Summary
Os protocolos descrevem dois sistemas in vitro de testes de toxicidade de desenvolvimento (UKK e UKN1) com base em células estaminais embrionárias humanas e estudos de transcriptoma. Os sistemas de teste prever risco de toxicidade para o desenvolvimento humano, e pode contribuir para reduzir os estudos em animais, dos custos e do tempo necessário para os testes de segurança química.
Abstract
Protocolos eficientes para diferenciar as células-tronco pluripotentes humanas para vários tecidos em combinação com tecnologias -ómicas abriu novos horizontes para em testes de toxicidade in vitro de potenciais drogas. Para fornecer uma base científica sólida para tais ensaios, será importante para obter informação quantitativa sobre o curso do tempo de desenvolvimento e sobre os mecanismos regulatórios subjacentes por abordagens de biologia de sistemas. Dois ensaios foram, portanto, ligado aqui para esses requisitos. No sistema de teste UKK, células estaminais embrionárias humanas (células estaminais embrionárias humanas) (ou outras células pluripotentes) são deixados diferenciar espontaneamente durante 14 dias em corpos embrióides, para permitir a geração de células de todas as três camadas germinais. Este sistema recapitula principais etapas do desenvolvimento embrionário humano cedo, e ele pode prever-humano específico cedo embrionário toxicidade / teratogenicidade, se as células são expostas a produtos químicos durante a diferenciação. O sistema de teste baseia-se na UKN1 células estaminais embrionárias humanas diferenciação para um populatião de neuroectodérmico progenitoras (NEP) células durante 6 dias. Este sistema recapitula o desenvolvimento neural precoce e prevê neurotoxicidade de desenvolvimento precoce e alterações epigenética desencadeadas por agentes químicos. Ambos os sistemas, em combinação com estudos de transcriptoma de microarray, são adequados para a identificação de biomarcadores de toxicidade. Além disso, eles podem ser utilizados em combinação para gerar dados de entrada para análise biologia sistemas. Estes sistemas de teste tem vantagens sobre os estudos toxicológicos tradicionais requerem grandes quantidades de animais. Os sistemas de teste pode contribuir para uma redução dos custos de desenvolvimento de medicamentos e avaliação da segurança química. Sua combinação lança luz especialmente em compostos que podem influenciar o neurodesenvolvimento especificamente.
Introduction
A capacidade das células-tronco embrionárias humanas (hESC) para se diferenciar em vários tipos de células abriu uma nova era de testes in vitro de toxicidade 1, modelagem de doença e medicina regenerativa 2. As células-tronco são dotados com a capacidade de se auto-replicar, para manter seu estado pluripotente, e se diferenciar em células especializadas 3,4. As propriedades de células estaminais embrionárias humanas (capacidade de se diferenciar para todos os principais tipos de células) são encontrados também em outras células estaminais pluripotentes humanas, tais como células pluripotentes estaminais humanas induzida (hiPSC) ou células geradas pela transferência nuclear 5. Por exemplo, muitas linhas hESC diferentes foram diferenciadas em neurônios, células renais 6 7, células da crista neural 8, 9-12 cardiomiócitos, ou hepatócitos como células 13,14. Além disso, hESC pode diferenciar espontaneamente em células das três camadas germinativas 15-18 em corpos embrióides (EBS) 19,20. Edesenvolvimento embrionário arly é regulada pela expressão diferencial de vários genes relacionados com as diferentes camadas germinativas, que foi capturado em nível mRNA por transcriptomics utilizam a tecnologia de microarray 15. Esses esforços resultaram no estabelecimento de modelos toxicológicos específicos de órgãos com base em hESC / hiPSC e análise transcriptomics (para revisão ver 21,22). Estes modelos têm vantagens sobre o uso tradicional de animais de laboratório para estudos toxicológicos, como estudos pré-clínicos com animais de laboratório nem sempre são preditivos de segurança humana. As toxicidades induzidas por drogas encontradas em pacientes estão frequentemente relacionadas com processos metabólicos ou sinalização que diferem entre humanos e animais experimentais. A diferença espécies impediu a detecção precoce confiável de tóxicos no desenvolvimento dos seres humanos, e para as drogas de instância como a talidomida 23,24 e 25,26 dietilestilbestrol foram retirados do mercado devido à teratogenicidade. ThaliDomide não demonstrou qualquer toxicidade para o desenvolvimento em ratos ou camundongos. Produtos químicos ambientais, tais como o metilmercúrio 27 resultou em efeitos tóxicos no desenvolvimento pré-natal no que diz respeito ao sistema nervoso em várias espécies, mas manifestações humanas têm sido difíceis de modelar em animais. Para resolver o problema das questões especificidade das espécies, os cientistas que trabalham em diferentes projetos baseados em células-tronco como Reprotect, ESNATS, DETETIVE etc. estão envolvidos no desenvolvimento de diferentes modelos de toxicidade embrionária, neurotoxicidade, cardiotoxicidade, hepatotoxicidade e nefrotoxicidade usando tóxicos humanos suspeitos de afetar os seres humanos. No âmbito do projecto consórcio europeu "Embryonic baseada em células-tronco Novel estratégias de ensaio alternativas (ESNATS) 'cinco sistemas de teste foram estabelecidas. Um sistema de teste do chamado UKK (U niversitäts k linikum K OLN) sistema de teste capta parcialmente o desenvolvimento embrionário humano precoce. Neste sistema células H9 embrionárias humanas são diferenciados em três camadas germinativas (ectoderma, endoderme e mesoderme) 15 e da camada de germe de assinaturas específicas foram capturados por transcriptomics perfil usando a plataforma de microarray Affymetrix. Vários tóxicos desenvolvimento como talidomida 28, ácido valpróico, metil-mercúrio 16,17, ou citosina arabinósido 15 foram testadas neste sistema, e as assinaturas de genes tóxicos específicos foram obtidas. Num segundo sistema de teste, a chamada do UKN1 (L NIVERSIDADE de K onsta n z) um sistema de teste, as células H9 são diferenciadas de células progenitoras neuroectodérmica (NEP) durante 6 dias. Isto é evidenciado pela elevada expressão de genes marcadores neurais tal como PAX6 e OTX2. Durante a diferenciação durante 6 dias, as células de NEP foram expostos ao desenvolvimento neuro-tóxicos, tais como VPA, metil-mercúrio. Perfis específicos-Toxicant regulada-transcriptômica de ter sido obtidefinida como bem usando a plataforma de microarray Affymetrix 16,29.
A nova visão para a toxicologia do século 21, prevê que sistemas de teste que não só deu descrições fenotípicas como histopatologia in vivo, ou mudanças transcriptoma no final de incubações tóxicos a longo prazo. Ao contrário, ela sugere que as análises de fornecer informações mecanicista 3, e que esta informação pode ser mapeado para os chamados caminhos adversos resultado (AOP) que fornecem uma justificativa científica para efeitos perigosos 30. Para fornecer essas informações, os sistemas de ensaio aplicados têm de ser altamente qualidade controlada 31, como por exemplo documentado por procedimentos de operação padrão robustos. Além disso, as alterações dependentes do tempo têm de ser mapeada com alta resolução. Isto requer sistemas de teste com mudanças sincronizadas 32. Os sistemas de teste UKN1 e UKK aqui descritos foram otimizados para esses requisitos.
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Protocol
O protocolo a seguir foi realizada utilizando linha Embryonic Stem Cell humana (hESC) H9. Esta linha celular foi rotineiramente cultivadas no rato mitotically inativada fibroblastos embrionárias (MEFs) em meios de cultura de células estaminais embrionárias humanas suplementadas com bFGF e, em seguida, cultivadas em meio de células-tronco em seis centímetros placas de Petri revestidas com matriz da membrana basal, como matrigel, para se livrar de MEFs. As células H9 de> 80% de placas confluentes foram utilizados para nova passagem. Células H9 cultivadas em placas de matriz da membrana basal foram usadas para a formação de EBS. Todos os procedimentos mencionados na seguinte protocolo foram realizados usando métodos padrão para as práticas de cultura de células assépticas e boas.
Parte 1. Sistema de teste UKK
1. A cultura embrionárias humanas Stem Cell
- Splitting e manutenção de H9 em células alimentadoras
- Pipetar 0,1 ml de 2% de gelatina em cada seis centímetros placa e incubar durante 30 min em cultura de células incubador (37 ° C e 5% de CO 2). Aspirar solução de gelatina com pipeta Pasteur estéril.
- Adicionar 2 ml de meio contendo MEF 0,1 x 10 6 MEF células / ml para as duas placas revestidas com gelatina e incubar-los em cultura de células incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) O / N.
- No dia seguinte, remove as células H9 frasco a partir do tanque de armazenamento de azoto líquido usando uma pinça e descongelar o frasco num banho de água a 37 ° C usando pinças compridas.
- Retirar o frasco do banho de água, banho com etanol a 70%, em ar seco a cabine de segurança biológica, durante 15 a 30 seg e transferência das células para 15 ml de tubo Falcon.
- Adicionar 9 ml de meio de cultura de H9 lentamente sobre a parede interna e centrifugar as células a 200 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e re-suspender as células em meio de cultura contendo 6 ml inibidor ROCHA (10 �, Y27632) e gentilmente pipeta para misturar. Aspirar o meio do MEF placa de 6 cm, e adicionar 3 ml de suspensão de células em cada placa. Mudar a forma de day 3 e, em seguida, todos os outros dias. Subcultura> 80% de células de placas confluentes com relação de divisão 1: 3.
Nota: Normalmente em 5 a 7 dias placa torna-se confluentes. Alimentadores usados são obtidos a partir de ratinhos CF1 embrião e inactivado por exposição a radiação γ.
- Cultura de células H9 em placas de matriz de membrana basal revestidos
- Meio de células-tronco Thaw (5x) suplemento à temperatura ambiente e adicionar 100 ml para 400 ml de meio basal em cabine de segurança biológica.
- Matriz da membrana basal Thaw no gelo. Adicionar o volume sugerido de matriz de membrana basal (ver Certificado de Análise para cada lote) em 24 ml refrigerados DMEM / F-12, meio basal de doze placas de 6 centímetros. Misturar por pipetagem cima e para baixo.
- Adicionar 2 ml em cada placa de 6 centímetros. Manter a placa à temperatura ambiente durante 1 h. Remover o meio e adicionar 2 ml de meio de células-tronco.
- Retire quatro placas H9 confluentes em MEFs. Retirar as colônias diferenciados com 1 ml da ponteira sob lupa mantido no gabinete de biossegurança.
- Aspiradoa forma e lava-se as células com 4 mL de PBS e adiciona-se 2 ml de meio de células estaminais em cada placa. Cortar as colônias indiferenciadas com 26 G agulha para 6-9 peças cada.
- Gentilmente recolher as células em 50 ml tubo falcon. Centrifugar a 200 xg durante 5 min.
- Aspirar o sobrenadante e re-suspensão em 12 ml tronco meio celular. Contagem as touceiras, colocando 20 l em lâmina de vidro sob o microscópio e ajustar o volume para 150 touceiras por ml. Adicionar 2 ml de suspensão em cada placa de 6 centímetros.
- Mover as placas para trás e para a frente e lado-a-lado movimentos para distribuição uniforme clump e incubar as placas na incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO 2).
- Retirar as colônias diferenciados e dar o troco médio em dias alternados.
2. corpos embrióides (EB) Formação
Praticar todos os procedimentos referidos a seguir como por cuidados de assepsia e no gabinete de biossegurança.
- Dia 0 & #8212; Plaqueamento de células H9 em placas de fundo em V
- Prepare copolímero em bloco 5%, tal como Pluronic F 127 em PBS e filtrar através de sistema de filtração a vácuo impulsionado usando 0,22 um filtro estéril.
- Revestimento V placas de 96 poços de fundo com 40 ul de 5% de copolímero em bloco por poço e incubar à TA durante 45 min.
- Remova as placas confluentes porão matriz membrana com células H9 da incubadora e remover as colônias diferenciados com 1 ml da ponteira sob lupa no gabinete de biossegurança.
- Aspirar o meio e lava-se as células com 4 ml de PBS. Adicione 2 ml meio de diferenciação aleatório (H9 meio de cultura sem bFGF, médio RD) em cada placa. Use a ferramenta de passagem e cortar as colônias de células H9 em aglomerados de tamanho e forma uniforme através da observação sob lupa no gabinete de biossegurança e em seguida, raspar delicadamente com o raspador de células.
- Recolher os aglomerados em 50 ml de tubo Falcon e centrifugar a 200 xg durante 5 min. Aspirar o sobrenadante e suspender novamente o cell em meio RD para obter 1.000 touceiras por ml.
- Aspirar o copolímero em bloco de placas de fundo V. Despeje os aglomerados em placa quadrada estéril e com a ajuda de pipeta multicanal adicionar 100 ml de suspensão a cada poço da placa de fundo V.
- Para a agregação força de aglomerados, centrifugar as placas de fundo V a 4 ° C durante 4 minutos a 400 x g. Incubar as placas na incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO 2) durante quatro dias.
- Dia 4 - Coleção da EBS
- Recolher as EBs na placa quadrada estéril de placas de fundo V usando pipeta multicanal e largas furo 200 dicas ul.
- Recolher as EBs de placa quadrada estéril no tubo de 15 ml falcão com 10 ml de pipeta estéril sorológica. Permitir EBs de se contentar com 2 min. Aspirar o sobrenadante e lavar os CEs com 5 ml de PBS.
- Permitir EBs de se contentar com 2 minutos e aspirar o sobrenadante. Re-suspender EBs em meio 5 ml RD.
- Pipeta médio RD 10 ml em 10 centímetrosplacas bacteriológicos. Transfira as EBs em placas bacteriológicos 10 centímetros.
- Incubar as placas bacteriológicas em agitador horizontal (movimento de vaivém movimento 50 / min) mantidas em cultura de células incubadora (37 ° C e 5% de CO 2) durante período de tempo necessário. Dê mudança de meio (15 ml de meio de RD) em dias alternados.
Nota: A manipulação delicada é necessária durante a cultura hESCs. O tamanho varia de EBs no dia 4. Selecione as EBs de tamanho uniforme (± 20%), observando sob lupa para obter mais experiência. Aproximadamente 50% EB formados com este método são de tamanho uniforme. A transferência de EBS em resultados shaker em forma uniforme.
3. Ensaio de citotoxicidade para o IC 10 Determinação
- Transferência de EBS em placas de fundo ópticos
- Descongelar gelatina a 0,1% em banho de água a 37 ° C durante 15 placas de fundo mínimo ópticos e revestimento com 50 ul de 0,1% de gelatina por poço utilizando uma pipeta multicanal. Incubar as placas à temperatura ambiente durante45 min. Após incubação aspirar a gelatina a partir de placas de fundo ópticos.
- Retire as EBs recolhidas no dia 4 em placa de 10 cm bacteriológico contendo meio RD.
- Manter placas de fundo ópticos em posição inclinada em cabine de segurança biológica. Transferência de dois tamanho uniforme da EBS em 100 ul por meio de RD bem na óptica inferior placa de 96 poços através da observação sob lupa. Mantenha 12ª coluna vazia.
- Incubar as placas na incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO 2) durante 24 h.
- Exposição da droga a partir do dia 5 ao dia 14
- Pesa-se o composto de teste e tornar mais alta concentração no solvente conhecido.
- Realizar diluição semi-logarítmica do composto de teste em série até 8 diluições em solvente contendo tubos falcon numeradas com A a H, manter o tubo não. I, como controlo de veículo, não tubo. J como controle negativo (meio RD) eo tubo não. K como positivo (70% de etanol) controle.
- Descongele o meio RD em banho-maria a 37° C durante 15 min. Retire 5 ml de meio de cada RD em 11 tubos falcon estéreis rotulados 1-11.
- Transferência de 5 ul de solução de tubo de A a K em tubo para tubo 1 a 11, respectivamente, e os tubos vortex. Retire a placa de fundo óptico da incubadora e remova cuidadosamente a mídia com o uso de uma pipeta multicanal.
- Adicionar 200 ul de meios de tubo número 1 a 11 para as respectivas colunas da placa de fundo óptico. Dê mudança / droga médio em dias alternados.
Nota: Para diluições semi-logarítmica tomar 6,48 mL de solventes em 7 tubos rotulados de 2 a 8. A partir de Transferência no.1 tubo concentração 3 ul para no.2 tubo, vortex e transferir serialmente 3 ul para o próximo tubo. Mantenha no.9 tubo para o controle do veículo e no.10 tubo para o controle negativo. Tubo no.11 é o etanol 70%.
- Medição da exposição Resazurina e fluorescência: Dia 14
- Descongelar meio RD em banho de água a 37 ° C durante 15 min. Executar todas mentio procedimenton abaixo na ausência de luz na cabine de segurança biológica.
- Tome médio de 10 ml RD em 15 ml de tubo (A) e adicionar o volume recomendado de reagente resazurina e misture por pipetagem. Retire a placa de fundo óptico da incubadora e remova cuidadosamente todo o meio com pipeta multicanal.
- Adicionar 100 ul de meio de tubo de A em cada poço. Incubar a placa na incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO 2) durante 90 min.
- Medir a fluorescência usando o espectrofotómetro (560 Ex / Em 590).
- IC determinação de valor 10
- Importe os valores do gráfico pad prisma depois de subtrair os valores em branco. Conjunto eixo x como uma dose e eixo-y em unidades de fluorescência.
- Normalizar os valores para se obter percentagem no eixo y e transformar os valores (eixo-x como escala log). Calcule IC50 valor usando resposta de dose sigmoidal (declive variável) parâmetro. Calcule log IC 10 valores usando seguinteequação:
F = 50 = 10 LogEc logECF - (1 / hillslope) * log (F / (100-F))
Y = + inferior (Top-Bottom) / (1 + 10 ^ ((LogEc 50 -X) * hillslope)) - Determinar o IC 10 valores a serem tomadas para estudos posteriores.
4. Estudo de biomarcador baseado em microarrays
- Dia 0 ao dia 5:
- Formação de corpos embrióides e transferência para placas de 10 cm bacteriológicas - siga os passos referidos no ponto 2 para a formação de corpo embryoid.
Nota: Use três repetições biológicas para cada estudo. Divida cada replicar em duas partes biológico - O tratamento medicamentoso no IC 10 concentração e controle do veículo. Prepare a concentração da droga 10.000 vezes acima da concentração IC 10 no veículo e deste adicione 10 ml a 100 ml de meio de RD com aglomerados de células H9 em 50 ml tubo Eppendorf de misturar bem e sementes-lo em placas de fundo V. Siga o mesmo procedimento para o grupo de controlo do veículo.
<li> Para a exposição de drogas no dia 5 a 14, recolher os EB's e transferi-los em placas de 10 cm bacteriológicos no dia 4 de acordo com as etapas mencionadas no ponto 2. Transferir as placas no agitador horizontal (reciprocidade movimento 50 / min) em incubadora de cultura de células (37 ° C e 5% de CO 2) durante 14 dias. Dê mudança médio em dias alternados. - Formação de corpos embrióides e transferência para placas de 10 cm bacteriológicas - siga os passos referidos no ponto 2 para a formação de corpo embryoid.
- Para a coleta de amostra, no dia 14, recolher as EBs de placas de 10 centímetros para 15 ml tubo falcon com pipeta estéril sorológica. Permitir EBs de se contentar com 2 min. Aspirar o sobrenadante e lavar os CEs com 5 ml de PBS. Permitir EBs de se contentar com 2 minutos e aspirar o sobrenadante. Re-suspender EB em 1 ml de solução RNAlater ou reagente TRIzol, vórtice e armazenar a amostra a -80 ° C até posterior processamento.
Nota: Execute todos os procedimentos em cabine de segurança biológica de acordo com as boas práticas laboratoriais. Rodar as placas em movimento circular em torno do centro para trazer todos os CEs no centro, aspirar o meio a partir circundante, com a ajuda de pastu vidro estérilre pipeta, adicionar 15 ml de meio de RD e, em seguida, adicionar 15 ul de fármaco / veículo para respectivo grupo.
5. Isolamento de ARN e o teste de integridade
- Isolamento de ARN:
A maior parte dos passos abaixo indicados são para ser realizado para a purificação de ARN utilizando RNeasy Mini Kit de acordo com o manual de instruções. Use sempre tubos livres nuclease, pontas para pipetas e água. Enquanto trabalhava com TRIzol realizar todo procedimento no capô de segurança química e usar óculos de proteção, bem como luvas de proteção química.- Descongelar as amostras em gelo. Se as amostras são armazenadas em solução RNAlater, centrifugar os tubos a 12.000 xg durante 5 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de reagente TRIzol.
- Tritura-se as amostras utilizando 24 g da agulha e seringa de 1 ml. Cerca de 15 vezes a trituração é suficiente para a ruptura de EBS, parede celular e membranas plasmáticas.
- Adicionar 200 ul de clorofórmio em cada amostra. Vortex para misturar o conteúdo de maneira uniforme. Centrifugadora 12.000 xg durante 15 min a 4 ° C. Remova as colunas de spin RNeasy mini, tubos de 1,5 ml e rotulá-los corretamente.
- Recolhe-se o sobrenadante em tubos de 1,5 ml (Durante a recolha sobrenadante não perturbar o meio ou camada inferior). Adicionar um volume igual de etanol a 70% gelada. Misture o conteúdo, agitação suave.
- Aplicar 700 mL de tubos para respectivas colunas mini-rotação e centrifugar-los a 12.000 xg durante 20 segundos à temperatura ambiente. Executar todas as outras etapas na RT.
- Descarte o filtrado e aplicar a solução restante para as respectivas colunas e centrifugar-los a 12.000 xg por 20 s. Descartar o filtrado.
- Aplicar 350 ul de tampão RW1 à coluna e centrifugar para a 12.000 xg durante 20 seg. Descartar o filtrado e aplicar 10 ul de DNase e RDD tampão 70 ul para a coluna.
- Incubar à temperatura ambiente durante 15 min. Aplicar 350 ul de tampão RW1 à coluna e centrifugar para a 12.000 xg durante 20 seg. Descartar o filtrado. Aplicar 500 ul deRPE tampão de lavagem para a coluna e centrifugar para a 12.000 xg durante 20 seg. Descartar o filtrado. Novamente Aplicar 500 ul de tampão de lavagem RPE para a coluna e centrifugar para a 12.000 xg durante 2 min. Descartar o filtrado.
- Deslocar as colunas para novos tubos de recolha de 2 ml e centrifugar para a 12.000 xg durante 1 min. Transfira as colunas para tubo de 1,5 ml rotulado coleção e aplicar 22 mL de água livre de nuclease. Centrifugar os tubos a 12.000 xg durante 1 min.
- Retire o tubo de coleta e colocá-los no gelo. Quantificar RNA usando o sistema de eletroforese automatizada.
- A concentração de RNA, pureza e teste de integridade.
Para pureza e integridade RNA testando o uso sistema automatizado de eletroforese e respectivo kit 33.
6. Estudos Microarray
- Execute perfil transcricional uso de chips de matriz disponíveis Humanos comerciais. Para a preparação alvo de ARN, a fragmentação, hibridação 34 e matrizcoloração de chips, lavagem 35 de uso comercial kits disponíveis.
- Execute matriz digitalização chip e controlo de qualidade, utilizando estação fluídica padrão, scanners e softwares de matriz operacionais padrão 36. Para análise de expressão gênica importar os arquivos gerados a partir de scanners ao software comercial disponível padrão 37, faça a correção de fundo, sumarização e normalização com Robust Multi-matriz Análise (RMA).
- Para a lista de genes diferencialmente expressos obtenção (de DEG) execute uma forma análise ANOVA. A partir desta lista filtrar os genes com base na mudança de dobragem (± 2) e p-valor controlado-FDR (<0,05). Obter a Análise de Componentes Principais (PCA), Mapa de Calor, etc. usando este software.
Parte 2. Sistema UKN 1 Teste
1. A manutenção de células estaminais embrionárias humanas
- Sementeira de MEFs
- Para a diferenciação usar o NSCB # 8534 (H9) linha celular. Cultura cells em fibroblastos de rato embrionárias (MEFs) como células alimentadoras. Revestimento frasco T25 com 4 ml de gelatina a 0,1% e incubar durante 30 min a 37 ° C.
- MEFs descongelamento em temperatura de 37 ° C banho de água e transferir as células em pré-aquecido DMEM / FBS a 10%.
- Rotação 3,5 min com 500 xg, remover o sobrenadante e as células re-suspensão para se obter 1 x 10 7 células / ml. MEFs placa 4 x 10 4 / cm 2 em frascos T25 em gelatina. Opcionalmente, use as MEFs para os próximos dois dias. Qualidade de lotes MEF são uma questão muito crítica para a manutenção hESC. Portanto, é aconselhável para elucidar melhor a empresa e método de preparação para as células H9. Nós usamos PMEF P3.
- Splitting e manutenção de H9
- Adicionar 1 ml de dispase pré-aquecido por balão T25 e incubar H9 9 min a 37 ° C.
- Adicionar 2 ml de meio de lavagem para células tratadas e dispase pipeta 5 vezes para cima e para baixo com uma pipeta de 5 ml e uma solução de células de transferência para um tubo Falcon.
- Lavar o frasco com 9 ml de meio de lavageme adicionar as células aos outros. Gire 3,5 min com 500 xg, remover o sobrenadante e células em meio de 10 ml hESC re-suspensão.
- Gire 3,5 min com 500 xg, remover o sobrenadante e células em meio 4 ml hESC re-suspensão. Adicionar 0,5 ml de suspensão de células e 4,5 ml de meio hESC e placa em uma nova (PBS lavado) frasco T25 com MEFs. Mudar inteiro forma células estaminais embrionárias humanas (5 ml) do balão de todos os dias.
2. Diferenciação de células estaminais embrionárias humanas no sentido Neuroectodérmicos células progenitoras (NEP)
- Prepare meio hESC e médio KCM. Revestimento uma placa de 10 cm com gelatina (0,1% em PBS) por frasco T25 e incubar durante 30 min a 37 ° C. Remover o meio de células estaminais embrionárias humanas e adicionar Accutase suficiente para cobrir todo o fundo do frasco (1 ml por frasco T25) e incuba-se 25 a 30 min a 37 ° C.
- Prepare a placas revestidas com matriz de membrana basal durante Accutase incubação. Adicionar frio DMEM / F12 para congelado membrana basal matriz pellet e resolvê-lo 01:20. Filtro de membrana basal da matriz Solução através de um filtro celular de 40 um. Adicionar solução filtrada para chapear, toda a parte inferior tem de ser coberta (1 ml por 6 poços é necessária) e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente.
- Após o período de incubação remover a matriz sobrenadante membrana basal e as células de sementes nos poços revestidos. Após o passo Accutase (2.1) parar de reacção por adição de 1,5 ml de meio de HES. Raspe as células do frasco, adicionar 8 ml de meio hESC e produzir uma solução única célula por pipetagem com 10 ml pipeta completamente. Células filtrar através de um filtro de células 40 pm.
- Células Spin 3 min com 500 xg, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 10 ml de células estaminais embrionárias humanas. Células girar novamente 3 min com 500 xg, remover o sobrenadante e as células em células estaminais embrionárias humanas contendo inibidor ROCHA Y-27632 a uma concentração final de 10 uM re-suspender.
- Remover o sobrenadante de gelatina revestida prato. Suspensão de células em placa de gelatina revestida prato para remover os MEFs e deixar na incubadora durante exactamente 1 h.
NOTA: Durante esta etapa, os MEFs Will Settle sobre a placa de gelatina revestido, enquanto o hESC não pode anexar a gelatina. Por isso, esta é crucial para obter uma diferenciação livre-alimentador. É um passo crítico como incubação resultados muito longas em aglomerados hESC e muito curto de incubação na remoção ineficiente de MEFs. Após 45 min de incubação, a placa deve ser investigado para MEFs já se instalaram e touceiras hESC. - Quando as MEFs ter anexado, lavar suavemente as células não aderentes (células estaminais embrionárias humanas) fora após incubação com a forma já na placa. Se vários T25 foram usadas para obter mais células, as células individuais podem agora ser combinados. Lave placa uma vez com meio hESC.
- Células Spin 3 min com 500 xg, remover o sobrenadante e as células em cerca de 4 ml KCM contendo 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 e de 10 ng / ml de FGF-2 de re-suspender.
- Contagem de células em um hemocitómetro utilizando Trypan azul. Placa de 18 x 10 3 células / cm2 em matriz da membrana basal em placas revestidas KCM contendo 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 e10 ng / ml de FGF-2 (6 bem para utilizar 1,5 ml por poço). É crucial para a chapa das células na densidade certa para diferenciá-los com sucesso em NEPs.
- Após 24 h, a mudança do meio KCM fresco contendo 10 uM de inibidor ROCHA Y-27632 e de 10 ng / ml de FGF-2. Depois de mais de 24 horas, mudar de médio a KCM fresco contendo 10 ng / ml FGF2.
- 72 horas após a semeadura das células, a diferenciação começa pela mudança do meio em direção a médio KSR. Este ponto de tempo é referido como o dia 0 de diferenciação (DoD0). A adição de substâncias de ensaio é possível agora.
- Em DOD1 e DOD2 o meio é mudado exatamente como em DoD0. Próxima mudança médio está em DoD4 contendo 25% de N2-S e 75% KSR. No DoD6 a diferenciação é parado e as células são colhidas para análise.
3. imunoprecipitação da cromatina (ChIP) de hESC e NEP
- Preparação dos núcleos
- Adicionar 500 ul a cada 6 Accutase bem que deve ser analisada e incubar durante 25 a 30 min. Coucélulas nt em uma câmara de Neubauer utilizando Trypan azul.
- Ressuspender as células em formaldeído a 1% em meio DMEM / F12 para reticulação. Adicionar Tris pH 7,5 até uma concentração final de 125 mM depois de 10 minutos para interromper a reticulação.
- Células Spin 3 min com 500 xg, a 4 ° C, remover o sobrenadante e ressuspender as células em PBS frio.
- Células Spin 3 min com 500 xg, a 4 ° C, remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de tampão / L1- 1 x 10 6 células.
- Incubar durante 5 min em gelo. Rotação 5 min com 800 xg, a 4 ° C, remover o sobrenadante e re-suspensão núcleos em 1 ml de tampão / L2- 2 x 10 6 células.
- Sonication e controle de qualidade
- Sonicar de modo que os fragmentos de ADN de 300-700 pb de comprimento são gerados. Spin 1 min com 10.000 xg, a 4 ° C. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Os fragmentos necessitam de ter o tamanho correcto, caso contrário, a imunoprecipitação será ineficaz, assim como a qPCR seguido.
- Remover 50 pi anmix d com tampão L2 50 ul de verificar a eficiência de sonicação executando um gel de agarose.
- Inversa reticular por incubação a 65 ° C durante 4 horas e 500 rpm. Carregar as amostras 1: 5 com Orange G corante de carga sobre um gel de agarose a 1,5% e correr 45 min a 110 V, em tampão 1 x TBE. O tamanho do fragmento de controlo (deverá situar-se entre 300-700 pb).
- Cromatina imunoprecipitação
- Dilui-se as amostras 1: 5 em tampão de diluição e alíquota de 1 ml por PI em tubos siliconizados.
- Retirar a 5% (volume) de amostra diluída cromatina (passo 3.3.1) e armazenar a 4 ° C como "input".
- Incubar as amostras com anticorpos de sua escolha e com IgG inespecífica O / N a 4 ° C num rotor.
- Adicionar 50 ul de proteína A / G Sefarose grânulos de cada amostra após imunoprecipitação. Incubar as amostras 3 h a 4 ° C num rotor. Spin 1 min com 1.500 xg, a 4 ° C e remover o sobrenadante.
- Lava-se com 1 mL de pérolas de lavagem. Rotação 1 min com 1.500 xg, a4 ° C e remover o sobrenadante. Repita o passo g para h. Lava-se com 1 ml de tampão de lavagem final. Durante as etapas de lavagem você não deve perder qualquer das esferas, porque isso altera a quantidade de fluido diretamente.
- Centrifugar 1 min com 1.500 xg, a 4 ° C e remover o sobrenadante. Adicionar 125 ul de tampão de eluição e incubar 15 min com 65 ° C a 1000 rpm num agitador.
- Gire 1 min com 1.500 xg e transferir o sobrenadante para um novo tubo Repita etapa k e l. Adicionar 200 ul de tampão de eluição de entrada (3.3.2). Adicionar proteinase K e ARNase a cada amostra e incubar 30 min com 37 ° C a 500 rpm num agitador e depois de 4 h, com 65 ° C a 500 rpm num agitador.
NOTA: Para a extração de DNA uso comercial disponível chip de DNA Limpo e Concentrador Kit 38.
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Representative Results
Exposição ao mercúrio de metilo em sistema de teste UKK
O ensaio de citotoxicidade foi realizado com H9 EBS para obtenção de um valor de IC 10 (redução de viabilidade até 10%) para a citotoxicidade de metil-mercúrio (Figura 1). Também foi realizada uma microarray baseado (plataforma Affymetrix) estudo biomarcador. A H9 EB foram expostos ao mercúrio de metilo (0,25 e 1 uM) durante 14 dias. No dia 14, as amostras foram recolhidas utilizando TRIzol e o ARN foi isolado. Perfis de transcrição foi realizada utilizando Human Genome U133 fichas mais 2,0 de matriz. Os dados foram analisados com Partek Genomic Suíte TM 6.6. Resumo Em primeiro lugar os dados foram obtidos por Análise de Componentes Princípio (Figura 2A), a geração de diagramas de Venn (Figura 2B) e construção de mapas de calor (Figura 2C). A análise de componentes princípio representa a distribuição global da expressão gênica e claramente visualizado segregção de MeHg 1 pM do controlo de veículo e MeHg 0,25 uM grupos (PC # 25.2) (Figura 2A). Uma lista de genes diferencialmente expressos-(°) foi obtida após tratamento estatístico (one-way ANOVA) e de filtragem dos dados através de uma mudança de dobragem de corte de ± 2 e A (método de Hochberg-Benjamini) p-valor correcto da multiplicidade <0,05 (Tabela 1). O tratamento de 1 ^ M MeHg resultou em 276 degs e 0,25 uM em 31 degs (Figura 2B). O mapa de calor mostrou que MeHg um tratamento? M reduzida, principalmente expressão gênica (Figura 2C). A informação sobre genes sobre-representados termos ontologia foi obtido usando a ferramenta bioinformática DAVID. A Tabela 2 representa as categorias de genes sobre-representados GO que continham significativamente mais do que 5 genes. Foram identificados os fatores de transcrição regulados de deslocamento relacionados com o desenvolvimento do sistema nervoso. SEPP1, DDIT4, AK4, FRZB (desenvolvimento do cérebro), PITX (núcleo de desenvolvimento neural) e ErbB3, UGT8, APOB, APOA1 (desenvolvimento do sistema nervoso) foram para baixo-regulado de uma forma dependente da dose para o tratamento metil-mercúrio (Tabela 3).
UKN sistema de um teste
Este protocolo diferenciação usa dupla inibição SMAD 6 para gerar uma população pura de NEP no prazo de seis dias de diferenciação. As células resultantes são caracterizados por um aumento da regulação do neural genes precursores PAX6 e OTX2. Os marcadores de células tronco Oct4 e Nanog são regulados para baixo durante a diferenciação em relação NEP (Figura 3A). Devido à diferenciação altamente síncrona e homogénea, também é possível obter informação sobre as modificações de histonas durante esta fase inicial de desenvolvimento. Nós adaptado para o protocolo de imuno-precipitação cromatina (ChIP) utilizando as células, quer no início da diferenciação ou após 6 dias dediferenciação. Um interruptor de sítios de metilação sobre as regiões promotoras de PAX6 OTX2 e foi evidente a partir destes estudos (Figura 3B). Os sites de metilação investigados histona 3 lisina 4 trimethylation (H3K4me3) e histona 3 lisina 27 trimethylation (H3K27me3) foram altamente dinâmico durante a diferenciação. Também no nível de proteína de uma regulação para baixo dos Oct4 poderia ser observado (Figura 4). A sobre-regulação de Pax6 e o marcador de células estaminais neuronais nestina foi observada por microscopia de imunofluorescência no nível de proteína (Figura 4). A população de células apresentaram uma diferenciação homogénea e puro após seis dias de diferenciação. Por conseguinte, as culturas podem ser facilmente utilizado para a análise do ARN e de proteína. O sistema oferece também a possibilidade de testar as substâncias e os efeitos que têm sobre o desenvolvimento neural precoce 16,29.
Figura 1. Ensaio de citotoxicidade (diferenciação H9) para MeHg. O teste foi realizado de acordo com o protocolo para definir o valor de IC 10 para metil-mercúrio.
Figura 2. Análise representativas dos genes induzidos por diferenciais expressos 0,25 e 1 uM MeHg após a aplicação do sistema de ensaio UKK. Os hESCs foram tratadas com 0,25 e 1 uM MeHg de acordo com o sistema de teste UKK. Análise do diferencial de transcritos expressos no dia 14 EBs diferenciadas foi realizada utilizando o software suite Partek genómico TM 6.6. (A) Análise de componentes principais (3-Dimenional) dos dados microarray. (B) obtido a partir de Venn microarrays análise da expressão do gene. O diagrama mostra o número degenes modulados pelo tratamento MeHg (mudança vezes> ± 2, p <0,05). (C) de agrupamento hierárquico dos dados de expressão gênica (dobrar mudança> ± 2, p <0,05). Os genes altamente expressos no grupo de controlo do veículo são reprimidos por 1 PM tratamento MeHg. O tratamento 1 PM MeHg resultou em 233 transcrições de menor expressão e 43 sondas com maior expressão como comparar com grupo de controlo do veículo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. expressão do gene histona e padrão de metilação durante a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas em direção a NEP. Para todas as experiências, hESC foram diferenciados de células precursoras neuroectodermal (NEP). (A) As amostras foram tomadas a day 6 de diferenciação, e os níveis de transcritos de genes marcadores de diferenciação neuronal foi determinada por RT-qPCR. Os dados de expressão de genes (em relação a células estaminais embrionárias humanas) são médias ± SEM de 5 experiências. (B) As amostras para imunoprecipitação da cromatina (ChIP) foram preparados no dia 6 de diferenciação. Chip foi realizada com anticorpos específicos para H3K4me3 ou H3K27me3 ou controlo de IgG. Os factores de enriquecimento de sequências promotoras são dadas como entrada para H3K4me3% (cinzento) e H3K27me3 (preto). Os dados são médias ± SEM de 3 preparações de células independentes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. expressão de proteínas durante a diferenciação de células estaminais embrionárias humanas no sentido da NEP. As células foram fixadas e coradas para o marcador de células estaminaisOct4 (verde) no dia 0 de diferenciação (DoD0) e para NEP marcadores Pax6 (vermelho) e Nestin (verde) no dia 6 de diferenciação (DoD6). A barra de escala indica 50 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Tabela 1. Lista de genes diferencialmente expressos (> ± 2 vezes, p <0,05) do tratamento MeHg versus controle do veículo em 14 dias EBs de idade. Por favor clique aqui para ver este quadro.
Tabela 2. Lista de significativamente enriquecido e selecionados categorias GO (p <0,05,> 5 genes) com tran desreguladoscripts para MeHg contra o controle do veículo em 14 dias EBs velhos.
| GO Term | Contagem | Valor de P | Genes |
| Regulação da apoptose | 18 | 0,0068 | ARHGEF3, TBX3, ErbB3, MITF, BNIP3, CDH1, IGF2, IFI16, HGF, GCH1, AMIGO2, SERPINB9, KRT18, MSX1, ETS1, VEGFA, PERP, IGFBP3 |
| Regulação da proliferação celular | 17 | 0,0123 | RBP4, LYN, TBX3, ErbB3, MITF, IGF2, KDR, RERG, MSX1, ADM, ETS1, VEGFA, BNC1, ADAMTS1, FABP1, IGFBP3, FIGF |
| Desenvolvimento vasculatura | 12 | 0,0001 | PLAT, APOB, hand1, TBX3, EPAS1, FOXF1, LEPR, VEGFA, COL3A1, LOX, FIGF, KDR |
| Desenvolvimento do Sistema Esquelético ng> | 12 | 0,0008 | RBP4, MSX1, LGALS3, TBX3, HOXB6, COL3A1, STC1, IGF2, POSTN, FRZB, IGFBP3, AHSG |
| Desenvolvimento do coração | 11 | 0,0001 | RBP4, ACTC1, MSX1, hand1, TBX3, ADM, pKP2, ErbB3, GATA6, COL3A1, ADAMTS1 |
| Processo metabólico de glicose | 9 | 0,0003 | PDK1, RBP4, LDHA, PGM5, PYGL, HK2, PFKP, IGF2, PGK1 |
| Desenvolvimento de pulmão | 7 | 0,0008 | RBP4, EPAS1, GATA6, FOXF1, VEGFA, LOX, KDR |
| Desenvolvimento epitélio | 7 | 0,0386 | F11R, FREM2, GATA6, FOXF1, VEGFA, DSP, KDR |
| Desenvolvimento mesoderme | 5 | 0,0088 | Hand1, TBX3, FOXF1, VEGFA, SNAI2 |
| Prazo | Gene Símbolo | Dobre Change * | |
| 0,25 mM MeHg vs VC | 1 ^ M vs MeHg VC | ||
| Desenvolvimento do Cérebro | SEPP1 | -2,17 | -4,13 |
| DDIT4 | -1,20 | -3,11 | |
| AK4 | -1.41 | -3,08 | |
| FRZB | -1,29 | -2,19 | |
| Desenvolvimento núcleo neuronal | PITX2 | -2,08 | -4,90 |
| Desenvolvimento do sistema nervoso | ErbB3 | -1,86 | -2,89 |
| UGT8 | -1,67 | -2,14 | |
| APOB | -3,59 | -5,72 | |
| APOA1 | 2.63 | -2,90 | |
| VEGFA | -1,28 | -3,06 | |
* Valor de p <0,05
Tabela 4. Composição do meio de cultura.
| Sr. No. | Média / Nome do Buffer | Composição | |||
| Quantidade | | ||||
| 1 | MEF Médio | DMEM alta glicose | |||
| FCS | 10% | ||||
| Penicilina | 100 unidades / ml | ||||
| Estreptomicina | 100 ug / ml | ||||
| L-Glutamina | 2 mM | ||||
| 2 | H9 Meio de Cultura | DMEM F12 | |||
| KOSR | 20% | ||||
| NEAA | 1% | ||||
| Glutamax | 1x | ||||
| β-mercaptoetanol | 0,1 mM | ||||
| Penicilina | 100 unidades / ml | ||||
| Estreptomicina | 100 ug / ml | ||||
| bFGF | 4 ng / mL | 3 | RD Médio | H9 meio de cultura sem bFGF | |
| 4 | Wash Médio | DMEM / F12 | |||
| Knockout Serum Replacment | 20% | ||||
| 1x GlutaMAX | 1x | ||||
| Aminoácidos não essenciais MEM | |||||
| HEPES | 15 mM | ||||
| β-mercaptoetanol | 90 uM | ||||
| 5 | KCM Médio | DMEM | |||
| FBS | 10% | ||||
| incubadas durante 24 horas em MEFs | |||||
| 6 | Knockout Serum Substituição (KSR) | ||||
| Substituição de soro Knockout | 15% | ||||
| 1x GlutaMAX | |||||
| Aminoácidos não essenciais 1x MEM | |||||
| β-mercaptoetanol | 15 uM | ||||
| Caneca pequena | 35 ng / mL | ||||
| Dorsomorphin | 600 nm | ||||
| SB431542 | 10 μm | ||||
| 7 | N2-S | DMEM / F-12 | |||
| Apotransferin | 100 ug / ml | ||||
| Glicose | 1,55 mg / mL | ||||
| Putrescina | 10 mM | ||||
| Selênio | 500 uM | ||||
| Progesteron | 20 uM | ||||
| GlutaMAX | 200 uM | ||||
| 25 ug / ml | |||||
| 8 | Tampão de L1 | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| NP-40 | 0,10% | ||||
| Glicerina | 10% | ||||
| 9 | L2 Tampão | Tris pH 8 | 50 mM | ||
| EDTA | 10 mM | ||||
| SDS | 1% | ||||
| 10 | Tampão de Eluição | NaHCO3 | 100 mM | ||
| SDS | 1% | ||||
| 11 | Tampão de Lavagem | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | SDS | 0,10% | ||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 150 mM | ||||
| 12 | Tampão de Lavagem final | Tris | 20 mM | ||
| EDTA | 2 mM | ||||
| SDS | 0,10% | ||||
| NP-40 | 0,50% | ||||
| NaCl | 500 mM | ||||
| 13 | Caule Medium celular | mTESAR TM meio basal | 400 ml | ||
| suplemento mTESAR TM | 100 ml | ||||
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Discussion
As abordagens tradicionais de testes toxicológicos envolvem estudos com animais extensas tornando assim o teste caro e demorado. Além disso, devido às diferenças entre espécies nos estudos pré-clínicos de segurança nos animais nem sempre são válidos para prever os efeitos de toxicidade de drogas potencialmente relevantes para os seres humanos. Apesar de primatas não-humanos são mais previsíveis, ainda forte ética e demandas socioeconômicas estão aumentando rapidamente por sociedades modernas para o desenvolvimento sensível e robusto teste in vitro sistema relevantes para a segurança humana.
A capacidade única de hESCs de se diferenciar em todos os tipos de células somáticas, por conseguinte, recapitulando in vivo de processos de desenvolvimento em humanos, a combinação com abordagens toxicogenómica sensíveis tem sido proposto como uma alternativa às abordagens tradicionais para testes de segurança droga 6,21. Sob o projeto dos ESNATS 'o sistema de teste' UKK 'foi desenvolvido para prevera toxicidade embrionária desenvolvimento baseado em transcriptómica perfis. Neste sistema, células estaminais embrionárias humanas foram diferenciadas em que os corpos embrióides durante 14 dias. O perfil de tempo obtido transcriptómica cinética mostra expressão elevada de diferenciação marcador específico para as três camadas germinais ectoderme, mesoderme e endoderme no dia 14, a qual parcialmente recapitular o desenvolvimento embrionário precoce humano. Com base nestes resultados, as drogas conhecidas teratogénicos foram expostos durante a diferenciação durante 14 dias e expresso diferencial de genes perfil ter sido obtido. De forma impressionante, assinaturas de genes associados com os efeitos teratogénicos de talidomida observada em seres humanos, pode ser prevista por este sistema de teste 28. Os resultados representativos para o metilmercúrio em UKK sistema de show de regulação dependente da concentração para baixo dos fatores de transcrição relacionados com o desenvolvimento do sistema nervoso. Os outros neuro-tóxicos de desenvolvimento também foram testadas neste sistema e estão em curso esforços para identificaros marcadores tóxico comuns em todo os compostos a nível mRNA e validá-los ao nível da proteína. O protocolo de teste UKK fornecida aqui dá orientação básica para a realização do experimento com H9 células estaminais embrionárias humanas para identificar a assinatura transcriptomic para tóxica para o desenvolvimento.
O procedimento otimizado padrão de operação (SOP) para a diferenciação de células-tronco pluripotentes de acordo com o protocolo UKN1 permite uma diferenciação robusto e sincronizada de hESC a NEP. Já depois de seis dias de diferenciação, uma população homogénea de células com elevados níveis de expressão Pax6 é gerado. As células crescem em culturas aderentes, que permitem a análise de imunomarcação. Análise imunocitoquímica com alta resolução e por microscopia confocal requer que as células são cultivadas em superfícies de vidro finas. Isto é possível para estas culturas se o vidro é revestido de forma óptima, mas deve ser mencionado que as células crescem muito densa, em mais do que uma única camadaSeis dias depois. Portanto, a análise de rotina de marcadores específicos de linhagem é mais facilmente realizada por RT-qPCR, chip ou western blot. Uma grande vantagem para a análise bioquímica das culturas é o elevado rendimento de células que podem ser obtidos por este protocolo de diferenciação a partir de uma pequena população de células estaminais embrionárias humanas de partida. Uma desvantagem deste protocolo é o elevado custo dos suplementos meio (por exemplo, noggin) necessários para forçar a diferenciação neural homogénea. Outro inconveniente para algumas aplicações pode ser que algumas moléculas pequenas (inibidores de cinase) têm de estar presentes no meio de cultura, como parte do protocolo. Assim, certas vias de sinalização não pode ser analisado ponto de vista toxicológico, tal como a mudança das condições de cultura, também altera a diferenciação 29.
A vantagem da combinação do sistema de ensaio é o melhor entendimento do DNT. Considerando UKK abrange uma gama mais ampla e os efeitos adversos sobre a formação de camada germinativa precoce pode ser investigado, UKN1 tudouxos para investigar mais mecanismos específicos de neural, como epigenética. Embora os dois sistemas de cultura aqui apresentados foram mostrados para prever neurotoxicidade sobre o desenvolvimento de alguns agentes tóxicos modelo 16, ainda existe uma necessidade para as versões de taxa de transferência mais elevadas dos protocolos que permitem o rastreio de um grande número de potenciais de desenvolvimento neurotóxicos. Além disso, mais trabalho é necessário para identificar e validar marcadores comuns de toxicidade a nível mRNA ou proteína, e estabelecê-los como parte da avaliação pré-clínica de segurança de medicamentos.
Mais de 20 bilhões de dólares por ano são investidos pelas indústrias farmacêuticas para a descoberta de medicamentos 39. Como prova do conceito, temos desenvolvido em sistemas de teste de toxicidade in vitro baseados em células estaminais embrionárias humanas e transcriptómica que podem ser adequados para prever os efeitos de toxicidade dos compostos relevantes humanos potenciais da droga de uma forma rentável e menos demorado.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM/F-12 | Life Technologies | 11320082 | Dulbecco's Modified Eagle Medium:Nutrient Mixture F-12 |
| KOSR | Life Technologies | 10828028 | Knockout Serum Replacement |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050061 | GlutaMAX supplement |
| NEAA | Life Technologies | 11140050 | MEM Nonessential Amino Acids Solution |
| DPBS | Life Technologies | 14190-0144 | Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline, without calcium, without magnesium |
| mTeSR medium | Stemcell Technologies | 5850 | |
| Pluronic F-127 | Sigma | P2443-250G | |
| V bottom plate | VWR | 734-0483 | Plate,Microwell,V BTTM,96 Well,Sterile 1 * 50 ST |
| V bottom plate lid | VWR | 634-0011 | Lid, Microtitre plates, Cond. Ring 1 * 50 ST |
| Pen/Strep | Life Technologies | 15140-122 | Penicillin-Streptomycin, Liquid |
| Distilled Water | Life Technologies | 15230-089. | Sterile Distilled Water |
| Human FGF-2 (bFGF) | Millipore | GF003AF-100UG | Fibroblast Growth Factor basic, human recombinant, animal-free |
| Filter 0.22 μm | Millipore | SCGPU02RE | Stericup-GP, 0.22 μm, polyethersulfone, 250 ml, radio-sterilized |
| StemPro EZPassageTM Disposablte | Invitrogen | 23181010 | |
| BD MatrigelTM, hESC qualified Matrix | Stemcell Technologies | 354277 | 5 ml vial |
| DMSO | Sigma | D-2650 | |
| RNAlater Stabilization Solution | Life Technologies | AM7020 | It stabilizes and protect the RNA integrity in unfrozen samples. |
| 70 μm Cell Strainer | Becton Dickinson | 352350 | Cell strainer with 70 μm Nylon mesh |
| 35 μm Lid cell strainer, 5 ml tube | Becton Dickinson | 352235 | 5 ml polystyrene round bottom test tube, with a cell strainer cap (35 μm) |
| 50 ml sterile Polypropylene tube | Greiner Bio-One | 227261 | 50 ml Polypropylene tube with conical bottom, Sterile |
| T75 flask | Greiner Bio-One | 658175 | CELLSTAR Filter Cap Cell Culture 75 cm2 Flasks |
| TRIzol | Life Technologies | 10296010 | |
| 96 well optical bottom plates | Thermo Scientific | 165305 | |
| CellTiter-Blue | Promega | G8081 | |
| Accutase | PAA | L11-007 | |
| Apotransferin | Sigma-Aldrich | T-2036 | |
| Dispase | Worthington Biochemicals | LS002104 | |
| Dorsomorphin | Tocris Bioscience | 3093 | |
| EDTA | Roth | 8043.2 | |
| FBS | PAA | A15-101 | |
| FGF-2 | R&D Systems | 233-FB | |
| Gelatine | Sigma-Aldrich | G1890-100G | |
| Glucose | Sigma-Aldrich | G7021-100G | |
| GlutaMAX | Gibco Invitrogen | 35050-038 | |
| HEPES | Gibco Invitrogen | 15630-056 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich | I-6634 | |
| Knockout DMEM | Gibco Invitrogen | 10829-018 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354234 | |
| Noggin | R&D Systems | 719-NG | |
| PBS | Biochrom AG | L1825 | |
| Progesteron | Sigma-Aldrich | P7556 | |
| Putrescine | Sigma-Aldrich | P-5780 | |
| ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris Biosciences | 1254 | |
| SB431542 | Tocris Biosciences | 1614 | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0416 | |
| Selenium | Sigma-Aldrich | S-5261 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco Invitrogen | 31350-010 |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of Kits | |||
| RNeasy Mini Kit (250) | QIAGEN | 74106 | |
| GeneChip Hybridization, Wash, and Stain Kit | Affymetrix | 900721, 22, 23 | This kit provides all reagents required for hybridization wash and staining of microarrays. |
| Rnase-Free DNase Set | QIAGEN | 79254 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of equipment | |||
| Inverted microscope | Olympus | IX71 | |
| Genechip Hybridisation Oven - 645 | Affymetrix | ||
| Genechip Fluidics Station-450 | Affymetrix | ||
| Affymetrix Gene-Chip Scanner-3000-7 G | Affymetrix | ||
| Spectramax M5 | Molecular Devices | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| List of softwares | |||
| Prism 4 | |||
| Affymetrix GCOS | |||
| Partek Genomic Suite 6.25 | |||
| Online tools for Functional annotation DAVID Onto-tools Intelligent Systems and Bioinformatics Laboratory |
|||
References
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