Abstract
Entre otros cambios fisiopatológicos, la exposición crónica al humo del cigarrillo provoca inflamación y la supresión inmune, que han sido vinculados a un aumento de la susceptibilidad de los fumadores a infecciones microbianas y la incidencia de tumores. Ex vivo supresión de las respuestas inmunes mediadas por el receptor en las células mononucleares de sangre periférica humana (PBMC) tratado con los componentes del humo es un enfoque atractivo para estudiar los mecanismos y evaluar los probables efectos a largo plazo de la exposición a los productos de tabaco. Aquí, hemos optimizado los métodos para llevar a cabo ensayos ex vivo utilizando PBMCs estimulados por lipopolisacárido bacteriano, un receptor-4 ligando Toll-like. Los efectos del humo de medio acondicionado conjunto (WS-CM), una preparación de productos de tabaco combustible (TPP), y la nicotina se investigaron sobre la secreción de citoquinas y la destrucción de células diana por PBMCs en los ensayos ex vivo. Se demuestra que las citoquinas secretadas IFN-γ, TNF, IL-10, IL-6 e IL-8 y citoquinas intracelulares IFN47 ;, TNF-α, y MIP-1α fueron suprimidos en PBMCs expuestos-WS-CM. La función citolítica de PBMCs efectoras, tal como se determina mediante un ensayo de célula diana K562 matar se redujo también por la exposición a WS-CM; nicotina era mínimamente eficaz en estos ensayos. En resumen, presentamos un conjunto de ensayos mejorados para evaluar los efectos de los TPP en ensayos ex vivo, y estos métodos podrían adaptarse fácilmente para probar otros productos de interés.
Introduction
Un importante conjunto de puntos de conocimiento a los efectos adversos para la salud del tabaquismo crónico, incluyendo la enfermedad cardiovascular (ECV), enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) y el cáncer de 1,2. Fumar cigarrillos crónica se ha sabido para causar la inflamación y la supresión inmune, y estas alteraciones se informó de contribuir a un mayor riesgo de infección microbiana y el cáncer en fumadores 3. In vitro y técnicas ex vivo son útiles en la elucidación de la base molecular de los efectos fisiopatológicos de el humo del cigarrillo 4-9 (Tabla 1) y se reconocen como importantes herramientas para guiar la regulación emergente de diversos productos del tabaco 10,11.
Por ejemplo, hemos demostrado que materias inflamables de productos de tabaco (TPP), como medio de todo el humo acondicionado (WS-CM) y partículas totales (TPM) son mucho más citotóxica y perjudicial paraADN de los TPP no combustibles o la nicotina 12,13. De acuerdo con el trabajo publicado, se informó recientemente que los TPP combustibles o la nicotina 12,13. De acuerdo con el trabajo publicado, recientemente informó de que los TPP combustibles causados inmunosupresión marcada. Esto se evidenció por la supresión de Toll-like receptor (TLR) -ligands, estimulado la secreción de citoquinas y célula diana (K562) matando por PBMCs en un modelo ex vivo 14. Dada la importancia de la inflamación en los procesos de enfermedad inducida por el humo de cigarrillos, una mayor optimización de las condiciones de ensayo para evaluar los efectos inmunomoduladores del humo del cigarrillo se presenta en este informe.
Los ensayos ex vivo miden típicamente intracelular y citoquinas, así como la función citolítica de las células T citotóxicas y NK en células K562 matar ensayos de 14 secretadas. Los ensayos implicados pre-incubación con WS-CM y la nicotina y la posterior estimulación de PBMCs con TLR agonistas durante un período de 3 días; las lecturas finales se realizaron usando ensayos de inmunoabsorción ligado a enzimas (ELISA) y / o citometría de flujo. Hemos utilizado lipopolisacárido bacteriano (LPS), que se une a los receptores TLR-4 y estimula PBMCs que resulta en la producción de citocinas intracelulares y la secreción de citocinas. Además de la optimización de las diferentes etapas del ensayo para evaluar los efectos inmunomoduladores de TPP, nosotros también presentes métodos para el aislamiento de PBMCs, ensayos de muerte celular, y IL-8 cuantificación. Estos métodos pueden ser aplicados para abordar otras cuestiones de investigación y perfeccionar todavía más para evaluar los productos del tabaco en el marco regulatorio.
Tabla 1. publicado informes de métodos in vitro y ex vivo utilizan para estudiar varilus efectos fisiopatológicos de las preparaciones de los productos de tabaco CS, medio humo del cigarrillo.; CSC, cigarrillo condensado de humo; CSE, extracto de humo de cigarrillo; ELISA, enzima-ensayo de inmunoabsorción ligado; GADPH, gliceraldehído 3-fosfato deshidrogenasa; qPCR, reacción de cadena de polimerasa cuantitativa; RT, reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real; TS, humo de tabaco.
| Autor (año de estudio) | Laan et al. (2004) | Moodie et al. (2004) | Oltmanns et al. (2005) | Vayssier (1998) | Witherden et al. (2004) | Birrell et al. (2008) |
| Las células utilizadas | Células bronquiales humanas endotelio (BEAS-2B), neutrófilos humanos | Células epiteliales alveolares humanos (A549) | Las células del músculo liso de las vías respiratorias Humanos (HASMC) | Las células humanas U937 premonocítica, monocitos humanos | Alveolares tipo II las células epiteliales (ATII) | Monocítica humanalínea celular (THP-1), macrófagos pulmonares humanos |
| TPP utilizado | CSE | CSC | CSE | TS | CSE | CS |
| Método utilizado | ELISA, qPCR, migración, cambio electromovilidad | Inmunohistoquímica, electroforesis, kit ArrayScan, RT-PCR, ELISA | ELISA, RT-PCR, qPCR, electroforesis | Gel cambio de la movilidad | Microscopía de luz, microscopía electrónica, electroforesis, ELISA | qPCR, ELISA, kit E-Toxate (Sigma), ensayo de placa de p65 (TransAM), electroforesis, varios kits de inmunoensayo |
| Medida | IL-8, GM-CF, AP-1, NF-kB, la migración | Acetiltransferasas histonas, las histonas desacetilasas, NF-kB, IL-8, pI kappa B-α, GADPH | HO-1, GADPH, RANTES, IL-8, eotaxina | Proteínas de estrés / tensión (HSP / Hsp70), factor de transcripción HF, NF-kB,TNF-α | Proteína surfactante (SP-A, SP-C), IL-8, MCP-1, GRO-α, TNF-α, IL-1β, IFN-γ | IL-8, IL-1β, IL-6, TNF-α, MIP1-α, GRO-α, MAPK / JNK / fosforilación de ERK, cJUN: unión a ADN, el glutatión, p65: unión al ADN |
| Resultado final | CSE regula a la baja la producción de citoquinas a través de la supresión de la AP-1 de activación. | H 2 O 2 y CSC mejorar la acetilación de las histonas, disminuir la actividad de la histona deacetilasa, diferencialmente regular la liberación de citoquinas proinflamatorias. | El humo del cigarrillo puede causar la liberación de IL-8 de HASMC, reforzada por TNF-α, 20% CSE menos IL-8 liberación, inhibición de la eotaxina y RANTES por el humo del cigarrillo. | TS factor de transcripción HF, que se asoció con sobreexpresión de Hsp70 y la inhibición de la actividad NFkB y la liberación de TNF-α vinculante activados. | Reducción ATII niveles de quimioquinas derivadas de células compromiso alveoreparación lar, contribuyendo al cigarrillo daños y enfisema alveolar inducida por el humo. | Los datos proporcionan explicación mecanicista de por qué los fumadores han aumentado las infecciones respiratorias. Supresión de la respuesta innata está acompañado por un aumento en IL-8. |
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Protocol
NOTA: consentimiento informado por escrito para hacer este estudio se obtuvo en una unidad de investigación clínica local bajo la aprobación del IRB, por Buenas Prácticas Clínicas. Procesamiento de la sangre, el aislamiento de PBMCs y otros experimentos de cultivo celular se realizan bajo condiciones estériles, utilizando suministros microbiológicamente estériles y reactivos.
1. WS-CM Preparación
- Generar WS-CM como se ha descrito previamente 12.
- Preparar WS-CM pasando humo de cuatro 3R4F cigarrillos de referencia a través de Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 sin rojo fenol mediante el siguiente régimen de fumar: 35-60-2, el volumen de hojaldre en ml, intervalo de hojaldre en seg, y la duración de hojaldre en segundos, respectivamente. Cada preparación genera una muestra de 20 ml.
- Tubo (s) etiqueta con fecha, hora completado, y el nombre y el número de cigarrillos. Almacene los 500 ml de alícuotas a -80 ° C inmediatamente después de fumar se ha completado.
- Analizar alícuotas de WS congelados-CM Para determinar los niveles de nicotina, las nitrosaminas específicas del tabaco y los hidrocarburos aromáticos policíclicos como se describió anteriormente 12.
2. Aislamiento de PBMC
- Recoger la sangre fresca de donantes sanos (que son los no consumidores de productos de tabaco) Aislar PBMCs de sangre fresca como se describe más adelante en obtener autorización de Wake Forest Baptist Health IRB 15.
- Antes de la llegada de la bolsa de sangre, una botella de 500 ml, tijeras, tampón de aislamiento, y salina tamponada con fosfato de Dulbecco (DPBS) (RT) dispuestos en un nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) campana de cultivo celular. Tampón de aislamiento debe ser protegido de la luz.
- Mantenga la bolsa de sangre hacia abajo y cortar el tubo justo debajo de donde se ha sujetado dejando al menos 3 cm de tubo.
- Retire el tapón de la botella de 500 ml y mantener el tubo por encima de la boca de la botella. Recojo la bolsa de sangre e invertirla para permitir que la sangre fluya libremente de la bolsa en tque la botella hasta que la bolsa está vacía. Deje que la sangre fluya hacia la pared interior de la botella frente hacia abajo para evitar la creación de burbujas.
- Verter tampón de aislamiento dentro de la botella en una proporción de 1: 5 de tampón de aislamiento a la sangre. Se tapa el frasco bien y suavemente invertirlo, de extremo a extremo, 10 veces. Deja la botella en la campana de cultivo de células para la incubación con luces apagadas, durante 1 hora a RT.
- Una capa de luz, color paja se acumula por encima de la sangre. Eliminar esta capa usando una pipeta serológica 25 ml en 50 ml tubos cónicos. El monto recaudado puede variar desde 50 hasta 300 ml, dependiendo del tema que donaron sangre.
- Centrifugar los tubos a 200 xg durante 10 min a TA.
- Aspirar el sobrenadante transparente, dejando el sedimento de color sangre oscura. El sedimento se suelta pero viscoso.
- Pipetear 3 ml de tampón de aislamiento en tubos de 15 ml cónicos.
- Para resuspender el pellet, añadir 20 ml de DPBS por cada 50 ml de líquido de color paja recogidos en sTep 2.1.5. Vortex para mezclar a fondo, y consolidar el líquido resuspendido de múltiples tubos. Este líquido contiene suspendió células sanguíneas.
- Con una pipeta de transferencia, la transferencia de 5 ml de las células sanguíneas suspendidas en 3 ml de tampón de aislamiento en el paso 2.1.8. Incline el tubo cónico de 15 ml que contiene la suspensión celular lentamente y suavemente para crear dos capas separadas. Centrifugar los tubos a 400 xg durante 40 min a TA con una aceleración mínimo y sin freno.
- Utilice una pipeta de transferencia para eliminar la capa resultante nublado medio (capa leucocitaria) que contiene PBMCs en un tubo cónico de 50 ml. Evite dibujar otras capas claras por debajo de ella. Transferencia no más de 25 ml en cada tubo cónico de 50 ml.
- Añadir 25 ml de tampón corriente fría (o más para llenar todo el volumen restante del tubo cónico de 50 ml) para lavar las células. Centrifugar las células a 400 xg durante 10 min a 4 ° C.
- Resuspender el precipitado con 10 ml tampón. Esta contiene las PBMC. Contar las células y usar immediata o lugar en hielo durante la congelación.
3. La congelación y descongelación de las PBMCs
- Centrifugar las CMSP que se recogieron en el paso 2.1.13 durante 10 minutos a 400 x g.
- Llenar el recipiente de congelación con alcohol isopropílico según las instrucciones del fabricante. PRECAUCIÓN: El alcohol isopropílico es inflamable y muy tóxico.
- Resuspender el pellet con medio RPMI 1640 (4 ° C) que contenía suero bovino fetal al 20% (FBS) y 10% de sulfóxido de dimetilo (DMSO). Esto es RPMI 1640 medio de congelación. Resuspender el sedimento con una cantidad de medio de congelación que se traducirá en una suspensión tiene alrededor de 5 x 10 7 células / ml. El número de células disponibles para la congelación puede variar.
- Dispensar alícuotas de 1 ml de suspensión celular en criotubos de 2 ml y colocar los criotubos en el recipiente de congelación. Coloque el recipiente de congelación con criotubos en un congelador a -80 ° C para almacenar O / N y luego retire los criotubos y traslado a almacenar en uncongelador criogénico entre -150 ° C a -190 ° C.
- Retire el tubo criogénico de almacenamiento criogénico y descongelar rápidamente con agitación suave en un baño de agua a 37 ° C.
- Inmediatamente transferir las PBMC descongeladas en el criotubo en un tubo cónico de 15 ml con 10 ml de RPMI 1640 medio completo (4 ° C) que contiene 10% de FBS, 1% Pen / Strep y 1% de L-glutamina. El contenido de la criotubo descongelados deben ser transferidos tan pronto como sea posible para obtener la viabilidad celular máxima 15.
- Centrifugar los PBMCs a 400 xg durante 10 min.
- Resuspender el precipitado con 5 ml de medio RPMI 1640 completo y contar las células.
- Medir la viabilidad celular por métodos establecidos, tales como el método de exclusión con azul de tripano. Generalmente la viabilidad celular con este método es de aproximadamente 90 - 95%. Las PBMCs ahora están listos para usar en experimentos.
4. Determinación de la célula de la Muerte
NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudy. Las diluciones se pueden cambiar en consecuencia.
- Diluir WS-CM o la nicotina en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completo hasta un volumen total de 100 l / pocillo, como se indica a continuación.
- Diluir WS-CM a las siguientes concentraciones: 0,1, 0,5, 1, 1,5, 2, 2,5, 3, 4, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina (basado en el contenido de nicotina en WS-CM) 12.
- Diluir la nicotina en medio RPMI a las siguientes concentraciones: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, y 3000 g / ml. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente.
- Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a cada pocillo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo.
- Para el propósito de este estudio, preparar dos conjuntos de placas como anteriormente. Cubrir las placas e incubar una placa durante 24 horas y una placa durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Ajuste los puntos de tiempo como sea necesario. Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente resuspender las células con 200 l de tampón de hielo frío, y repetir la etapa de lavado una vez más.
- Añadir 95 l de tampón seguido de 5 l de 7-aminoactinomicina D (7AAD) a cada pocillo para un volumen total de 100 l / pocillo. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.
- Añadir 100 l de tampón a los tubos de racimo. Transferir todo el volumen de suspensión de células de cada pocillo de la placa a los tubos de racimo y adquirir las muestras en el citómetro de flujo.
- Determinar el porcentaje de células positivas 7AAD utilizando citometría de flujo de software de análisis.
5. CE 50 Determinación
- Los valores de EC50 de WS-CM y la nicotina se determinan mediante tinción 7AAD-positivo de CMSP.
- El valor de EC50 se define como la concentration en la que 50% de las células fueron ya no es viable en un ensayo de 24 h, y los valores se expresan como g de equi-nicotina unidades / ml.
- A los efectos de este estudio, los valores de EC50 se determinó que eran 1,56 g / ml y 1,650 g / ml para WS-CM y la nicotina, respectivamente.
6. Las citoquinas secretadas
NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudio. Las diluciones se pueden ajustar en consecuencia.
- Diluir WS-CM en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completa a un volumen total de 100 l / pocillo a la concentración de 0,3, 1,56, 3, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina.
- Diluir la nicotina a las siguientes concentraciones: 100, 200, 500, 750, 1000, 2000, y 3000 mg / mL. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente.
- Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a cada pocillo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo.El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo.
- Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente la suspensión de células con 200 l de hielo frío tampón y repetir la etapa de lavado una vez más.
- Añadir 200 l de medio RPMI completo y repita el paso de lavado una vez más.
- Añadir 200 l de 10 mg medio LPS / ml a cada pocillo.
- Cubrir la placa e incubar durante 4 horas, 24 horas, 48 horas o 72 horas a 37 ° C y 5% de CO 2. Ajuste los tiempos de incubación según sea necesario.
- Centrifugar la placa a 300 × g durante 3 min.
- Tomar 175 l de sobrenadante de cada bien y guardar en un congelador a -80 ° C para llevar a cabo los ensayos en los pasos 7 y 8.
Ensayo matriz 7. citométricos de bolas
<ol>8. IL-8 ELISA
- Descongelar los sobrenadantes de las células de la etapa 6.10 y su uso en la IL-8 ELISA. Realizar el ensayo ELISA según las instrucciones del fabricante.
9. Intracelular tinción y citometría de flujo
NOTA: Las diluciones que figuran aquí son para el propósito de este estudio. Las diluciones se pueden ajustar en consecuencia.
- Diluir WS-CM en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completa a un volumen total de 100 l / pocillo a la concentración de 0,3, 1,56, 3, y 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina.
- En la misma placa, diluir la nicotina a las siguientes concentraciones: 2, 10, 50, 100, 500, 2000, y 4000 g / ml. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y ambientalmente hazardous.
- Añadir 100 l de PBMCs en suspensión en medio RPMI completo a una concentración de 1 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células más WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo.
- Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Lavar las células a temperatura ambiente por centrifugación a 300 xg durante 3 min, aspirar el sobrenadante, vórtex la parte inferior de la placa con placa de cubierta y finalmente resuspender las células con 200 l de tampón de hielo frío, y repetir la etapa de lavado una vez más.
- Añadir 200 l de medio RPMI completo a la placa, y repetir el paso de lavado una vez más.
- Preparar las concentraciones de trabajo de 2 l / ml GolgiPlug y / ml de LPS 10 g utilizando medio RPMI completo y añadir 200 l a cada pocillo.
- Incubar la placa durante 6 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Al final de la etapa 9.8, se lavan las células con tampón (4 ° C) y girando a 300g durante 3 min a 4 ° C.
- Añadir 100 l de Cytofix a cada pocillo e incubar durante 20 min a 4 ° C.
- Lavar las células 3 veces como se ha descrito en el paso 9.9 con 1x PermWash (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Añadir 45 l de 1x Cytoperm a cada pocillo seguido de 5 l de cada de uno de los siguientes anticuerpos a cada pocillo: TNF-α-Alexa Fluor 488, IFN-γ V500, MIP-1α PE. Incubar a 4 ° C durante 30 min.
- Lavar las células dos veces tal como se describe en el paso 9.9 con 1x PermWash (4 ° C) y una vez con tampón (4 ° C) a 300 xg durante 3 min a 4 ° C.
- Resuspender las células con 200 l de 2% de paraformaldehído (4 ° C). Transferir las células en tubos de 12 x 75 mm, y analizar las muestras en el citómetro de flujo. PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es corrosivo, tóxico agudo y un peligro para la salud.
10. K562 Ensayo Matar
NOTA: K562 células deben cultivarseen cultivo a 37 ° C y 5% de CO 2 con medio RPMI completo hasta que alcanzan 80% de confluencia antes del ensayo.
- Preparar una solución de 5 mM de carboxifluoresceína succinimidil éster (CFSE) stock mediante la adición de 18 l de DMSO al vial.
- Diluir WS-CM o la nicotina en una placa de 96 pocillos usando medio RPMI completo hasta un volumen total de 100 l / pocillo para lograr las unidades de equi-nicotina deseada o las concentraciones de nicotina para cada pocillo. PRECAUCIÓN: La nicotina es muy tóxico y peligroso para el medio ambiente.
- Añadir 100 l de PBMCs en medio RPMI completo a una concentración de 1,5 x 10 6 células / pocillo. El volumen total de células con WS-CM o la nicotina será de 200 l / pocillo.
- Cubrir la placa e incubar durante 3 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Lavar las células K562 mediante la adición de 10 ml de DPBS y centrifugar a 400 xg durante 8 min a TA.
- Resuspender las células con 10 ml de DPBS y contar las células K562.
- Preparar CFSE working solución mediante la adición de 1 l de solución madre CFSE a 1 ml de DPBS.
- Añadir 1 ml de la solución de trabajo CFSE a 1 ml de la suspensión de células K562 que contiene 1 - 2 x 10 7 células. Vortex y se incuba precisamente por 2 min a TA.
- Inmediatamente añadir 200 l de FBS. Vortex y se incuba precisamente por 2 min a TA.
- Añadir 10 ml de medio RPMI completo y se centrifuga el tubo a 400 xg durante 8 min a TA.
- Eliminar el sobrenadante RPMI y romper la pastilla y resuspender las células con 10 ml de medio completo RPMI y contar las células K562 marcadas con CFSE.
- Lavar las PBMCs por centrifugación de la placa a 300 xg durante 3 min a TA. Aspirar el sobrenadante por decantación del líquido. Vuelva a colocar la tapa y agite la parte inferior de la placa. Añadir 200 l de medio RPMI completo y repita el paso de lavado una vez más.
- Añadir células K562 marcadas con CFSE en una proporción de 01:15 (100.000 K562s: 1,5 x 10 6 PBMCs) a cada pocillo de muestra de la placa de PBMC y más incubate durante 5 horas a 37 ° C y 5% de CO 2.
- Lavar la mezcla de células por centrifugación a 300 xg durante 3 min a TA. Aspirar el sobrenadante por desechar el líquido. Coloque la tapa y agitar la parte inferior de la placa.
- Añadir 200 l de tampón y repetir el paso de lavado descrito en la etapa 10.14 una vez más.
- Añadir 95 l de tampón de ejecución seguido de 5 l de 7AAD a cada pocillo para un volumen total de 100 l / pocillo. Se incuba la placa en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15 min.
- Añadir 100 l de tampón a cada pocillo y transferir todo el volumen de suspensión de células de cada pocillo de la placa a los tubos de racimo y adquirir las muestras en el citómetro de flujo.
- Determinar el porcentaje de células 7AAD-positivos y CFSE-positivos utilizando citometría de flujo de software de análisis.
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Representative Results
Los resultados se presentan como media ± error estándar de la media (cuatro muestras de donantes). Se realizó la prueba t del estudiante entre las muestras de control de tratados y no tratados utilizando el software Excel, así como comparaciones de la prueba t para todos los tratamientos con sus correspondientes controles. La significación estadística se indica con: *, P <0,05; **, P <0,005; ***, P <0,0005.
Para medir el efecto de la exposición a WS-CM y la nicotina, PBMCs se trataron con diferentes concentraciones de WS-CM y la nicotina para 3 h o 24 h. La muerte celular se midió por el método de tinción 7AAD robusto y fiable, como se intercala 7AAD en ácidos nucleicos de doble cadena y puede penetrar las membranas celulares de las células muertas de morir o 16. Se observó un aumento dependiente de la dosis en la muerte celular con WS-CM a las 24 horas, con alrededor de 80% de muerte celular detectada en 4 g / ml de unidades de equi-nicotina (Figura 1A). Un grado comparable de la muerte celular eraobservado sólo a 3.000 g / ml de nicotina (Figura 1B). Puesto que PBMCs expuestos durante 3 horas con WS-CM y la nicotina para evaluar su efecto de inducción de citoquinas y la capacidad de matar células diana, era necesario determinar si WS-CM causa citotoxicidad significativa después de 3 h de tratamiento. PBMCs tratados con 5 mg / ml de unidades de equi-nicotina de WS-CM no experimentaron toxicidad significativa (<5%; Figura 1A). El tratamiento con nicotina durante 3 h causó la muerte medible (8%) de células sólo a 2.000 g / ml (Figura 1B). Por lo tanto, la exposición a WS-CM o la nicotina a las dosis indicadas y períodos de tratamiento no causó una citotoxicidad significativa en las condiciones experimentales.
Para medir los efectos inmunomoduladores, PBMCs se estimularon con LPS para diferentes períodos de tiempo, y las citocinas secretadas se midieron mediante el ensayo de CBA. Para optimizar el tiempo de estimulación LPS, expusimos PBMCs a LPS estimulación durante 4 horas, 24 horas, 48 horas y 72 horas, y las citocinas secretadas se midieron. Por ejemplo, la estimulación con LPS durante 24 horas produjo la secreción máxima de las citocinas IL-6 y IL-8 (Figura 2), y los períodos de tiempo prolongados no dio lugar a aumentos adicionales (IL-6) o disminuye (IL-8) en citoquina secreción. Se obtuvieron resultados similares con otras citoquinas secretadas tales como IL-10, IL-1β y TNF-α (datos no mostrados).
Los experimentos de tiempo-por supuesto piloto sugieren que la máxima producción de citoquinas en las respuestas a TLR-4 estimulación por LPS se produce por 24 horas, y por lo tanto, se midieron las citoquinas secretadas a las 24 horas en todos los experimentos posteriores. El tratamiento con WS-CM y la nicotina, seguido por la estimulación de TLR-4 receptor con LPS, resultó en una disminución dependiente de la dosis de citocinas secretadas (Figura 3). El tratamiento con WS-CM dio lugar a profundas disminuciones de IFN-γ (Figura 3A), TNF (Figura 3B), IL-10 (Figura 3C </ Strong>) e IL-6 (Figura 3D) en las unidades de equi-nicotina bajas (1,56 g / ml). Supresión de las citocinas también se hizo evidente con la nicotina. Sin embargo, la supresión de citoquinas con la nicotina se produjo a dosis significativamente más altas, y el grado de supresión varió entre citoquinas individuales. Por ejemplo, IFN-γ parecía estar suprimió de forma significativa con la nicotina en 50 g / ml, mientras que la IL-6 fue suprimida en la concentración más alta (4 mg / ml) ensayados (Figurie 3D). A continuación, se midió IL-8 niveles en las mismas muestras usando un ensayo de ELISA. IL-8 secreción fue suprimida con eficacia en PBMCs expuestos-WS-CM; mientras que los efectos supresores de la nicotina fueron significativas a 2 mg / ml (Figura 4).
Los niveles de citocinas intracelulares se cuantificaron en WS-CM- y las células tratados con nicotina a la estimulación con LPS. Anteriormente hemos estimulado PBMCs por 3 días y agregamos Golgiplug durante las últimas 6 horas de incubación para medircitoquinas intracelulares 14. Ahora tenemos redujo significativamente el periodo de incubación mediante la combinación de la estimulación con LPS y enchufe Golgi a un total de 6 horas y se midió citoquinas de las células positivas intracelulares (Figura 5). La Figura 5 ilustra una reducción dependiente de la dosis por ciento en las células IFN-γ-positivo ( Figura 5A) células (Figura 5B) en tanto Nicotine- y WS-CM-, TNF-α-positivo expuesto PBMCs, mientras que un porcentaje de reducción dependiente de la dosis en las células MIP-1α-positivo (Figura 5C) se observó en WS-CM PBMCs -exposed. En este ensayo se observó una disminución en el número de citoquinas de las células positivas intracelulares después de la exposición a WS-CM en unidades inferiores equi-nicotina (1,56 g / ml). Tanto citoquina secretada y ensayos de citoquinas intracelulares mostraron resultados similares en cuanto a los niveles de IFN-γ o células IFN-γ-positivo.
Como una medida funcional, la capacidad de WS-CM- y Nicotine-PBMCs tratados para eliminar células K562 objetivo se determinó. Figura 6A representa citometría de flujo representativo datos brutos de tinción 7AAD-positivo de destino (K562 CFSE marcado) la muerte celular por control, WS-CM-expuesto, y PBMCs tratados con nicotina. Los números en el cuadro representan células K562 marcadas con CFSE 7AAD positivos por ciento. La exposición a 1,56 g / ml WS-CM redujo significativamente la capacidad de destrucción de las células efectoras en PBMCs en comparación con el control y las dosis más bajas. Tratamiento de nicotina en dosis bajas y altas no interfirió con la destrucción celular. Figura 6B muestra una disminución dependiente de la dosis en células K562 ciento matar de múltiples donantes en un solo experimento.
Figura 1. La muerte celular de PBMC después de la exposición a concentraciones crecientes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (g / ml) y la nicotina (mg / ml). (A) y con la nicotina durante 3 h y 24 h (B). La muerte celular se midió mediante tinción 7AAD. Cada punto representa las barras de media ± desviación estándar de error de cuatro donantes de un experimento representativo. La significación estadística se indica con: * P <0,05; ** P <0,005, *** P <0,0005.
Figura 2. La secreción de IL-6 y IL-8 por las PBMC estimuladas con LPS en diferentes puntos temporales. PBMCs se estimularon con LPS durante 4 h, 24 h, 48 h, y 72 h. Los niveles de IL-6 y IL-8 citocinas en los sobrenadantes de cultivo de células se determinaron usando citoquinas inflamatorias Kit humano (kit CBA) y citometría de flujo. Estos datos representan las barras media ± SD de error de uno de los dos experimentos independientes usando PBMC de tres donantes diferentes. La IS estadísticagnificance se indica con: * P <0,05; ** P <0,005.
Figura 3. Reducción de la secreción de citoquinas por las PBMC tratadas con concentraciones crecientes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (g / ml) y la nicotina (mg / ml) siguientes estimulación con LPS. PBMCs fueron expuestas a diferentes concentraciones de WS-CM y la nicotina durante 3 horas y se estimularon con LPS durante 24 h. Los niveles de IFN-γ (A), TNF (B), IL-10 (C), y la IL-6 (d) citoquinas en los sobrenadantes de cultivo de células se determinaron usando un ensayo de Th1 / Th2 CBA y citometría de flujo. Estos datos representan las barras media ± SD de error de uno de los tres experimentos independientes utilizando PBMC de cuatro donantes diferentes. La significación estadística se indica con: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Con Superior concentraciones de WS-CM también fueron estadísticamente significativas con *** P <0,0005.
Figura 4. La atenuación de la secreción de IL-8 por PBMCs tratadas con concentraciones crecientes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (g / ml) y la nicotina (mg / ml) siguientes estimulación con LPS. PBMCs fueron expuestos a WS-CM y la nicotina, estimulados con LPS durante 24 horas, y se segrega IL-8 se midió por ELISA. Estos datos representan las barras media ± SD de error de uno de los tres experimentos independientes utilizando PBMC de cuatro donantes diferentes. La significación estadística se indica con: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Las concentraciones más altas de WS-CM también fueron estadísticamente significativas con *** P <0,0005.
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Figura 5. Reducción de citoquinas de las células positivas intracelulares en PBMCs tratadas con concentraciones crecientes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (g / ml) y la nicotina (mg / ml). PBMCs fueron expuestos a concentraciones variables de WS-CM y la nicotina durante 3 horas y se estimularon con LPS y Golgiplug durante 6 horas. El control del vehículo para WS-CM y la nicotina era medio RPMI completo. Intracelular células MIP-1α-positivos (C) IFN-γ-positivas (A), TNF-α-positivo (B), y se cuantificaron por citometría de flujo. Estos datos representan las barras media ± SD de error de uno de los cuatro experimentos independientes usando PBMC de cuatro donantes diferentes. La significación estadística se indica con: * P <0,05; ** P <0,005; *** P <0,0005. Las concentraciones más altas de WS-CM también fueron estadísticamente significativas con *** P <0,0005.
Figura 6. Reducción de la capacidad de matar objetivo PBMCs con la exposición a concentraciones crecientes de unidades de equi-nicotina de WS-CM (g / ml) y la nicotina (mg / ml). PBMCs se trataron con las concentraciones indicadas de WS-CM y la nicotina para 3 hr, y las células K562 marcadas con CFSE a continuación, se añadieron como células diana y se incubaron durante 5 horas adicionales. Las células se tiñeron con 7AAD y el flujo se utilizó citometría de medir la capacidad de matar. Figura 6A muestra el flujo representante citometría de resultados con el porcentaje de destrucción se muestra en las cajas cerradas. La flecha indica redujo el porcentaje de destrucción en 1,56 mg / ml expuestos WS-CM. Figura 6B muestra barras media ± error representativos de cuatro experimentos independientes utilizando PBMCs de cuatro donantes diferentes. La significación estadística se indica mediante: ** P <0,005; *** P <0,0005. Las concentraciones más altas de WS-CM también fueron estadísticamente significativas ingenioh *** P <0,0005.
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Discussion
Nosotros y otros han demostrado previamente que el tratamiento de las PBMC con TPPs suprime varias respuestas, incluyendo la expresión y secreción de citoquinas y medidas funcionales tales como célula diana matando a 14. Los métodos experimentales descritos en el anterior trabajo requieren períodos de incubación más largos y fueron modestos en magnitud 14. Teniendo en cuenta las posibles aplicaciones de este atractivo modelo ex vivo para la investigación básica y aplicada, se investigó si alguno de los parámetros de ensayo en estos ensayos biológicos de múltiples pasos puede ser optimizado. A continuación, presentamos métodos simplificados para medir las respuestas inmunes mediadas por TLR utilizando un modelo in vivo tratados con TPP ex PBMC.
El aislamiento de PBMCs viable es un requisito clave para estos ensayos ex vivo. Dada la variabilidad individual y el estado fisiológico en los posibles donantes, es ideal para obtener PBMCs que respondan. Para el propósito de este estudio, aislamosd PBMCs de sujetos adultos generalmente sanos utilizando un método publicado previamente 15. Además, en este estudio para minimizar la variabilidad entre los donantes, se excluyeron aquellos con alergias, infecciones, o que estaban tomando cualquier prescripción o medicamentos de venta libre como la aspirina. Además, el aislamiento de PBMCs a partir de sangre recién recogida es deseable, ya que garantiza la viabilidad y la funcionalidad de las células en experimentos posteriores óptima.
Los métodos anteriores utilizados estimulación con agonistas de TLR de 67-72 h para medir las citocinas intracelulares y citoquinas secretadas 14. Un curso de tiempo de la secreción de citoquinas en células estimuladas con TLR (en condiciones de control sin WS-CM o la nicotina) sugirió que la secreción máxima se produjo a las 24 hr. Además, combinamos la incubación con agonistas de TLR y Golgiplug y reducido el tiempo de incubación para un total de 6 h para medir citoquinas intracelulares. Si bien esto requiere un ensayo separado para medircitoquinas de las células positivas, los datos son más robustos en comparación con el método anterior 14. De acuerdo con los resultados anteriores, WS-CM suprime fuertemente la inducción de citocinas intracelulares y secretadas. Por lo tanto, estas modificaciones llevaron a reducido sustancialmente tiempos de ensayo y produjeron resultados muy similares a los descritos en la literatura. Si bien hemos utilizado la citometría de flujo y métodos ELISA para evaluar los niveles de citoquinas, otras técnicas, tales como la reacción en cadena de la polimerasa cuantitativa en tiempo real (RT-qPCR) también se pueden utilizar como una técnica complementaria.
Históricamente, el objetivo de la muerte celular por PBMC efectoras utilizados métodos radiomarcados (por ejemplo, el ensayo de liberación de 51Cr). El método descrito en este informe elimina el uso de radiactividad y emplea células de carga con un colorante fluorescente cuya presencia podría ser supervisado por citometría de flujo. Otra ventaja del método descrito en el presente documento es que es relativamente rápido y puede ser ADAPTEd para ensayos de alto rendimiento. Dado que el período de incubación de las células diana y efectoras es 5 hr, este ensayo se puede completar en 8 hr. Esto contrasta con otros métodos publicados, que son más complicados, ya que requieren el aislamiento de los subtipos de PBMCs y la activación / estimulación durante un período de varios días, o el análisis de las células NK y conjugados de células K562 para supervisar la citotoxicidad 17,18. Otra ventaja del método actual es que usa PBMC criopreservados directamente como células efectoras, que ofrece una mayor flexibilidad.
En resumen, hemos descrito varios ensayos para determinar el efecto de la respuesta inmune mediada por TLR en PBMCs tratados con TPP combustibles, que se puede aplicar fácilmente para el ensayo de diferentes compuestos. El uso de componentes criopreservados permite una flexibilidad significativa, y junto con las técnicas establecidas, tales como citometría de flujo, ensayos de CBA, y ELISA, robusto y resultados consistentes se podrían obtener rápidamente a través de diferentes laboratoriooratorios.
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Acknowledgments
Este trabajo está financiado por RJ Reynolds Tobacco Company (RJRT) bajo un acuerdo de investigación en colaboración con la Wake Forest University School of Medicina. GL Prasad es un empleado a tiempo completo de RJRT.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12 x 75 mm tubes | BD Falcon | 352058 | |
| 15 ml conical tubes | Corning | 430790 | |
| 2 ml microtubes | Axygen | MCT-150-C-S | |
| 3R4F reference cigarettes | Univ. of Kentucky, College of Agriculture | 3R4F | |
| 50 ml conical tubes | Corning | 430828 | |
| 500 ml bottle | Corning | 430282 | |
| 7AAD | BD Pharmingen | 559925 | |
| 96-well flat bottom plate | Termo Nunc | 439454 | |
| 96-well round bottom plates | BD Falcon | 353077 | |
| Cell culture hood | Thermo Scientific | 1300 Series A2 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 58110R | |
| CFSE | Molecular Probes Life Technologies | C34554 | |
| Cluster tubes | Corning | 4401 | Harmful if swallowed, carcinogen |
| Cytofix/Cytoperm (Permwash) | BD Biosciences | 555028 | Flammable |
| DMSO (dimethyl sulfoxide ) | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| DPBS | Lonza | 17-512F | |
| FBS | Sigma-Aldrich | F2442 | |
| FCAP Array | BD Biosciences | 652099 | Software analyzes CBA data |
| Filter unit | Nalgene | 156-4020 | |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Canto II | 8 colors, at Ex 405 and Em 785. |
| Flow cytometer | BD Biosciences | FACS Calibur | 4 colors at Ex 495 and Em 785. |
| Flow cytometry analysis software | Tree Star | FlowJo | |
| Freezing container | Nalgene | 5100-0001 | Contains DMSO, irritant |
| GogliPlug | BD Biosciences | 555029 | Carcinogen, irritant, corrosive |
| H2SO4 | Sigma-Aldrich | 339741 | |
| Human Inflammatory Cytokine Kit | BD Biosciences | 551811 | |
| IFN-γ V-500 Antibody | BD Horizon | 561980 | skin sensitizer |
| IL-8 ELISA Kit | R and D Systems | DY208 | |
| Isolation buffer | Isolymph, CTL Scientific Corp. | 1114868 | Flammable liquid, irritant |
| Isopropyl alcohol | Sigma-Aldrich | W292907 | |
| L-Glutamine | Gibco Life Technologies | 25030-081 | |
| LPS | Sigma-Aldrich | L2630 | |
| MIP1-α PE Antibody | BD Pharmingen | 554730 | Acute toxicity, oral |
| Monensin | Sigma-Aldrich | M5273 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| Nicotine | Sigma-Aldrich | N3876 | Acute toxicity, environmental hazard |
| Parafilm | Bemis | “M” | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | Flammable, skin irritation |
| Pen/strep | Gibco Life Technologies | 15140-122 | |
| RPMI 1640 | Gibco Life Technologies | 11875-093 | |
| Running buffer | MACS Running Buffer, Miltenyi Biotech | 130-091-221 | |
| Th1/Th2 CBA Kit | BD Biosciences | 551809 | |
| TNF-α Alexa Fluor 488 Antibody | BioLegend | 502915 | |
| Transfer pipette | Fisher Scientific | 13-711-20 | |
| Tris Base | Sigma-Aldrich | T1503 |
References
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