Introduction
Son iki aşırı ifade eden ve zar nakil proteinleri saflaştırmak için yeteneği önemli ölçüde artmıştır yıllarda: iyon kanalları, birincil ve ikincil taşıyıcıları rutin heterolog sentezleme sistemleri ile olduğu gibi, doğal kaynaklardan saflaştırılır. Bu proteinlerin istikrar, ifade izlemek geliştirmek ve çıkarma kolaylaştırmak ve geliştirmek için yeni yaklaşımlar sürekli 1-5 geliştirilmektedir. Bu teknolojik devrimler da, kendi işlevinin yapısal üsleri anlayışımızı gelişmiş, membran proteinlerinin atom düzeyinde yapısal bilgi patlamasını tetikleyen vesile olmuştur. Buna karşılık, bizim yetenek bazı durumlarda yüksek çözünürlüklü yapısal bilgiler, böylece kantitatif yapı-tabanlı tahminler sınamak için yeteneğini sınırlayan, nitel verilerle fonksiyonel eşlik böylece, aynı oranda artmadı saflaştırılmış proteinlerin fonksiyonel özelliklerini incelemek için. Bu nedenle, gelişme içerisindenicel ve genellenebilir fonksiyonel testlerin t membran proteini fonksiyonu mekanik temellerinin aydınlatılması yönünde önemli bir adımdır.
Kanal, taşıyıcı - Burada kantitatif saflaştınldı ve yeniden Cl anahtar işlevsel özelliklerini belirlemek için kullanılabilecek bir akış deneyi tarif eder. tahlil altında yatan ilkeler taşıma sistemlerinin çeşitli yanı sıra sigara iyon-taşıma proteinlerine jeneralize olabilir. Kanal / büyük Cl mevcudiyetinde taşıyıcıları - - Lipozomlar saflaştırılmış Cı ile yeniden degrade (Şekil 1A, B). Cı - akış bizim durumumuzda, karşı-iyon akışının izin vermek için bir iyonofor ilave edilerek başlatılır K + iyonoforu Valinomycin, Cl tarafından kurulan gerilim şant olan - gradyeni ve K denge potansiyeline ilk membran potansiyeli ayarlanmış + 6,7. T olmadanBir transmembran potansiyeli nesil tarafından engellenir gibi akış oluşur, - o anlamlı net Cl iyonofor'un. - efflux, f 0, aktif protein içermeyen lipozomlar fraksiyonu τ, Cl zaman sabiti: Veri kantitatif iki ölçülebilir parametreler (Şekil 1C) ile tarif edilir. Τ ve f 0 yekpare Cı kaynaktan - taşıma hızı, aktif protein fraksiyonu ve aktif kompleks moleküler kütlesi 8 elde edilebilir. Bilinen yapısı ve fonksiyonu değiştirici - tekniği CLC-EC1, iyi karakterize CLC-tipi H + / Cl ile yeniden proteoliposomes kullanarak burada gösterilmektedir. Bu tahlil kolaylıkla aktivite gerilimi ve / veya ligandların varlığına bağlıdır farklı iyonik seçicilik veya kanallar veya nakliyecilere genelleştirilmiş. Bundan başka, bu deney, küçük moleküller, doğrudan yeniden protein etkileyip etkilemediğini belirlemek için kullanılabilir,Bu bileşiklerin ve nasıl membran bileşimi veya lipid-modifiye reaktifler yeniden kanalların ve taşıyıcıların fonksiyonunu etkileyebilir etkilerini ölçmek için.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Lipid Preparasyonu
- Saydam bir cam tüp içine istenilen miktarda lipit bölmeyin. Kullanım E. E. coli kutuplu lipit özü, ama en lipit bileşimler kullanılabilir. Lipidler toz biçiminde ise, 20 mg / ml 'lik bir konsantrasyona kadar kloroform bunları yeniden süspanse edin. Bütün solvent buharlaşana kadar N2 gazı altında oda sıcaklığında lipitler kurutun.
- Pentan lipitleri tekrar ve kloroform kalan izleri kaldırmak için yeniden gaz N 2 akışı kurutun. Kuru bütün solvent çekinceye kadar. Kurutma sırasında, lipid altındaki bir biçim verme yoğun kütle yerine borunun alt üçte birini örtmekte olan eşbiçimli bir film dağıtılır ve böylece tüp hafifçe döndürün.
- Sulandırma tamponu içeren bir deterjan ekleme (300 mM KCI, 50 mM sitrik asit, 25 mM K 2 HPO 4, pH 4.5, 35 mM CHAPS) lipidler eritin. Protein CHAPS'tan kötü hoşgörülü ise bu adım için diğer hafif deterjanlar kullanın.
- ResuspenBir su banyosu sonikatör kullanarak netlik lipidler d. Kısa (30 sn-1 dk) ile kısa (30 sn-1 dk) bakliyat maksimum güçte su banyosunda sonikatör merkezinde tüp daldırın duraklar. Çözelti berrak hale gelmelidir.
Not: açıklık son derece elde kullanılan spesifik yağ bileşimine bağlıdır. Da nominal olarak denk lipidler arasında bu adımda bazı partiden partiye değişkenlik, aynı zamanda mümkündür. Kalıntı bulanıklık santrifüjleme ile çıkarılabilir süspansiyonda büyük parçacıklar tarafından ışık saçılımı kaynaklanmaktadır. - 20-60 dakika boyunca oda sıcaklığında yeniden süspansiyon haline lipitler inkübe edin.
2. Proteoliposome Formasyonu
Not: birkaç strateji lipozomlara deterjan çözülmüş protein eklemek için kullanılabilir. CLC-EC1 için diyaliz iyi çalışır ve bu nedenle tercih 6,9,10 bir yöntemdir.
- Saflaştırılmış protein ekleyin istenen protein-to-lipid ug o ifade (P / L) oranı ( F proteinine mg / lipid). P / L oranının seçimi deney amacına bağlıdır.
- Amaç, ilgi konusu proteinin aktivitesini değerlendirmek yüksek P tekrar oluşturmak için, her lipozom proteininin birden fazla kopyasını içerdiğinden / L ile, sinyali en üst düzeye çıkarmak için. Her bir kesecik ortalama 1 protein ihtiva edecek şekilde aktivitesi ve / veya proteinin üniter nakil oranını ölçmek için, düşük P / L'nin de bir Poisson seyreltme rejiminde sulandırın. Her rejimi kullanmak için ne zaman bir daha derinlemesine analiz için Adım 7 ve Tartışma bakın.
- Farklı tedavi rejimleri için uygun P / L değerlerini belirlemek için, protein konsantrasyonu 8,11-13 bir fonksiyonu olarak aktivitesi tam bir titrasyon yapmak. Bununla birlikte, aktif biriminin moleküler ağırlığı (MW kDa olarak belirtilmiştir) için kullanılan herhangi bir protein için, aşağıdaki P / L değerleri ilk guesstimates olarak kullanılabilir bilinmektedir:
pg "/>
- Önceden ıslatılmış diyaliz tüp veya bir kaset protein ve lipit karışımı yükleyin. 500-1,000x lipit yeniden oluşturma tampon hacmi ihtiva eden bir beher içinde diyaliz cihazı yerleştirin (yani, yağ yeniden süspanse edilmesi için 1 ml 1 L tamponu) hafif karıştırma altında.
- Değişim tampon aralıkları> 3 saatte 3-4 kez. Her çözelti, değişiminde, kaset / boru ve damıtılmış su ile beher yıkayın ve taze tampon maddesi ile yeniden oluşturma beher doldurun. Çözelti değişikliği için 1-2 O / N aralıklarını ekleyin. çözüm değişiklikleri tam sayısı ve süresi kullanılan tam lipid ve deterjanlar bağlıdır.
- Son adım tamamlandıktan sonra, diyaliz tekneden lipozomlar kaldırmak tüpler onları bölmeyin ve flaş -80 ° C'de sıvı N 2 veya dondurularak onları dondurmak.
3. Kayıt Ayarı
<p class = "jove_content"> NOT: Kayıt set-up (Şekil 2A) iki odadan (düz tabanlı silindir, ~ 3-4 ml hacimli), bir Cl oluşur - elektrot, bir analog bir pH metre (aşağıya bakınız) dijital elektrik çıkışı, bir sayısallaştırıcı ve uygun bir satın alma yazılımı ile bilgisayar veya.- PH metre elektrodu, bilgisayara bağlı olan sayısallaştırıcıya pHmetrenin çıkışını - Cl bağlayın. Bir odasında referans elektrot ve diğer (Şekil 2B) içinde recoding teli yerleştirin.
NOT: ΔV Cal pozitif (Adım 6.4 ve 7.2) ise tellerin kutuplarının doğru. - Kayıt odasına (Şekil 1B) ve bir karıştırma çubuğu olan bir karıştırma plakası üzerinde odaları yerleştirin. Karıştırma çubuğu elektrot temas etmediğinden emin olun.
- Bir agar köprü (Şekil 2B) (100 mM KCI ve% 2 agar) ile ölçme cihazı. 100 mM KCl Agar köprüleri saklayın.
Cl 4. hazırlanması - Elektrot
- Eski ve -possibly- çalışmayan pH elektrodu alın. Tamamen gümüş teller ortaya çıkarmak için cam kaplama kırın.
- Dikkatlice neşter bıçak kullanarak gümüş teller kaplama çıkarın. H2, O ve EtOH bol miktarda kullanarak telleri temizleyin.
- Teller kadar FeCl3 (ya da ağartıcı) bir doymuş çözeltisi içinde yer AgCİ muntazam bir koyu kaplama ile kaplanmıştır.
Tek tabakalı veziküller 5. N-
- deneyler önceki gece, dış tamponu, 15 ml (1 mM KCI, SO 4, 25 mM sitrik asit, pH 4.5, 150 mM K 2), hafif sallama ile (kımıldamam) içinde Sephadex G-50 taneleri 1 g kabarma Kullanmadan önce oda sıcaklığında en az 3 saat. Her bir deney, şişmiş boncuk ~ 3 ml gerektirir. En fazla birkaç gün 4 ° C'de şişmiş boncuk tutun.
- Lipozomlar oda sıcaklığında çözülmesi ederken, her sütun ~ 3 m dökmekşişmiş G-50 taneleri l. Oda sıcaklığında yerçekimi akışı ile onları kuru edelim; Bu genellikle 1-2 dakika sürer.
- 0.4 m, teflon kesme kullanarak Mini-ekstruderinden proteoliposomes 11 kes ekstrude tek lamelli kesecikler hazırlanır.
- Plastik yuvarlak dipli bir tüp içinde sütun yerleştirin. Fazla çözüm kaldırmak için sütunları Spin. Bir klinik santrifüj cihazında 1400 x g'de 20-30 saniye santrifüjleyin.
- 13 x 100 mm cam tüpe akış yoluyla yer sütun atın ve kolona ekstrüde veziküller 100 ul ilave edin. Bir klinik santrifüj cihazında 500 xg'de 1 dakika için sütun dönerler.
- Aşama 6.5 kayıt odasına eklenecek akış yoluyla ve ~ 200 ul toplayın.
6. akış ölçümü
- Referans (toprak) bölmesi içinde 100 mM KCl 2 ml ve dış tampon 1.8 ml yerleştirin (1 mM KCI, 150 mM K 2 SO 4, 25 mM sitrik asit, pH 4.5), kayıt odasına. İç arasındaki hafif ozmotik dengesizlikve dış çözümler etkilemez
- Satın alma programını başlatın. Bu birkaç dakika sürebilir, temel muvazene edelim.
- Sinyal istikrarlı bir temel (lipozomlar hazır ve sütunlar kurumaya) ulaştığında, (Şekil 3A) kaydetmeye başlayın.
- Sistem (Şekil 2A) kalibre edilmesi için bir 10 mM KCI çözeltisi 15 ul ekle.
- Lipozomlar ekleyin. Proteoliposomes (Şekil 3A) - küçük atlama nedeniyle dış Cl eksik çıkarılması için görünür olabilir. Bazal stabilize kadar bekleyin.
- Valinomycin ekleyin (1 mg EtOH / ml 1 ul) akış (Şekil 3A) gerçekleştirmek için kullanılır.
- Akış zamanı kursu bu yaylalar kadar (Şekil 3A) çalıştıralım.
- Tüm lipozomlar (Şekil 3A), çözünmesi için dış tamponu içinde hazırlanmış 1.5 M β-oktilglükozit (β-RG) 40 ul ekle. Kaydı bitirmek.
7. Veri Analysis
- Bir ASCII veya metin biçiminde gelen izleme dosyası dışa ve seçim analizi programına ithal.
- Aşağıdaki noktaları (Şekil 3A) Gerilim ölçün:
Kaydın başlangıcında (V 0);
Ayarlama sinyali (V cal) ilave edildikten sonra;
Lipozomlar (V lipo) ilave edildikten sonra;
Efflux (V kanat) sonunda;
Deterjan (V tot) ilave edildikten sonra;
Temel gerilimler böylece V 0 = 0. - Deneysel değerini belirlemek için, Nernst-Plank denklemi kullanın
ölçülerek 
Nerede Cilt Cal ul kalibrasyon nabız hacmi deneyi ifade başında odası hacmi, 1.800 olduğunu1; - kalibrasyon nabız ve mM dış tampon konsantrasyonları ve ΔV cal kalibrasyon darbesi sonrasında ölçülen mV atlama l [CI] cal / Cl vardır.
NOT: α Bu ampirik belirlenmesi üç amaca hizmet eder: sistem düzgün yanıt olmasını sağlar, deneyler arasındaki enstrümanın tepki tutarlılık ölçüsü sunuyor yanı sıra hiçbir hata çözüm yapımında yapılmış olduğunu kontrol etmek. - Aşağıdaki gibi her adımdan sonra Cl konsantrasyonları hesaplayın:
faktör 3/400 2000 ul nihai hacim içinde 15 ul kalibrasyon darbe seyrelmesi gelir. - CalculHer adımda, fin ΔCl lipo / / tot de [Cl] değişiklikleri yedik.
- Ile Cl (t) v (t) dönüştürme
Doğrudan kritik noktalarda [CI] değerlerini belirlemek ve bir iç kontrol olarak hesaplanan değerler bunları karşılaştırmak. - Iz Normale Cl rel = 0 lipo ve Cl rel tot = 1 böylece
- Aşağıdaki denkleme akış süresi kursu Fit:
Deneysel olarak Cl ölçülerek belirlenir sızıntısı - - L Cl oranı olduğu durumda, aynı koşullar ve τ hazırlanan proteinsiz lipozomlardan akışını işleminin zaman sabitidir. - V, ilk hız hesaplayın:
Nerede ΔCl fin milimolar ifade ve V ul odasının hacmi olduğunu. - Taşıma hızı / iletkenlik hesaplayın
P P / L olduğu durumda, molekül ağırlığı aktif kompleks molekül ağırlığı kDa olarak ifade edilen
ölçülerek 
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Değiştirici, lipozomlar içinde yeniden - saflaştırılmış CLC-EC1, bir prokaryotik CLC-tipi H + / Cl aracılığı taşıma - Biz detaylı ve sağlam Cl ölçmek için protokol açıklar. Deneyin şematik bir temsili Şekil 3 'de gösterilmiştir, saflaştırılmış CLC-EC1 ve yüksek iç Cl ihtiva ile yeniden Proteoliposomes -., Düşük Cl ihtiva eden bir banyo çözeltisine daldırıldığı -. Bu koşullar, net Cl altında - akış lipozom içinde verilebilir (Şekil 3A) pozitif şarj birikimi engellenmektedir. Akış (Şekil 3B) - Valinomycin eklenmesi K + membran böylece elektrik potansiyeli şant ve Cl başlatılması üzerinde hareket etmesine olanak sağlar. akı zaman süreci, bir Cl kullanılarak izlenir - selektif elektrot ve Cl toplam miktarı, - veziküller içerdiği doğrudan deterjan kullanarak çözündürülmesi suretiyle ölçülür. Bunlardankütle deneyler bu tür devir hızı, aktif proteinin etkin kompleksi ve fraksiyon stoikiometrisi gibi, tek yeniden proteinlerin özelliklerinin belirlenmesi mümkündür. Denklemler 7-9 kullanarak bu ~ 1 akış süresi dersi uyacak ve biz τ (0.2 ug / mg) = 41 sn ve f 0 (0.2 mg / mg) = 0.31, belirten bulmak CLC-EC1 üniter ulaşım oranını tahmin etmek lipozom / 3 0 aktif proteinleri içerir. Sn -1, yayınlanan değerler 8,14 ile iyi bir uyum içinde - bu değerlerden biz üniter taşıma oranı 2.500 ~ γ Cl olduğunu hesaplamak.
Şekil 1: Cı - akış deneyi (A - B) Cl şematik - proteinsiz lipozomlar (A) ya da CLC-EC1 için -efflux deneyi.yeniden vezikülleri (B) gerçekleştirildi. (C) iyonoforu başlatılan Cl benzetilmiş zaman ders - proteoliposomes (siyah) ya da protein içermeyen lipozomlar (gri kesikli çizgi) dan efflux. Dışarı akış iyonofor (*) ilave edilerek başlatılır ve (^) lipozomlar çözmek için, deterjan ilave edilerek sona erdirilir. Kırmızı çizgi üstel Cl zaman sabiti belirlemek için uygun, τ, bir kesik -. 0 aktif proteinleri içeren lipozomlar fraksiyonu CLC-EC1 ve f 0 en az 1 aktif kopyasını içeren lipozomlar gelen akış olan bir görüntülemek için buraya tıklayınız Bu rakamın büyük versiyonu.
Şekil 2: kurmak Kayıt Sorun (A) kayıt kurdu.. (B) odaları Close-up. <a href = "https://www.jove.com/files/ftp_upload/52369/52369fig2large.jpg" target = "_ blank"> bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3: Örnek izleme ve analiz 0.2 ug / mg P / L WT CLC-EC1 ile yeniden proteoliposomes gelen akış deneyleri (a) tipik v (t) izler.. Oklar KCI Kalibrasyon nabız, lipozomlar, Valinomycin ve β-OG eklenmesi sürelerini gösterir. Kesikli çizgiler, çeşitli aşamalarda ΔV değerlerini göstermektedir. (B) V (t) iz Denklem 5, normalize kullanarak Denklem 6 ve ders 7 Denklem uygun olan akış süresini (kırmızı kesikli çizgi) kullanarak Cl (t) dönüştürülür. (C) 0.2 ug / mg P / L (siyah) WT CLC-EC1 ile yeniden proteoliposomes veya 5 ug / mg P / L (gri) ile normalize akış zamanlı kurslar. Kesikli çizgis 7 Denklem akış süresi derslerin iyi uyan vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Saflaştırılmış anyon-seçici kanallar veya lipozomlar içinde yeniden taşıyıcıları aracılığı ile ulaşım - Biz detaylı Cl ölçmek için protokol tanımlanmıştır. CLC-EC1 eşanjöre - kullanılan örnek Prokaryotik H + / CI oldu. Söz konusu iyon için uygun biri ile AgCİ elektrot: Ancak, bu yöntemin hali hazırda ligandlar 12,13,15, gerilim 11,12, veya Ag değiştirerek farklı anyonik seçicilik 15,16 spor geçitleri kanalları çalışmaya adapte edilebilir. Elektrotlar Cl başka iyonlar için seçici -, örneğin, H +, ben - ve F -, ticari olarak temin edilebilir.
Kritik adımlar ve varsayımların bazı tartışılması izleyin.
Poisson seyreltme varsayım Sınırları
üniter oranı (Denklem 7-9) türetilmesi sadece bir Poisson seyreltme rejimi, çoğu lipozomlar devam geçerlidirain tek aktif protein belirli bir kesecik içinde birden fazla kopyasını içeren olasılığı düşüktür ve vezikül nüfusun makroskopik akış zaman sabiti de tek bir protein ihtiva eden lipozomlar olduğu hemen hemen aynıdır, böylece. Gerçekten de, Cl bir karşılaştırması - düşük (siyah, 0.2 ug / mg) ve yüksek, P / L (gri, 5 ug / mg), en CLC-EC1 ile yeniden lipozom aracılığı ile akış zaman süreci (Şekil 3C) göstermektedir ki İkinci durumda akış kinetik toplam lipozomlar küçük bir kısmı 0 proteinleri içerdiğini belirten, hızlı ve f 0 düşüş olur. Cl toplam miktarı, - her ikisi de vezikül numunelerde bulunan iki örnekteki veziküllerin toplam iç hacmi benzer olduğunu ve yeniden protein miktarı büyüklüğünü etkilemediğini göstermektedir sırasıyla ~ 0.7 ve 0.55 umol, karşılaştırılabilir vesiküller dahil bulunmaktadır. 7 Denklem yüksek P / L akış süresi kursu takılması τ değerleri üretir , Veziküllerin sadece ~% 6 bulunan ~% 31 aksine etkin CLC-EC1 dimerleri içeren belirten (5 ug / mg) = 8.8 sn, f 0 (5 ug / mg) = 0.06, zaman P / L = mg / 0.2 ug. Böylece, yüksek P / L üniter devir hızı tahmini 450 ~ γ Cl - sn -1, neredeyse düşük P / L elde olandan ve yayınlanan verilerin 8,14 düşük 6 kat. Bu nedenle, yüksek P yeniden lipozomlardan akış zamanlı kurslar analizi / L'nin yeniden proteinin üniter ulaşım hızını hafife olacaktır. Bu nedenle, doğru tam olarak yeniden yapılandırılmış protein miktarının belirlenmesi için anahtar öneme sahip olan yeni bir protein üniter nakil oranını belirlemek için ve bir Poisson seyreltme rejiminde düşük P / L ile çalışmak. Bu ideal olarak çalışması için en uygun rejimi tanımlamak için, tam protein titrasyon analizi ile belirlenerek elde edilir.
Aktif kompleks ağırlığının belirlenmesi
tert ">, yukarıda tarif edilen analiz, aktif kompleksinin stoikiometrisinin bilinen yeniden proteinin tamamen aktif olduğu varsayılır. Bununla birlikte, yeni preparasyonlar için, bu miktarları a priori olarak bilinmesi olabilir. Bu durumda, doğrudan bu parametreleri belirlemek mümkündür lipit oranları farklı protein F 0 's ölçerek
burada p, protein yoğunluğu, 
, Ρ lipid kütlesi başına lipozomlar sayısını, NA Avogadro sayısının M p işlevsel kanal kompleksinin kütlesi ve φ Aktif proteinlerin fraksiyonudur vardır. Lipit oranları çeşitli protein de 0 's, f deneysel belirlenen takarak bu pos olduğunup 0 belirlemek için mak ve bu nedenle M p ve φ.
Lipozom bir sonlu fraksiyonu dahil refrakter
üniter taşıma hızı türetme yüksek P / L'nin tüm lipozomlar en az bir aktif taşıma proteini içerir varsayar. Ancak, bazı durumlarda bu durumda değil bulunmuştur: yüksek P / lipozomlar L'nin önemli bir kısmı, bazı proteinlerin 11-13,17 yeniden oluşturulması için refrakter kalır. Bu fenomenin kökenli açık olmamakla birlikte daha büyük proteinleri, mevcut lipozomlar sayısını azaltarak daha küçük çaplarda vesiküller dahil olabileceği düşünülebilir.
Bu durumda, 10 Denklemi aşağıdaki şekilde modifiye edilmesi gerekir: 
θ Protei dirençli lipozomların kısmıdırn kuruluş. Farklı yöntemler lipozom yeniden oluşumu sırasında ve lipit ve protein için farklı kurtarma olacaktır çünkü Önemli olarak, ρ ve φ da yeniden oluşturma yöntemi ile etkilenir. Her ikisi için de% 100 verim varsayarsak γ bir yanlış tahmin yol açacaktır. Bu nedenle, bu deneysel yeniden 8,11 sırasında lipid ve protein kayıp kısmını belirlemek önemlidir yekpare devir / iletkenlik bir hassas kantitatif elde edildi.
Yeniden proteinlerin Oryantasyon
Analiz sırasında yapılan varsayımlardan biri, bütün yeniden oluşturulmuş proteinler, işlevsel olarak eşdeğer olmasıdır. Ancak, birçok kanal ve taşıyıcılar taşımaları yön, düzeltme olarak bilinen bir fenomen tercih etmişlerdir. Bu fonksiyonel asimetri ciro oranı bir tahmin hatası neden olabilir. Ayrıca, yeniden proteinlerin yönelim a priori + işlevsel seçici sadece yan bileşiğin aktive veya K kullanarak elverişli değerlere transmembran voltajını ayarlayarak ek üzerinden bir yönde tek proteinleri aktive taraflı inhibitörleri kullanan iki nüfus birini susturmak veya tarafından bu sorunu aşmak mümkün ligand veya voltaj-bağımlı kanallar veya nakliyecileri için degradeler.
Sıkı lipozomlar oluşumunda Hususlar
Kullanım sağlayan o önemli faktörlerden biriBurada tarif edilen akış deneyinde, f sıkı lipozomlar oluşumudur. Bu amaçla dikkate alınması gereken üç önemli değişkenler protein, deterjan-çıkarma stratejisi ve lipit bileşimi seçimi çözünürleştirmek için kullanılan deterjan seçimdir. Burada yer alan protokol CLC-EC1 Desil-maltopiranozit (DM), bu nedenle, kolaylıkla çıkarılan bir yüksek kritik misel konsantrasyonu (CMC), bir değere sahip bir deterjan içinde çözülür. Bununla birlikte, sentetik ve doğal olarak meydana gelen bir deterjan çeşitli sonra veziküller sıkılığı üzerinde etkileri ile sıkı lipozomlar içinde yeniden proteinleri saflaştırmak için kullanılmıştır. Bu deterjanlar milimolar gibi yüksek CMC geniş bir yelpazede ve (örneğin, Dodesil maltopiranozit (DDİ) veya dioctylpropane-bis-maltopiranozit (DMNG) gibi) mikromolar kadar düşük (örneğin, DM veya Digitonin'in gibi). Bu lipidler, lipozomlar, CHAPS kullanılarak çözülebilir ya da başka bir hafif deterjan oluşturulması için kullanılan Ancak dikkat etmek önemlidirVe bu nedenle, protein ve lipid kanşımından oluşan hibrid miseller ana deterjanlar daha farklı kimyasal-fiziksel özelliklere sahip olabilir. Bu nedenle mümkün olduğu bazı durumlarda daha belirgin sızıntıları yol açan lipozomlar istikrarsızlaştırmak olabilir kalan deterjan giderimi. Bu sorunu aşmak için böyle Biobeads 12,13, kolonlanyla 15 veya jel filtrasyon 18 gibi alternatif deterjan kaldırma stratejileri, araştırmak için tavsiye edilir. Son olarak, vezikül lipit bileşimi, spesifik karışımları belirli koşullarda farklı iyonlar sızan olabilir olarak önemli bir parametredir. Örneğin, E. oluşan lipozomlar E. coli, polar lipid ekstraktı Cl sıkı - asidik pH değerlerinde, ancak pH değeri 3 oluşan 19 veya lipozomlar arttıkça giderek daha zayıflamasına: 1-palmitoil-2-oleoil fosfatidil-etanolamin 1 karışımı (POPE) ve 1-palmitoil 2-oleoil fosfatidil (POPG) E. oluşturulan daha H + için çok daha düşük bir geçirgenliği göstermek coli kutup lipit 20 ayıklayın. Bu veziküller lipit bileşimi, aynı zamanda yeniden protein 13,21,22 aktivitesini etkileyebilecek Ancak dikkat etmek önemlidir. Bu nedenle, tam da her durumda elde proteinsiz veziküllerin özelliklerini belirlemek için ve bu yeniden proteinin özelliklerini nasıl etkilediğini belirlemek için çok önemlidir.
Olmayan CLC-tipi kanallar ve nakliyecilere Genelleme
Burada tarif edildiği gibi akış deneyi, doğrudan doğruya bir Cl tek bir molekül özelliklerini belirlemek için kullanılabilir - selektif kanal ya da taşıyıcı ve örneğin Ca2 + ile aktive edilen Cı özelliklerini karakterize etmek için kullanılmaktadır - TMEM16A 12 kanal . Biz şimdi taşıyıcıların veya chann özelliklerini araştırmak için akış deneyi nasıl adapte tartışmakseçici ve / veya CLC-EC1 ~ 10 3 iyon sn -1 önemli ölçüde farklı olan üniter taşıma fiyat bilgisi - Cl değildir kavuşmaktadır.
En basit durumda çalışılan protein anyon selektif olmasıdır. Bu durumda, sadece gerekli ayar Ag değiştirmektir: - selektif Flucs ve CLCs 16,23,24 ya da F - yapıldığı gibi, uygun bir seçicilik bir ticari olarak temin edilebilir bir ile AgCİ elektrot gibi CFTR 15 gibi geçirgen kanal . Öte yandan, yeniden protein katyonları için seçici ise, Valinomycin dışında bir iyonofor akışını başlatmak için kullanılmak zorundadır. Doğrulanmış Cl kıtlığı - verilen iyonoforlar yararlı bir ikame olduğu gibi, karbonil siyanit 4- (triflorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) gibi bir H + iyonoforu. Bu durumda, tampon arttırarak entravsekiler pH, örneğin, sabit bir muhafaza edilmesinin sağlanması önemlidirİç çözümün kapasitesi ing. Alternatif bir diğer strateji, bir karşı iyon olarak protonları ile ve bir pH ölçer 25 veya rasyometrik pH'a duyarlı probu 26 ile H + taşıma izleyerek sulandırılmış bir kanal ya da taşıyıcı ile katyon akışını takip etmektir. Ancak, bu ölçümlerin dolaylı doğası zor sulandırılmış protein taşıma özelliklerinin ölçümü vermektedir. Son olarak, elektrot katyon bulunmamakta, bir dizi seçici ve ticari olarak temin edilebilir. Üçüncü senaryo çalışılan protein, anyon ve katyon hem geçirgen olduğu, örneğin bir az seçici kanal 13 veya bir katyon / Cı - ortak taşıyıcı. Kendi tuz içeriği kaybeder, böylece bu durumda, yeniden lipozomlar (5,4-5,5 adım) çözeltisi değişimi işlemi sırasında bir KCI gradyanı korumamaktadır. Bu nedenle, bu durumda tüm kinetik bilgiler kaybolur. Bununla birlikte, lipozomlar fraksiyonu en az bir aktif kor ihtiva edeniçerik (adım 6.8) - ein 0 f, hala Cl tuzağa artık deterjan ekleyerek ve ölçülerek tespit edilebilir. Bu bir protein titrasyonu yürüten ve Denklem 10 ile proteinin molekül kütlesi tayini için izin verir.
Dikkate diğer yönü yeniden proteinin üniter taşıma oranı CLC-EC1 farklıdır büyüklükte emir olduğu olasılığıdır. Örneğin, çoğu taşıyıcılar, 1-10 sn -1, CLC-EC1 daha düşük büyüklükte 2-3 emir ciro fiyat bilgisi ise 10 6 -10 7 sn -1, 3-4,000 en kanalları davranış iyonları kat daha hızlı CLC daha -ec1. Yavaş taşıyıcıların Cl oranı için - Protein içermeyen lipozomlardan sızıntı proteinin ulaşım hızı azaldıkça akış süreci artar göreli ağırlığı olarak, sınırlayıcı olabilir. Bizim tecrübelerimize göre kaçak oranı hazırlıkları arasında biraz değişir ve sırasına göre genellikleBirkaç iyon sn -1. Yavaş taşıyıcılar ile çalışırken Bu nedenle, doğru veziküllerinin her parti karşılık gelen sızıntı ölçmek için her bir sulandırma için yan proteinsiz lipozomlar yan hazırlanması tavsiye edilmektedir. effluks tahlil başarıyla böyle bir siyanobakteriyel CLC 27 olarak ciro oranları ile yavaş nakliyecilere etrafında 1-10 iyon sn -1, üniter oranını belirlemek için kullanılmıştır. yeniden protein örneğin bir iyon kanalı için, yüksek iletkenlik olduğunda tersi durum oluşur. Bu durumda akış kinetik karıştırma süresi (~ 1-2 sn) ve hız sınırlayıcı hale kayıt elektrot içsel tepki süresi olarak çözülecek çok hızlı. Bu durumda, kinetik bilgi kaybı olmaz, ancak aktif kompleks kütle hala 24 tespit edilebilir. Böyle düzlemsel çift katlı lipid kayıtları veya yama sıkma lipozomlar gibi diğer yaklaşımlar, bu te gibi saflaştırılmış iyon kanallarını incelemek için daha uygun olduğunu bu fazlalaştıdoğrudan yüksek zaman çözünürlüğü ile tek bir molekül bilgi chniques.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Liposomicator, Avanti Polar Lipids Inc. | Avanti Polar Lipids Inc. | 610200 | |
| IEC Centra CL2 Benchtop | Thermo Scientific | ||
| Orion Research Model 701A Digital pH-mV meter | These can be found on Ebay. | ||
| Non-functional pH probe | Any pH meter probe with silver wires will work. The glass/plastic coating needs to be removed and the wires cleaned. | ||
| DI-710 Data Logger | DATAQ instruments | ||
| WinDAQ acquisition software | DATAQ instruments | ||
| Pierce Disposable Plastic Columns, Gravity-flow, 2ml | Pierce (Thermo Scientific) | 29922 | |
| KIMAX Culture Tubes, Disposable, Borosilicate Glass | Kimble Chase | 73500-13100 | |
| Extruder Set With Holder/Heating Block | Avanti Polar Lipids Inc. | 610000 | |
| Computer |
References
- Kawate, T., Gouaux, E. Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins. Structure. 14, 673-681 (2006).
- Drew, D., et al. GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae. Nat Protocols. 3, 784-798 (2008).
- Hattori, M., Hibbs, R. E., Gouaux, E. A fluorescence-detection size-exclusion chromatography-based thermostability assay for membrane protein precrystallization screening. Structure. 20, 1293-1299 (2012).
- Almo, S. C., Love, J. D. Better and faster: improvements and optimization for mammalian recombinant protein production. Curr Opin Struct Biol. 26, 39-43 (2014).
- Xiao, S., Shiloach, J., Betenbaugh, M. J. Engineering cells to improve protein expression. Curr Opin Struct Biol. 26, 32-38 (2014).
- Accardi, A., Miller, C. Secondary active transport mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. Nature. 427, 803-807 (2004).
- Nguitragool, W., Miller, C. Uncoupling of a CLC Cl-/H+ exchange transporter by polyatomic anions. J. Mol. Biol. 362, 682-690 (2006).
- Walden, M., et al. Uncoupling and turnover in a Cl-/H+ exchange transporter. J. Gen. Physiol. 129, 317-329 (2007).
- Accardi, A., Kolmakova-Partensky, L., Williams, C., Miller, C. Ionic currents mediated by a prokaryotic homologue of CLC Cl- channels. J. Gen. Physiol. 123, 109-119 (2004).
- Basilio, D., Noack, K., Picollo, A., Accardi, A. Conformational changes required for H(+)/Cl(-) exchange mediated by a CLC transporter. Nat Struct Mol Biol. 21, 456-463 (2014).
- Lee, S. Y., Letts, J. A., MacKinnon, R. Functional reconstitution of purified human Hv1 H+ channels. Journal of Molecular Biology. 387, 1055-1060 (2009).
- Terashima, H., Picollo, A., Accardi, A. Purified TMEM16A is sufficient to form Ca2+ activated Cl- channels. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 19354-19359 (2013).
- Malvezzi, M., et al. Ca2+-dependent phospholipid scrambling by a reconstituted TMEM16 ion channel. Nature Communications. 4, 2367 (2013).
- Picollo, A., Malvezzi, M., Houtman, J. C., Accardi, A. Basis of substrate binding and conservation of selectivity in the CLC family of channels and transporters. Nat Struct Mol Biol. 16, 1294-1301 (2009).
- Eckford, P. D., Li, C., Ramjeesingh, M., Bear, C. E. Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) potentiator VX-770 (ivacaftor) opens the defective channel gate of mutant CFTR in a phosphorylation-dependent but ATP-independent manner. J Biol Chem. 287, 36639-36649 (2012).
- Stockbridge, R. B., et al. Fluoride resistance and transport by riboswitch-controlled CLC antiporters. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 15289-15294 (2012).
- Menon, I., et al. Opsin is a phospholipid flippase. Curr Biol. 21, 149-153 (2011).
- Nimigean, C. M., Miller, C. Na+ block and permeation in a K+ channel of known structure. J Gen Physiol. 120, 323-335 (2002).
- Picollo, A., Xu, Y., Johner, N., Bernèche, S., Accardi, A. Synergistic substrate binding determines the stoichiometry of transport of a prokaryotic H(+)/Cl(-) exchanger. Nat Struct Mol Biol. 19, 525-531 (2012).
- Tsai, M. F., Fang, Y., Miller, C. Sided functions of an arginine-agmatine antiporter oriented in liposomes. Biochemistry. 51, 1577-1585 (2012).
- Heginbotham, L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. Functional reconstitution of a prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 111, 741-749 (1998).
- Lundbaek, J. A., Collingwood, S. A., Ingólfsson, H. I., Kapoor, R., Andersen, O. S. Lipid bilayer regulation of membrane protein function: gramicidin channels as molecular force probes. J R Soc Interface. 7, 373-395 (2010).
- Lim, H. H., Stockbridge, R. B., Miller, C. Fluoride-dependent interruption of the transport cycle of a CLC Cl(-)/H(+) antiporter. Nat Chem Biol. 9, 712-715 (2013).
- Stockbridge, R. B., Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. A family of fluoride-specific ion channels with dual-topology architecture. Elife. 2, e01084 (2013).
- Nimigean, C., Shane, T., Miller, C. A cyclic nucleotide modulated prokaryotic K+ channel. J Gen Physiol. 124, 7 (2004).
- Brohawn, S. G., del Mármol,, J,, MacKinnon, R. Crystal Structure of the Human K2P TRAAK, a Lipid- and Mechano-Sensitive K+ Ion Channel. Science. 335, 436-441 (2012).
- Jayaram, H., Robertson, J. L., Wu, F., Williams, C., Miller, C. Structure of a slow CLC Cl-/H+ antiporter from a cyanobacterium. Biochemistry. 50, 788-794 (2011).
