本文介绍了一种利用同步辐射X射线荧光技术测定样品中金属元素含量与分布的实验方案。我们以贴壁细胞为重点，描述了用于制备此类样品的化学固定方法。随后，详细说明了如何利用同步辐射X射线对样品进行装载与成像。
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本文内容
摘要
摘要
X射线荧光成像技术能够对大范围或小范围样品区域内的多种元素进行无损、同步的空间分布和浓度测定。该技术已广泛应用于多个科学领域，包括材料科学、地球科学、文化遗产研究以及化学生物学。在化学生物学领域中，例如通过可视化细胞内金属元素的分布，可以研究细胞中天然存在的金属离子，以及外源性引入的金属物质，如药物和纳米颗粒。由于几乎所有生物样品都处于完全水合状态，目前最理想的成像方式是采用冷冻固定后在低温条件下进行成像。然而，在无法便捷获取或实际操作受限的情况下，基于醛类的化学固定法仍然具有应用价值，有时甚至是不可避免的选择。本文尽可能详细地描述了通过化学固定法来制备贴壁哺乳动物细胞以用于X射线荧光成像的全过程。
引言
X射线荧光成像能够对样品中所含元素的种类和含量进行空间分辨。入射X射线的能量被选择为高于待测最重元素的电子结合能，从而克服内壳层电子与原子核之间的结合能1。这一过程在电子壳层中产生“空穴”。当高能电子跃迁填补这些空穴时，会发射出荧光X射线，其波长取决于这些轨道之间的能量差。由于轨道间能量间隔是特定元素的特征，X射线荧光发射也具有特征性的波长，该波长取决于元素种类。正是这种在特征波长处的发射使得能够识别样品中存在的元素。通过对荧光强度进行校准，可实现对元素含量的定量分析。
X射线荧光显微技术（XFM）的应用日益广泛，部分原因在于高亮度X射线同步辐射光源的发展，例如日本的Spring-8、法国的欧洲同步辐射装置（ESRF）以及美国的先进光子源（APS）2。这些光源可提供极高强度的X射线束。与此同时，X射线光学技术的进步，如波带片技术，使得这些光束能够被聚焦到亚微米尺度的光斑上，尽管效率相对较低3。由于X射线束强度极高，即使仅有少量光子被成功聚焦，也足以激发细胞内源性金属元素，产生可被现有探测器技术检测到的信号。因此，研究细胞内金属元素的化学生物学成为该技术近年来诸多进展的重要应用之一4-10。
在应用X射线荧光显微技术（XFM）研究培养的哺乳动物细胞或其他生物样品中的元素分布与定量时，需考虑诸多关键因素。首先，样品必须在结构和元素组成方面....
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方案
1. 仪器、基质、培养基和培养皿的准备
- 氮化硅（Si₃N₄）的处理3N4）窗口。
- 轻轻挤压胶囊一端含有窗口的部分，使胶囊略微打开，注意不要挤压到窗口本身，同时用另一只手旋转胶囊的另一端。
- 在体视显微镜下检查一对反向细尖镊子，确保其尖端无粘附物、缝隙或弯曲。否则，在后续步骤中镊子可能会损坏窗片或将窗片弹飞。
- 用镊子轻轻夹住窗片的框架，同时用手轻轻挤压胶囊靠近开口的一端，施加压力的方向应使窗片边缘需伸出部位的胶囊扩张，从而将窗片从胶囊中取出。
- 窗板预清洗（可选）。
- 必要时，可先将玻片轻轻浸入蒸馏水中5秒，随后在70%乙醇中洗涤2分钟，再在100%乙醇中洗涤2分钟。
- 在培养皿上固定并灭菌窗口
- 将窗口平的一面朝上放置于培养皿底部以固定窗口，在干净的玻璃载片上贴一条胶带，沿胶带长边剪下约四分之一英寸宽的条状部分，再从短边取下一小段胶带（在 ⅛” 由 ¾”用干净的剃须刀片。
- 使用镊子将胶带片贴在网格或窗口边缘，用量应足以牢固粘附，但不得覆盖窗口开口本身。用镊子操作已粘附的胶带，将窗口轻轻放置于培养皿底部。再用镊子尖端将胶带牢固地粘贴在培养皿底部。
- 用另一条胶带贴附于另一侧边缘，并....
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结果
X射线荧光成像提供生物样品信息的能力取决于样品的制备方式，即样品必须在实验时间尺度上具有抗辐射损伤的稳定性，同时其化学和结构特征又能得到良好保存。观察按照上述方法制备并成像的样品结果，可以看出样品中元素分布存在差异——表明固定过程保留了细胞的这些特征（图1）。
相反，观察一个该过程未成功进行的样品，缓冲液在干燥过程中仍然存在，其中存在的分子会形成大量晶体，从而对细胞结构造成损伤，并干扰X射线荧光光谱的采集（图2）。
这些图像通过逐像素拟合图像中每个点的X射线荧光光谱生成，这意味着在每个像素处采集的每条光谱均经过了独立分析。在查看由拟合数据生成的这些图像面板时，图像中每个点所赋予的值是对应特定元素特征发射峰的高斯函数积分总和例如， 铁）以最佳拟合在该点采集的X射线荧光光谱。例如，图像中的单个像素具有一个铁元素的数值，该数值等于在铁的特征发射能量处的高斯曲线下的面积总和，该高斯曲线用于拟合并建模样品上该点的发射光谱数据。数据通过每个图像上方的阈值.......
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讨论
X射线荧光成像在许多领域中具有重要应用，包括地球科学、材料科学和化学生物学26-34。同步辐射X射线技术及其聚焦技术的进步，已能够产生极高强度的X射线束。目前已有足够强度的聚焦X射线束，可激发细胞内源性金属，产生的信号能够通过当前可用的硅漂移探测器技术进行检测。其中，研究细胞内金属的化学生物学正是充分利用该领域近年来诸多进展的一个典型应用。
然而，由于生物材料含有水分，在使用X射线荧光显微技术研究生物材料时，相较于其他材料会面临特殊的挑战。为防止辐射损伤，理想情况下应在测量过程中将样品速冻形成玻璃态冰。然而，化学固定和空气干燥对初学者而言更容易实现，如果所关注的金属惰性地结合在可固定的生物大分子上，并且成像分辨率高于干燥过程中可能发生的超微结构损伤程度，则这些方法可能是合适的。
在为贴壁细胞XFM研究选择基底材料时，理想的基底需满足以下基本要求：1）支持细胞 robust 生长，且不干扰细胞正常的增殖及表型；2）其X射线荧光信号不得与目标元素的信号重叠；3）在XFM前可通过光学显微镜观察细胞生长状态，因此.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢Stefan Vogt在拟合本文所示代表性数据方面提供的帮助以及富有启发性的讨论。作者还感谢Chris Jacobsen对Q. J.的支持。
在美国能源部科学办公室基础能源科学办公室合同编号 DE-AC02-06CH11357 的支持下，使用了阿贡国家实验室先进光子源的 2-ID-E 和 8-BM-B 光束线。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 氮化硅窗口 | 英国Silson有限公司 / J B J商务园 / 北安普顿北路，北安普顿 NN7 3DW，英国 | SiRN-5.0-200-2.0-200。按尺寸订购。膜尺寸：1.5 mm × 1.5 mm。厚度：200 nm。框架尺寸：5 mm × 5 mm。框架厚度：200 µm。 | 替代来源：SPI Supplies / Structure Probe, Inc.，宾夕法尼亚州韦斯特切斯特。 |
| 反向镊子 | 电子显微科学公司，邮政信箱550，1560 Industry Road，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州 19440，电话：215-412-8400，免费电话：800-523-5874，传真：215-412-8450 | 78520-5X | EMS 5X, NC – 超细镊子 |
| 橡胶载网垫 | 电子显微科学公司，邮政信箱550，1560 Industry Road，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州 19440，电话：215-412-8400，免费电话：800-523-5874，传真：215-412-8450 | 71170 | 圆形载网垫 |
| 乙酸 | Sigma-Aldrich，3050 Spruce St.，圣路易斯，密苏里州 63103，电话：800-325-3010，传真：800-325-5052 | 338826 | 痕量金属级浓乙酸 |
| PIPES缓冲液 | Sigma-Aldrich，3050 Spruce St.，圣路易斯，密苏里州 63103，电话：800-325-3010，传真：800-325-5052 | P6757 | 固体PIPES缓冲液 |
| 甲醛储备液 | 电子显微科学公司，邮政信箱550，1560 Industry Road，哈特菲尔德，宾夕法尼亚州 19440，电话：215-412-8400，免费电话：800-523-5874，传真：215-412-8450 | RT 17113 | 10 × 10 ml安瓿装20%水溶液多聚甲醛 |
参考文献
- Thompson, A. C. Center for X-ray Optics and Advanced Light Source. , 1-53 (2009).
- Helliwell, J. R. Synchrotron radiation facilities. Nat. Struct. Biol. 5, 614-617 (1988).
- Lai, B., et al. X-ray Phase Zone Plate Fabricated by Lithographic Techniques. Appl. Phys. Lett. 6....
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重印与许可
