werden.
- Sättigen den ACSF mit 95% O 2 und 5% CO 2 für mindestens 30 min vor dem Beginn des Verfahrens.
- Für aktuelle Clamp Messungen, verwenden Sie eine intrazelluläre Lösung (ICS) enthält (in mM) 115 K-Gluconat, 20 KCl, 10 HEPES, 4 ATP-Mg, 0,3 Na 2 -GTP, 10 Na 2 -phosphocreatine. Bereiten Sie die Lösung in Eis und filtern sie vor dem Beginn der Aufnahmen um die Gefahr des Verstopfens der Pipetten eliminieren.
- Gehirn-Extraktion.
- Das Tier zu betäuben, indem das Tier in einer Induktionskammer mit 4% Isofluran und schnell zu enthaupten sie mit einem Guillotine oder großen Schere.
- Schneiden Sie die Haut entlang der Mittellinie und schieben Sie sie in den Ohren.
- Mit einer feinen Schere schneiden den Schädel entlang der Mittellinie. Halten Sie die Klinge so nah wie möglich zu the Oberfläche, um eine Beschädigung der darunter liegenden Gehirn zu minimieren. Öffnen Sie den Schädel mit einer Pinzette, verwenden Sie einen Spachtel, um den Sehnerv und den Hirnstamm durchtrennen und sanft fallen das Gehirn in eiskaltem ACSF.
- Trennen Sie das Kleinhirn und die beiden Halbkugeln mit einem Skalpell (Blatt 24).
- Überschüssiges Wasser aus einer der beiden Hemisphären und kleben Sie es auf einer geneigten Plattform mit einem Tropfen Sekundenkleber. Schnelles Hinzufügen von ein paar Tropfen ACSF über das Gehirn und überträgt es auf der Vibratom Kammer.
HINWEIS: Bei der Vorbereitung sagittal, ist der Winkel der Plattform wichtig, damit eine Beschädigung der Dendriten der Pyramidenzellen während des Trennverfahrens.
- Herstellung der Scheiben.
- Setzen Sie die Klinge über das Gehirn und entsorgen Sie die ersten 2,5 bis 3 mm. Regelung der Drehzahl und der Frequenz, um eine Beschädigung der Oberfläche der Scheibe, während gleichzeitig die Minimierung der Zeit für die Schneidverfahren erforderliche Maß zu beschränken.
- Stellen Sie die Dicke bis 300 μm und beginnen Schneiden. Wenn das Messer an der Hirnrinde weg, verwenden eine Rasierklinge oder eine gebogene Nadel über dem Hippocampus und an den Rändern des kortikalen Bereich von Interesse zu schneiden.
- Platzieren Sie die Scheiben in einer Multi-Well-Inkubationskammer bei 32 gehalten - 34 ° C.
- Ziehen Sie die Klinge, und wiederholen Sie Punkte 2.3.2 und 2.3.3 bis 5-8 Scheiben geschnitten werden. Die besten Scheiben sind in der Regel diejenigen, bei denen die Blutgefäße parallel zu der Oberfläche sind.
- Inkubiere die Scheiben für 30 min, nachdem die letzte Scheibe in der Kammer platziert.
3. Patch-Clamp-Aufnahmen von Schicht 5 Pyramidenzellen
- Legen Sie eine Scheibe in der Aufnahme Kammer und die Suche nach gesunden Zellen. Diese Zellen haben in der Regel einen niedrigeren Kontrast, ein glattes Aussehen und sind nicht geschwollen.
- Inspizieren die Scheibe unter dem Mikroskop mit 40-facher Vergrößerung Linse und die Suche nach Zellen, in der Schicht 5, mit etwa 600 bis 1000 um von der Oberfläche des Gehirns befindet. Sobald eine geeignete Zelle gefunden wird, Last ein Drittel der Mikropipette mit ICS und legen Sie sie in der heads.
- Auf der persönlichen Computer mit dem Live-CD oder das vorkonfigurierte Linux-Betriebssystem, starten Sie eine Eingabeaufforderung (zB bash) und an seinem Eingabeaufforderung den Befehl lcg Null. Dies stellt sicher, dass die Messkarte wird nicht den Antrieb des Verstärkers.
- Gelten 30-50 mbar Überdruck durch Drücken auf den Kolben der Spritze einen gemeinsamen, durch einen Schlauch mit der Pipettenhalter und, mit Hilfe des Mikroskops angeschlossen ist, den Pipetten etwa 100 um über der Scheibe.
HINWEIS: Setzen Sie die Pipette in eine Position, die eine direkte Verbindung erlaubt es, die Zielzelle, vorzugsweise unter Verwendung des Ansatzes Modus des Mikromanipulator. - Acting auf die Kontrollen der Elektrophysiologie-Verstärker, stellen Sie die Pipette Offset und geben ein Testimpuls (10 mV) in voltage clamp Modus.
- Reduzieren Sie den Druck um 10 bis 30 mbar (je nach Pipettengröße) durch Abziehen derKolben der Spritze; vorsichtig nähern die Zelle und prüfen, ob die Bildung eines Grübchens durch Beobachtung des Bildes auf der Videokamera-Monitor. Überwachen Sie den Testimpuls für eine Erhöhung der Widerstandsfähigkeit zu jeder Zeit, durch die Beobachtung der Stromwellenform auf dem Oszilloskop auf die Elektrophysiologie Verstärker angeschlossen angezeigt (alternativ können Sie den Befehl LCG-Siegel-Test verwenden, um die Pipette Widerstand zu überwachen).
- Den Druck und gegebenenfalls schonend negativen Druck auf das Pipette Dichtungsbildung zu helfen, wenn man eine Erhöhung der Pipettenwiderstand und die Bildung eines "Grübchen" auf der Zell bemerken.
- Während die Dichtung bildet, nach und nach die Haltepotential auf -70 mV zu verringern.
- Einmal Gigaohm Dichtung erhalten wurde, sicherzustellen, dass der Haltestrom ist von 0 - 30 Pa. Gelten kurze Impulse von Unterdruck (Sog), um die Membran zu brechen und die Gesamtzellkonfiguration. Alternativ können Sie auch starke und kurze Impulse der Spannung zu injizieren (
- Wechseln Sie in den Stromzange Modus und überprüfen, ob das Ruhemembranpotential ist typisch für eine gesunde Zelle. Zum Rindenpyramidenneuronen eines Kalium-Gluconat-basierte Lösung, ist dieser Wert in der Regel zwischen -65 und -75 mV.
4. halbautomatische Charakterisierung der elektrischen Antworteigenschaften eines Neuron-
- Erstellen Sie ein Verzeichnis, um Benutzerdaten zu speichern. Um diese beschäftigen die ein Skript in der LCG-Live-CD, die Ordner basierend auf dem Datum erstellt inbegriffen tun. Um es an der Eingabeaufforderung zu verwenden, geben Sie
cd ~ / Experimente
LCG-create-Experiment-Ordner -s psp, in_vivo_like
Dies wird ein Ordner, in dem die Daten für diese Zelle gespeichert wird (und einen "psp" und "in_vivo_like" Unterordner) zu erstellen, und es wird sein Name mit dem Anschluss zu druckenFenster; es ist auch möglich, zusätzliche Informationen, wie beispielsweise Pipettenwiderstand und Zelltyp mit diesem Skript speichern. - Wechseln Sie in den neu erstellten Ordner mit dem Befehl
cd ~ / <Ordnername>
Der Ordnername ist die von der Kommando LCG-create-Experiment-Ordner und den Zeitstempel des aktuellen Tages haben (dh Jahr-Monat-Tag) angezeigt, wie in 20140331A01. - Stellen Sie sicher, dass der Verstärker wird sich in Stromzange Modus zu betreiben, dass die Kabel angeschlossen und die externe Spannungsbefehl des Verstärkers, falls vorhanden, ist aktiviert.
- Geben Sie den Befehl LCG-ecodeat die Eingabeaufforderung. Dies erfordert eine Reihe von Befehlen (nämlich LCG-AP, LCG-VI, LCG-Rampe, die LCG-tau und LCG-Stufen) verwendet werden, um grundlegende Reaktionseigenschaften der Zelle zu charakterisieren. LCG-ecode erfordert, dass der Benutzer festlegen, zwei Parameter: die Amplitude des 1 ms langen Stromimpuls verwendet, um eine einzelne Spitze in der Zelle hervorzurufen, und die maximale Amplitude des Strom ramp injiziert in die Zelle in ihren Rheobase finden.
Verwenden Sie die folgende Befehlssyntax:
LCG-ecode --pulse Amplitude X --ramp Amplitude Y
mit einer Auswahl von den Werten X und Y (in pA), die ausreicht, um die Zelle zu Feuer in Reaktion auf ein 1 ms langen Puls und einer anhaltenden Injektion von Strom bzw. machen.
Hinweis: Diese Protokolle erfordern die Durchführung der numerischen Schätzung der 'Elektrode Kernel', um die aktive Elektrode Kompensation (AEC) 15 zu verwenden. Eine lärmStromInjektion verwendet werden, um den Kernel zu schätzen, und der Benutzer wird aufgefordert, die Anzahl der Proben, die das Kernel vornehmen zu bestätigen. Siehe 15 für detaillierte Informationen über die Bedeutung der Elektrode Kernel und wie man die Anzahl der Kernel-Proben zu wählen.
5. Die Injektion von Leitfähigkeit durch Simulated Synapsen und Simulation von In-vivo-ähnliche Hintergrundaktivität
- Die Injektion von simulierten erregende postsynaptische Potentiale
- Wechseln Sie in das Verzeichnis, in dem Sie den nächsten Versuch zu retten, indem Sie den folgenden Befehl an der Eingabeaufforderung der Schale:
cd psp / 01 - Kopieren Sie ein LCG-Konfigurationsdatei in das aktuelle Verzeichnis und öffnen Sie sie mit einem Texteditor (Nano in diesem Beispiel), indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale (dieses Beispiel Konfigurationsdatei wird in den Quellcode und die Live-CD enthalten) :
cp ~ / local / src / LCG / Konfigurationen / epsp.xml
nano epsp.xml
Hinweis: Dies ist einfach eine Textdatei mit unterschiedlichen Einheiten miteinander verbunden sind. Weitere Einzelheiten finden Sie im Abschnitt Repräsentative Ergebnisse. - Bei Bedarf bearbeiten die inputChannel, Output die inputConversionFactor und die outputConversionFactor in dieser Datei die Umgebung des Benutzers zu entsprechen.
- Berechnen Sie die Elektrode Kernel benötigt, um die aktive Elektrode Kompensation durchzuführen ', die von LCG verwendete Methode, um einzelne Elektrode dynamische Klemmführen ", indem Sie den command
LCG-Kernel
Dies wird für die Anzahl von Punkten in der Kernel-Prompt. Auch hier wählen Sie eine Nummer, so dass die Elektrode Kernel deckt das Ende der exponentiellen Abfall Schwanz. - Führen Sie die dynamische Clamp-Experiment mit dem Befehl
LCG-experimentieren -c epsp.xml - Listen Sie die Dateien und visualisieren die Ergebnisse mit dem Befehl
ls -l
LCG-Plot-Datei -f letzten
- Wechseln Sie in das Verzeichnis, in dem Sie den nächsten Versuch zu retten, indem Sie den folgenden Befehl an der Eingabeaufforderung der Schale:
- Die Injektion von simulierten hemmenden postsynaptischen Potentiale
- Erstellen Sie einen Ordner und kopieren Sie die Datei, um sie epsp.xml indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
mkdir ../02
cp epsp.xml ../02/ipsp.xml
cd ../02 - Bearbeiten Sie die Konfigurationsdatei mit einem Texteditor: Zum Ändern der synaptischen Umkehrpotential und Anstiegs- und Abfallzeitkonstanten des Modells Synapse Exp2Synapse auf die folgenden:
Parameter>
<E> -80 </ E>
<TauRise> 0,8 E-3 </ tauRise>
<TauDecay> 10e-3 </ tauDecay>
<Parameter>
Beenden Sie den Texteditor. - Berechnen Sie die Elektrode Kernel, und führen Sie das Experiment wie in 5.1, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
LCG-Kernel
LCG-experimentieren -c ipsp.xml - Listen Sie die Dateien und visualisieren die Ergebnisse, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
ls -l
LCG-Plot-Datei -f <filename.h5>
- Erstellen Sie einen Ordner und kopieren Sie die Datei, um sie epsp.xml indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
- Simulation von in vivo-ähnliche Hintergrundaktivität:
- Wechseln Sie in das Verzeichnis, in dem Sie die folgenden Versuch zu retten, wie zuvor gezeigt, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Shell wollen:
cd ../../in_vivo_like/01 - Kopieren Sie die Konfigurationsdatei von LCG Quellverzeichnis, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
cp ~ / local / src / LCG / Konfigurationen / in_vivo_like.xml
nano in_vivo_like.xml - Passen Sie die DAQ-Konfigurationsparameter für das Setup des Benutzers, wie in 5.1.3 beschrieben, und beenden Sie den Editor.
- Berechnen Sie die Elektrode Kernel, und führen Sie das Experiment wie in 5.1, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Schale:
LCG-Kernel
LCG-experimentieren -c in_vivo_like.xml -n 10 -i 3
Die '-n 10 "und" i 3' Schalter zeigen an, dass die Stimulation sollte 10 mal im Abstand von drei Sekunden wiederholt werden. - Visualisieren Sie die rohen Spuren, die mit dem folgenden Befehl an der Eingabeaufforderung der Schale:
LCG-Plot-Datei -f alle
- Wechseln Sie in das Verzeichnis, in dem Sie die folgenden Versuch zu retten, wie zuvor gezeigt, indem Sie die folgenden Befehle an der Eingabeaufforderung der Shell wollen:
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Representative Results
In den vorangegangenen Abschnitten haben wir beschrieben, wie die Software-Toolbox LCG verwenden, um die elektrophysiologischen Eigenschaften L5 Pyramidenzellen zu charakterisieren und in vivo-ähnliche synaptische Aktivität in einer Scheibe Vorbereitung neu zu erstellen. Die Verwendung einer Befehlszeilenschnittstelle und halbautomatische Protokoll begünstigen die Reproduzierbarkeit und Effizienz des Experiments, die einen großen Einfluss auf die Leistung und Qualität der produzierten Daten sammeln können. Zusätzlich, da die Daten in einer konsistenten Art und Weise gespeichert werden, ist es leicht, die Analyse auf ein bestimmtes Ziel zu verlängern. Figur 1 zeigt das typische Ergebnis eines Experiments, bei dem die Grundelektrophysiologischen Eigenschaften einer Zelle unter Verwendung von sechs verschiedenen Protokollen charakterisiert.
Messung des Aktionspotentials Form und Schwelle (1A): Eine kurze und starke Impuls des depolarisierenden Strom injiziert wird, um die durchschnittliche Aktionspotential Form zu messen. Die Spike-Schwelleals die erste Spitze der dritten Ableitung des Aktionspotentials 24 berechnet. Messung der Strom-Spannungs-Kennlinie (1B): Unterschwellenstromimpulse in die Zelle injiziert, so dass die Messung der passiven Antworteigenschaften, wie beispielsweise Eingangswiderstand und die Charakterisierung der Unterschwellenionenströmen.
Die Messung der minimalen Strom ausreichend zum Hervorrufen Dauerfeuer (Abbildung 1c). Der eingespritzte Rampe des Stroms ermöglicht die Charakterisierung der Zelle als Typ I oder Typ II Oszillator 25. Messung der Frequenz-Strom (FI) Kurve (1D): der eingespeiste Strom ist eine Funktion der momentanen Schussfrequenz und wird jedes Mal aktualisiert, die Zell Spikes, mit der in 5 beschriebenen Closed-Loop-Protokoll. Mit dieser Technik kann eine zuverlässige Schätzung des fI Kurve in weniger als 30 sec erreicht werden. Die Messung der Membrane Zeitkonstante (1E): eine kurze Hyperpolarisation Stromimpuls, um die passive Entspannung Eigenschaften der Membran zu messen geliefert. Dieser Impuls wird dann auf einem Doppel exponentielle Anpassung an die Membranzeitkonstante (44 ms in diesem Fall) zu berechnen.
Anpassungskoeffizienten und als Antwort auf depolarisierenden Strom (1F): zwei supra Schwellwerte Strom injiziert werden, um den Adaptionskoeffizient (Verhältnis zwischen dem ersten und letzten Inter-Impuls-Intervalle) zu messen. Die automatisierte Anwendung aus einer Reihe von Protokollen wie die beschriebenen ermöglicht die Charakterisierung jedes aufgezeichnete Zelle in Bezug auf seine Schlüsselelektrophysiologischen Eigenschaften und bildet den Grundschritt für jede dynamisch auf den Vergleich verschiedener Neuronentypen und ihre Rolle ausgerichtet, sowohl in Gesundheit und Krankheit.
Obwohl LCG mehrere Schriften enthält, die spezielle Protokolle zu implementieren, die meisten der Leistungsfähigkeit und Flexibilität von der Toolbox befindens in der Fähigkeit, Experimente mittels Konfigurationsdateien beschreiben. In Sec. 5 wird beschrieben, wie die dynamische Klemme durchzuführen, um simulierte Hintergrundaktivität in das Neuron zu injizieren. Hier das Konzept der Konfigurationsdateien und Entitäten eingeführt wird. Eine Konfigurationsdatei ist einfach eine Textdatei, die die Namen und die Zusammenhänge aller grundlegenden Bausteine (so genannte Entitäten), die zur Durchführung einer gegebenen Experiment benötigt werden; Aus diesem Grund, der Gestaltung neuartiger Paradigmen durch Verbinden Unternehmen ist eine relativ einfache Aufgabe, wie es den Austausch und die Wiederverwendung von experimentellen Paradigmen. In der in Figur 2 gezeigte Experiment wurden fünf Einheiten verwendet:
H5Recorder: zeichnet die angeschlossenen Einheiten eine komprimierte Datei. Die HDF5 Dateiformat wurde gewählt, da sie von den meisten Programmiersprachen wie Python und MATLAB abstützt.
RealNeuron: bietet eine Abstraktionsschicht, um den technischen Aspekt der EchtzeitwiederCording und Injektion. Es enthält die Informationen über die Datenerfassungskarte und führt die aktive Elektrode Entschädigung online. Wenn ein Aktionspotential wird durch Überschreiten des Schwellwertes ist, gibt Echt Neuron auch eine Spitze in der Form einer Ereignis: Dies kann beispielsweise verwendet werden, um die Brennrate während des Versuchs zu überwachen oder mit künstlichen Synapsen Schnittstelle sein.
Poisson: erzeugt Pulszüge nach einer Exponentialverteilung mit einer bestimmten Rate. Der Samen des Verfahrens festgelegt werden kann, so dass Studien konsistent reproduziert werden.
SynapticConnection: empfängt die Spitzen aus dem Generator und leitet sie an den entsprechenden Synapsen nach einer bestimmten Verzögerung.
Exp2Synapse: Modell einer doppelten exponentiellen Synapse. Es enthält das Umkehrpotential und die Anstiegs- und Abfallzeitkonstanten.
Wie bereits erwähnt, wird jede Einheit, um eine oder mehrere andere t verbundeno komponieren ein Experiment. In dem Beispiel der Simulation eines in Sec beschrieben exzitatorischen postsynaptischen Strom. 5.1, sowohl die RealNeuron und die Exp2Synapse werden dem H5Recorder verbunden ist, um zu speichern, um Membranspannung und synaptische aktuelle Datei auf. Die Poisson-Einheit liefert Spitzen bei einer Frequenz von 2 Hz zum SynapticConnection, die wiederum liefert die Ereignisse an den Exp2Synapse nach 1 ms erzeugt. Schließlich wird die Exp2Synapse Einheit zum RealNeuron verbunden. Mit kleinen Variationen dieser Konfigurationsdatei, wie in §§ gezeigt. 5.2 und 5.3, kann man hemmende Ströme simulieren und neu in vivo-ähnliche Aktivität.
In Abbildung 2 ist gezeigt, wie mit Hilfe eines dynamischen Klemm Konfiguration kann synaptischen Integration in einer kontrollierten Weise durch die Simulation der induzierte Strom in ein Neuron durch künstliche Synapsen studieren. 2A (oben) zeigt einzelne postsynaptischen Potentiale (top ) zusammen mit dem injreflektierte Ströme. Red (blau) Spuren bezeichnen erregenden (inhibitorischen) Veranstaltungen. Man beachte, dass der eingespeiste Strom ist eine Funktion der Membranspannung und der Änderung in der Leitfähigkeit auf die Aktivierung des virtuellen Synapsen verbunden.
Durch die Bereitstellung von Poisson Pulszüge bei höheren Frequenzen zu den Synapsen, kann in vivo-ähnliche Hintergrundaktivität simuliert werden (Abbildung 2B und 2D). Auch während Spiking wenn große Ströme injiziert werden (schwarze Kurve in der Unterseite des 2B), die aktive Elektrode Kompensation gewährleistet, daß die Form der Spitzen nicht beeinträchtigt (Figur 2C), obwohl eine einzige Elektrode verwendet wird, um gleichzeitig injizieren und notieren Sie die Membranspannung. Wiederholen der mehrmaligen Versuchen mit gleichem Leitwert Wellenformen ermöglicht die Fortführung der Arbeit 23 zu einer realistischeren Rahmen, so dass es möglich ist, die Beiträge verschiedener synapti trennenc Ströme, um die Zuverlässigkeit und Präzision der Spitzenzeiten.
Figur 3 zeigt ein einfaches Beispiel eines Hybridnetzwerk, indem gleichzeitig die Aufnahme von zwei nicht verbundenen Pyramidenzellen und mit einer virtuellen GABAergen Intern, eine Form der disynaptic Hemmung Simulation erhalten, einem Mechanismus, der weit verbreitet in der Hirnrinde beinhaltet die Aktivierung von Martinotti Zellen. 26, 27 3A zeigt eine schematische Darstellung des Versuchsaufbaus: ein Paar von real, unverbunden Pyramidenzellen (schwarze und rote Dreiecke) wird künstlich durch einen simulierten GABAergic Intern verbunden, wie einem undichten Integrations- und Feuer Neuron modelliert. Die Synapse, die den präsynaptischen Pyramidenzelle eine Verbindung zu den Intern Displays homosynaptische kurzfristige Erleichterung nach dem Tsodyks-Markram Modell 28 implementiert, während der Synapsen Anschluss des Intern und die postsynaptischen pyramidalen Zelle eine biexponentiellen Synapse mit Anstiegs- und Abfall time Konstanten 1 und 10 ms.
Die Gewichte der beiden Verbindungen wurden eingestellt, um eine Ablenkung in der postsynaptischen Membran Potential von etwa 2 mV. 3B und 3C zeigen die Reaktion des präsynaptischen Pyramidenzelle zu einem Zug von 90 Hz geliefert intrazellulärem Impulse und die entsprechenden EPSPs in dem simulierten haben Intern:. die Parameter der synaptischen Verbindung wurden um haben die künstlichen Neurons emittieren eine Spitze nach einer präsynaptischen Ausbruch von 3 eingestellt - 4 Spitzen mit hoher Frequenz, wie experimentell berichtete 26,29 3D zeigt die Wirkung der Hemmung auf disynaptic die reale postsynaptischen Pyramidenzell. 10 Versuchen lagern, wobei das Neuron mit gefrorenen in vivo -ähnlichen Hintergrundaktivität ähnlich zu der in Figur 2 beschriebenen stimuliert beachte die Erhöhung der Zuverlässigkeit in Abhängigkeit von den drei inhibitorischen IPSPs,die sich in der kleineren Spitze Jitter nach der Aktivierung des inhibitorischen Zelle, wie die roten Striche unterhalb der Spannung Spuren angegeben.
Abbildung 1. Elektrophysiologische Charakterisierung einer gepatchten L5 Pyramidenzelle Output Zahl der E-Code-Protokoll für eine typische Pyramidenzellen. Quantifizierungen werden automatisch (A) Berechnung der Aktionspotentialschwelle (gestrichelte Linie -50,5 mV) durchgeführt wird und keine weitere Bearbeitung erforderlich ist.. Rote Linie ist die mittlere Aktionspotential Form. (B) Messung der passiven Reaktion (oben), um Hyperpolarisierungsströme (unten). (C) Reaktion auf eine zunehmende depolarisierenden Strom, um die Rheobase Strom (123 pA) zu messen. (D) Feuerfrequenz als Funktion des injizierten Stroms, gemessen unter Verwendung einer Closed-Loop-Ansatz. Jeder Graupunkt wird an der Paar befindet(Strom injiziert, Kehrwert der Interspike-Intervall). Die rote Kurve ist die lineare Anpassung an die Datenpunkte und die gestrichelte Linie zeigt die Rheobase in Platte (C) gemessen wird. (E) Messen des Membranzeitkonstante (43,8 ms). (F) Identifizierung von basischen aktiven Eigenschaften der Zelle offenbart, dass die Zelle eine regelmäßige spiking Neuron und dass es eine minimale Anpassung. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 2. Erholung der in vivo- ähnliche Aktivität mit dynamischer Klemme. (A) Simulation von erregenden (rot, Sec. 5.1) und hemmenden (blau, Sec. 5.2) Synapsen, graue Spuren gibt andere Realisierungen der gleiche Versuch. (B ) (B) in die Zelle injiziert. (C) Formen der Spikes. (D) Raster Darstellung der in 20 Studien generiert Spikes zeigt, dass das Neuron kann äußerst zuverlässige und präzise Reaktion auf den gleichen Eingang wie in 23 zu sehen sein. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Figur zu sehen.
Abbildung 3. Simulation von disynaptic Hemmung über eine simulierte hemmende Intern (A) Schematische Darstellung des Aufnahme-Setup:. Die schwarzen und roten Pyramiden sind ein Paar echte Pyramidenzellen gleichzeitig aufgezeichnet. Schwarz und rot zeigen präsynaptischen und postsynaptischen Neuron sind. Der blaue Kreis repräsentiert einen virtuellen GABAergen Intern, durch den schwarzen Pyramidenzelle kontaktiert, die wiederum hemmt die roten Pyramidenzelle. (B) Reaktion des realen präsynaptischen Pyramidenzelle um einen Zug von Impulsen mit einer Frequenz von 90 Hz geliefert, angezeigt durch die orangefarbenen Striche über dem Spannungsverlauf. Die schwarzen Striche unterhalb der Spannungsverlauf zeigen die Zeiten Aktionspotentiale wurden von der präsynaptischen Zelle emittiert. (C) Ansprechzeit des simulierten Intern zum Zug der Spitzen von der präsynaptischen Zelle emittiert. (D)Überlagerung von 10 Spannungsspuren aus dem realen postsynaptischen Pyramidenzelle in Reaktion auf die Aktivierung des simulierten Intern aufgezeichnet. Die postsynaptischen Zelle wurde mit gefrorenen in vivo-ähnliche Hintergrundaktivität stimuliert, um eine zuverlässige Spannungsdynamik zu erhalten. Die roten Striche unterhalb der Spannung Spuren zeigen die Zeiten, zu denen, während aufeinanderfolgender Versuche, die postsynaptischen Neuronen ein Aktionspotential emittiert. Beachten Sie die erhöhte Präzision nach der Aktivierung des Intern, durch eine untere Spitze Jitter über Studien angegeben.
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Discussion
In diesem Text eine vollständige Protokoll für die Durchführung von Echtzeit wurde mit geschlossener Schleife einzelne Zelle elektrophysiologischen Experimenten beschrieben, mit Hilfe der Patch-Clamp-Technik und eine kürzlich entwickelte Softwaretools genannt LCG. Um die Qualität der Aufnahmen zu optimieren, ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Aufnahme-Setup ordnungsgemäß geerdete, geschirmte und vibrationsfrei sein: Damit wird sichergestellt, stabilen und dauerhaften Ganzzell-Zugriff auf die Zelle, die zusammen mit der Möglichkeit der Automatisierung ganzer Abschnitte der Stimulationsprotokolle , ermöglicht die Maximierung des Durchsatzes des Experiments.
In zwei Fällen LCG angewendet wurden vorgestellt, nämlich die Charakterisierung einer Zelle in Bezug auf seine elektrophysiologischen Eigenschaften (Abbildung 1), einschließlich der schnellen Berechnung der aktiven Eingabe-Ausgabe-Beziehung eines Neurons und der Erholung in vivo -ähnlichen Aktivität in einem Hirnschnitt (Abbildung 2). Such Anwendungen gezeigt, wie man verschiedene Protokolle bauen und hob einige der auffälligsten Merkmale der LCG: seine Kommandozeilen-Schnittstelle macht es geeignet für die Skripterstellung, die die automatische Anwendung einer Reihe von Protokollen ermöglicht. Zusätzlich kann, wie in Figur 1 durchgeführt, die Werte von einem Protokoll extrahiert können maßgeschneiderte Parameter der nachfolgenden Protokollen verwendet werden.
Es ist möglich, in Echtzeit zu überwachen höherer Ordnung Merkmale der Antwort der Zelle unter Analyse (zB seinen momentanen Feuerungsrate, wie in 1D gezeigt ist) und anschließend die Stimulation entsprechend, zum Beispiel durch Verwendung eines PID-Reglers, um den Strom zu berechnen, erforderlich ist, um eine konstante oder zeitlich variierenden Feuerrate aufrecht zu erhalten.
Die Umsetzung der Leitfähigkeit und dynamische Klemm Protokolle mit LCG ist einfach und erfordert nur einen Text schreiben Konfigurationsdatei, ein Verfahren, das durch die Verwendung von s automatisiert werden könnenUmset Skripte. LCG umfasst mehr als 30 Einheiten, die miteinander verbunden werden, um neue Versuchsprotokolle erarbeiten werden. Wir beschrieben, wie man LCG verwenden mithilfe einer Befehlszeilenschnittstelle jedoch eine grafische Experiment Werfer wurde entwickelt, um zu erleichtern Startversuche und Ändern von Parametern, indem nicht-erfahrene Benutzer verbinden LCG-Befehle, um ihre eigene grafische Benutzeroberflächen erstellen.
Zwei bestehende Toolboxen bieten ähnlich LCG Funktionalitäten: RELACS und RTXI. Das erstere ist sowohl eine Plattform zum Durchführen elektrophysiologischen Experimenten und zur Analyse und Kommentieren der aufgezeichneten Daten. Der Hauptunterschied zwischen LCG und bestehende Lösungen ist die Benutzeroberfläche auf der Grundlage einer Befehlszeile. Die Vorteile dieses Ansatzes sind mehrere: Erstens ermöglicht eine Befehlszeilenschnittstelle Automatisierung standardisierter und sich wiederholende Aufgaben durch möglicherweise komplexe Skripte und zum anderen ermöglicht es die Einbettung experimentelle Versuche in komplizierter Workflows implementiertin High-Level-Skriptsprache, wie Matlab oder Python.
Zusammenfassend ist der modulare Charakter der LCG ermöglicht die Erweiterung der Anzahl der verfügbaren Versuchsprotokollen in zwei Arten: das erste und einfachste ist man durch Schreiben ad hoc-Konfigurationsdateien, die die vorhandenen Objekte zu verwenden, neue Protokolle auszuführen. Das zweite ist durch die Implementierung - mit C ++ - neue Grundobjekte, die verwendet werden können, um die Funktionen und Merkmale der LCG weiter ausbauen. Die Beispiele in diesem Protokoll Anliegen präsentiert die Studie von einzelnen Zellen in Gehirnschnitten. Jedoch ähnlichen Protokollen kann auch erfolgreich in in vivo Zubereitungen angewendet werden, um sowohl intrazelluläre als auch extrazelluläre Signale zu erfassen und in ex vivo-Präparate wie neuronalen Kulturen, zu erfassen, zum Beispiel extrazellulären Potentials durch Multi-Elektroden-Arrays während die Stimulierung in geschlossenen Schleife 4.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue slicer | Leica | VT-1000S | |
| Pipette puller | Sutter | P-97 | |
| Pipettes | WPI | 1B150F-4 | 1.5/0.84 mm OD/ID, with filament |
| Vibration isolation table | TMC | 20 Series | |
| Microscope | Leica | DMLFS | 40X Immersion Objective |
| Manipulators | Scientifica | PatchStar | |
| Amplifiers | Axon Instruments | MultiClamp 700B | Computer controlled |
| Data acquisition card | National Instruments | PCI-6229 | Supported by Comedi Linux Drivers |
| Desktop computer | Dell | Optiplex 7010 Tower | OS: real-time Linux |
| Oscilloscopes | Tektronix | TDS-1002 | |
| Perfusion Pump | Gibson | MINIPULS3 | Used with R4 Pump head (F117606) |
| Temperature controller | Multichannel Systems | TC02 | PH01 Perfusion Cannula |
| Manometer | Testo | 510 | Optional |
| Incubator | Memmert | WB14 | |
| NaCl | Sigma | 71376 | ACSF |
| KCl | Sigma | P9541 | ACSF, ICS |
| NaH2PO4 | Sigma | S3139 | ACSF |
| NaHCO3 | Sigma | S6014 | ACSF |
| CaCl2 | Sigma | C1016 | ACSF |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | ACSF |
| Glucose | Sigma | G7528 | ACSF |
| K-Gluconate | Sigma | G4500 | ICS |
| HEPES | Sigma | H3375 | ICS |
| Mg-ATP | Sigma | A9187 | ICS |
| Na2-GTP | Sigma | 51120 | ICS |
| Na2-Phosphocreatine | Sigma | P7936 | ICS |
References
- Saleem, A. B., Ayaz, A., Jeffery, K. J., Harris, K. D., Carandini, M. Integration of visual motion and locomotion in mouse visual cortex. Nature neuroscience. 16, 1864-1869 (2013).
- Ahrens, M. B., Li, J. M., et al. Brain-wide neuronal dynamics during motor adaptation in zebrafish. Nature. 485 (7399), 471-477 (2012).
- Paz, J. T., Davidson, T. J., et al. Closed-loop optogenetic control of thalamus as a tool for interrupting seizures after cortical injury. Nature neuroscience. 16 (1), 64-70 (2013).
- Wallach, A., Eytan, D., Gal, A., Zrenner, C., Marom, S. Neuronal response clamp. Frontiers in neuroengineering. 3 (April), 3 (2011).
- Linaro, D., Couto, J., Giugliano, M. Command-line cellular electrophysiology for conventional and real-time closed-loop experiments. Journal of neuroscience. 230, 5-19 (2014).
- Sharp, A., O’Neil, M., Abbott, L. F., Marder, E. Dynamic clamp: computer-generated conductances in real neurons. Journal of neurophysiology. 69 (3), 992-995 (1993).
- Robinson, H. P., Kawai, N. Injection of digitally synthesized synaptic conductance transients to measure the integrative properties of neurons. Journal of neuroscience methods. 49 (3), 157-165 (1993).
- Vervaeke, K., Hu, H., Graham, L. J., Storm, J. F. Contrasting effects of the persistent Na+ current on neuronal excitability and spike timing. Neuron. 49 (2), 257-270 (2006).
- White, J. A., Klink, R., Alonso, A., Kay, A. R. Noise from voltage-gated ion channels may influence neuronal dynamics in the entorhinal cortex. Journal of neurophysiology. 80 (1), 262-269 (1998).
- Destexhe, a, Rudolph, M., Fellous, J. M., Sejnowski, T. J. Fluctuating synaptic conductances recreate in vivo-like activity in neocortical neurons. Neuroscience. 107 (1), 13-24 (2001).
- Fellous, J. -M. Regulation of Persistent Activity by Background Inhibition in an In Vitro Model of a Cortical Microcircuit. Cerebral Cortex. 13 (11), 1232-1241 (2003).
- Gal, A., Eytan, D., Wallach, A., Sandler, M., Schiller, J., Marom, S. Dynamics of excitability over extended timescales in cultured cortical neurons. The Journal of neuroscience. the official journal of the Society for Neuroscience. 30 (48), 16332-16342 (2010).
- Wang, Y., Toledo-Rodriguez, M., et al. Anatomical, physiological and molecular properties of Martinotti cells in the somatosensory cortex of the juvenile rat. The Journal of physiology. 561 (Pt 1), 65-90 (2004).
- Wang, Y., Gupta, A., Toledo-Rodriguez, M., Wu, C. Z., Markram, H. Anatomical, physiological, molecular and circuit properties of nest basket cells in the developing somatosensory cortex). Cerebral cortex (New York, N.Y). 12 (4), 395-410 (1991).
- Brette, R., Piwkowska, Z., et al. High-resolution intracellular recordings using a real-time computational model of the electrode. Neuron. 59 (3), 379-391 (2008).
- Rutishauser, U., Kotowicz, A., Laurent, G. A method for closed-loop presentation of sensory stimuli conditional on the internal brain-state of awake animals. Journal of neuroscience. 215 (1), 139-155 (2013).
- Margrie, T., Brecht, M., Sakmann, B. In vivo, low-resistance, whole-cell recordings from neurons in the anaesthetized and awake mammalian brain. Pflugers Archiv European Journal of Physiology. 444 (4), 491-498 (2002).
- Graham, L., Schramm, A. In Vivo Dynamic-Clamp Manipulation of Extrinsic and Intrinsic Conductances: Functional Roles of Shunting Inhibition and I BK in Rat and Cat Cortex. Dynamic Clamp: From Principles to Applications. , (2008).
- Sakmann, B., Neher, E. Single-channel recording. , (1995).
- Molleman, A. Patch Clamping. , John Wile., & Sons, Ltd. Chichester, UK. (2002).
- Davie, J. T., Kole, M. H. P., et al. Dendritic patch-clamp recording. Nature Protocols. 1 (3), 1235-1247 (2006).
- Gold, R. The Axon Guide for Electrophysiolog., & Biophysics Laboratory Techniques... , (2007).
- Mainen, Z. F., Sejnowski, T. J. Reliability of spike timing in neocortical neurons. Science. 268 (5216), 1503-1506 (1995).
- Buzsáki, G. Action potential threshold of hippocampal pyramidal cells in vivo is increased by recent spiking activity. Neuroscience. 105 (1), 121-130 (2001).
- Koch, C., Segev, I. Methods in Neuronal Modeling: From Synapses to Networks. , MIT Press. Cambridge, MA, USA. (1988).
- Silberberg, G., Markram, H. Disynaptic inhibition between neocortical pyramidal cells mediated by Martinotti cells. Neuron. 53 (5), 735-746 (2007).
- Berger, T. K., Silberberg, G., Perin, R., Markram, H. Brief bursts self-inhibit and correlate the pyramidal network. PLoS biology. 8 (9), (2010).
- Tsodyks, M., Pawelzik, K., Markram, H. Neural networks with dynamic synapses. Neural computation. 10 (4), 821-835 (1998).
- Kapfer, C., Glickfeld, L. L., Atallah, B. Supralinear increase of recurrent inhibition during sparse activity in the somatosensory cortex. Nature. 10 (6), 743-753 (2007).
