Abstract
इस शल्य प्रोटोकॉल का लक्ष्य stylomastoid रंध्र से अपने बाहर निकलने पर चेहरे मांसलता innervates जो चेहरे तंत्रिका, बेनकाब और या तो कट या परिधीय तंत्रिका चोट प्रेरित करने के लिए इसे कुचलने के लिए है। इस सर्जरी का लाभ इस प्रकार अन्य तंत्रिका चोट मॉडल की तुलना में एक अपेक्षाकृत हल्के शल्य परिणाम है, जिसके परिणामस्वरूप अपनी सादगी, उच्च reproducibility, और बाद में चेहरे का पक्षाघात से महत्वपूर्ण कार्यों या गतिशीलता पर प्रभाव की कमी कर रहे हैं। एक कपाल तंत्रिका चोट मॉडल का उपयोग करने का एक प्रमुख लाभ motoneurons motoneuron सेल शरीर के अध्ययन को सरल बनाने, पोंस में चेहरे की मोटर नाभिक में एक अपेक्षाकृत समरूप जनसंख्या में निवास करता है। क्योंकि चेहरे तंत्रिका स्फूर्तिदान के सममित प्रकृति और चेहरे मोटर नाभिक के बीच crosstalk की कमी की वजह से, आपरेशन unaxotomized ओर एक बनती आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवारत के साथ एकतरफा प्रदर्शन किया जा सकता है। विश्लेषण की एक किस्म गधे को postoperatively किया जा सकता हैइस लेख के दायरे से बाहर हैं, जिसका विवरण शारीरिक प्रतिक्रिया, एस। उदाहरण के लिए, मांसपेशी समारोह की वसूली reinnervation के लिए एक व्यवहार मार्कर के रूप में सेवा कर सकते हैं, या motoneurons सेल अस्तित्व को मापने के लिए मात्रा निर्धारित किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, motoneurons के सही रूप में आणविक विश्लेषण के लिए लेजर microdissection का उपयोग कर लिया जा सकता है। चेहरे तंत्रिका axotomy के न्यूनतम इनवेसिव और अच्छी तरह सहन है, क्योंकि यह आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों की एक विस्तृत विविधता पर उपयोग किया जा सकता है। इसके अलावा, इस सर्जरी मॉडल परिधीय तंत्रिका चोट उपचार के प्रभाव का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चेहरे तंत्रिका चोट न केवल motoneurons की जांच के लिए एक साधन प्रदान करता है, लेकिन मध्य और परिधीय glial microenvironment, प्रतिरक्षा प्रणाली, और लक्ष्य मांसलता के भी हिमायती हैं। चेहरे तंत्रिका चोट मॉडल तंत्रिका चोट और उत्थान के अध्ययन के लिए एक शक्तिशाली उपकरण के रूप में कार्य करता है कि एक व्यापक रूप से स्वीकार परिधीय तंत्रिका चोट मॉडल है।
Introduction
कई परिधीय तंत्रिका चोट मॉडल मौजूद हैं, लेकिन motoneurons के अध्ययन के लिए बाहर खड़ा है कि एक चेहरे तंत्रिका axotomy के मॉडल है। यह भी कपाल तंत्रिका सातवीं के रूप में जाना जाता है चेहरे तंत्रिका, पोंस में निकलती है और चेहरे की अभिव्यक्ति 1,2 की मांसपेशियों innervates। इस शल्य प्रोटोकॉल में, चेहरे तंत्रिका stylomastoid रंध्र से अपने बाहर निकलने पर अवगत कराया और कटौती या कुचल या तो है। तंत्रिका चोट की गंभीरता को क्रमिक रूप से अक्षतंतु बंडलों के आसपास लपेटो कि संयोजी ऊतक परतें हैं जो एक्सोन, endoneurium, perineurium, और epineurium की intactness के आधार पर चोट differentiates जो सुंदरलैंड तीन वर्गीकरण, निम्न में वर्गीकृत किया जा सकता है। क्रश चोट (axonotmesis) में, एक्सोन कटे हैं, लेकिन perineurium और epineurium संरक्षित कर रहे हैं। बरकरार तंत्रिका म्यान एक्सोन 4,5 regrow के भीतर जो एक नाली के रूप में कार्य करता है क्योंकि चेहरे की हिम्मत कुचलने से पूरा कार्यात्मक वसूली के बारे में 11 दिनों में होता है। परदूसरी ओर, कट चोट (neurotmesis) में, axons और सभी 3 संयोजी ऊतक परतों कटे रहे हैं, और पूरे बाहर का तंत्रिका मांसलता स्फूर्तिदान बहाल करने के लिए regrow चाहिए। Epineurium के सर्जिकल पुनः कनेक्शन अक्सर तंत्रिका transection चोटों के साथ मानव रोगियों में किया जाता है, फिर भी वसूली परिणामों शायद ही कभी इष्टतम हैं। आगे के अध्ययन तंत्रिका अपने लक्ष्य को regrow करने में विफल रहता है और क्या उपचारों में सुधार लाने और पुनर्योजी प्रक्रिया में तेजी लाने के लिए नियोजित किया जा सकता है समझने के लिए क्यों जरूरी है।
चेहरे तंत्रिका axotomy के मॉडल का उपयोग तंत्रिका चोट का अध्ययन करने के कई फायदे हैं। सबसे पहले, चेहरे तंत्रिका axotomy प्रक्रिया, जल्दी आसान है, और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है; और चेहरे की मांसपेशियों की एवज में पक्षाघात महत्वपूर्ण कार्यों को प्रभावित नहीं करता है और अच्छी तरह से पशु द्वारा सहन किया है। इस motoneurons वीं में एक अपेक्षाकृत समरूप जनसंख्या में रहते हैं क्योंकि सरल है motoneuron सेल शरीर का अध्ययन कर एक कपाल तंत्रिका चोट मॉडल है, क्योंकिपोंस में ई चेहरे मोटर नाभिक। सात subnuclei मांसपेशियों के एक विशिष्ट समूह innervating करने के लिए प्रत्येक विशिष्ट के रूप में वहाँ की आबादी, चेहरे मोटर नाभिक के भीतर subnuclear पैटर्न के आधार पर भिन्न होता है, तो axotomy के जवाब में subnuclear मतभेद परिणाम 2,6,7 प्रभाव हो सकता है।
चेहरे तंत्रिका चोट मॉडल का एक प्रमुख लाभ तंत्रिका स्फूर्तिदान अत्यधिक सममित है और चेहरे की मोटर नाभिक 8 के बीच कोई crosstalk है क्योंकि वहाँ unaxotomized ओर एक बनती आंतरिक नियंत्रण के रूप में सेवा कर सकते हैं। इस शल्य चिकित्सा पद्धति का उपयोग करने का एक और लाभ यह प्रत्यक्ष सीएनएस को आघात या रक्त मस्तिष्क बाधा 9 के विघटन की कमी है। ऐसे अत्यधिक खून बह रहा है और संक्रमण के रूप में जटिलताओं इस प्रक्रिया के साथ दुर्लभ हैं।
विश्लेषण की एक किस्म तंत्रिका चोट की शारीरिक प्रतिक्रिया का आकलन करने के लिए किया जा सकता है। आंख झपकी पलटा और गलमुच्छा गतिविधि की वसूली एक व्यवहार के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता हैकार्यात्मक वसूली 10,11 के उपाय। दृढ़रोम गतिविधि की वीडियो रिकॉर्डिंग वर्तमान चेहरे तंत्रिका स्फूर्तिदान 12,13 की वसूली का पता लगाने के लिए सबसे शक्तिशाली तरीका है। इच्छामृत्यु के बाद, brainstem के histological विश्लेषण चेहरे मोटर नाभिक के भीतर motoneuron सेल शरीर पर प्रदर्शन किया जा सकता है। चेहरे की मोटर नाभिक चोट 2,6 करने के लिए प्रतिक्रियाओं का अंतर परीक्षा के लिए अनुमति देता है, सात subnuclei, कुछ चेहरे की मांसपेशियों के लिए प्रत्येक विशिष्ट में विभाजित है। चेहरे motoneurons सेल अस्तित्व यों को गिना जा सकता है, या immunohistochemistry बायोमार्कर और विशिष्ट सेल आबादी 14 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। चेहरे की मोटर नाभिक सही रूप में तंत्रिका चोट 15,16 के लिए सेलुलर प्रतिक्रिया की आणविक विश्लेषण के लिए लेजर कब्जा का उपयोग कर microdissected जा सकता है। चेहरे तंत्रिका axotomy के प्रभावों मोटर प्रांतस्था 17,18 में विश्लेषण किया जा सकता है। इसके अलावा, तंत्रिका Wallerian अध: पतन का अध्ययन करने के विच्छेदित किया जा सकता है 19 याअक्षतंतु उत्थान 20, और मांसपेशियों neuromuscular जंक्शनों 21 अध्ययन करने के लिए हटाया जा सकता है। चेहरे तंत्रिका axotomy के भी मांसलता 21, और प्रतिरक्षा प्रणाली की प्रतिक्रिया 23, साथ मध्य और परिधीय glial कोशिकाओं 22 अध्ययन लक्षित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। ज्यादा चेहरे तंत्रिका axotomy के मॉडल 24 का अध्ययन करने में पूरा किया गया है हालांकि तंत्रिका क्षति के रोगियों के लिए एक महत्वपूर्ण समस्या है और वर्तमान उपचार इष्टतम परिणाम का उत्पादन करने में विफल रहते हैं, क्योंकि परिधीय तंत्रिका चोट के आगे के अध्ययन के लिए आवश्यक है। इस मॉडल तंत्रिका चोट की शारीरिक प्रतिक्रिया की जांच और तंत्रिका पुनर्जनन उपचार की प्रभावशीलता का विश्लेषण करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।
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Protocol
निष्पादित सभी प्रक्रियाओं चिकित्सा संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति के इंडियाना विश्वविद्यालय के स्कूल ने मंजूरी दे दी है और स्वास्थ्य के दिशा निर्देशों के राष्ट्रीय संस्थान का पालन कर रहे हैं।
1. सर्जिकल तकनीक
- बाँझ दस्ताने, उपकरण, और एनआईएच दिशा निर्देशों के 25 के अनुसार एक बाँझ शल्य चिकित्सा क्षेत्र का उपयोग करके इस प्रक्रिया के दौरान सड़न रोकनेवाला तकनीक बनाए रखें। उन्हें autoclaving द्वारा सर्जरी की शुरुआत से पहले उपकरण जीवाणुरहित (पूरी सूची के लिए विशिष्ट अभिकर्मकों / उपकरण की तालिका देखें)। आपरेशन के दौरान उपकरण जीवाणुरहित करने के लिए एक गिलास मनका अजीवाणु का प्रयोग करें।
2. संज्ञाहरण और तैयारी
- एक पशु चिकित्सा isoflurane vaporizer प्रणाली का उपयोग करते हुए 0.9 एल / मिनट ऑक्सीजन और 2.5% isoflurane के एक मिश्रण के साथ एक संज्ञाहरण बॉक्स में माउस anesthetize। माउस बॉक्स से इसे हटाने से पहले शरीर की स्थिति में परिवर्तन करने के लिए जवाब नहीं है कि सुनिश्चित करें।
- समझौता ज्ञापन के नेत्र मरहम लागू करेंएसई की आँखें बाहर सुखाने से उन्हें बचाने के लिए।
- नाक शंकु के लिए बॉक्स से गैस का प्रवाह स्विच करें। शंकु के अंदर अपनी नाक और मुंह के साथ एक शल्य चिकित्सा पैड और शोषक बेंच कागज के साथ कवर एक गर्म पैड पर अपनी बाईं ओर पर squarely माउस रखें। लगातार माउस की सांस लेने ताल और दर पर नजर रखने और जरूरत के रूप में isoflurane के स्तर को समायोजित - संज्ञाहरण की एक पर्याप्त स्तर बनाए रखने के लिए (2.5 के बीच 3 isoflurane%), और कुल बेहोश करने की पुष्टि करने के लिए पैर की अंगुली चुटकी पलटा उपयोग करें।
3. सर्जिकल दृष्टिकोण
- संरेखित करें और शल्य चिकित्सा क्षेत्र के साथ स्टिरियोस्कोप ध्यान केंद्रित। नाक शंकु समायोजित करें और यह दृश्य क्षेत्र की बढ़त के साथ तैनात किया गया है ताकि इसे नीचे टेप।
- माउस अपनी बाईं ओर झूठ बोल के साथ, चीरा बनाया जाएगा जहां कान के पीछे क्षेत्र को प्रकाश में लाने, नाक शंकु के लिए सही कान के किनारे टेप। पीछे चुपचाप कान मे कहा नस कान भर में क्षैतिज यात्रा करता है कि सुनिश्चित करें। ध्यान दें कि टी का सही स्थानवह पशु और कान के टेप जल्दी से चेहरे की नस को खोजने के लिए महत्वपूर्ण हैं।
- पर और 70% इथेनॉल के साथ कान के पीछे फर गीले और एक रेजर या स्केलपेल ब्लेड का उपयोग शल्य साइट दाढ़ी। प्री-गीला फर इस संरचनात्मक स्थान में आसान हजामत बनाता है।
- 70% इथेनॉल के द्वारा पीछा ऐसे Betadine शल्य साफ़ (7.5% povidone आयोडीन) के रूप में एक आयोडीन समाधान है, के साथ त्वचा को साफ करें। अच्छी तरह से क्षेत्र कीटाणुरहित करने के लिए इस सफाई दो बार दोहराएँ।
- , चीरा बनाने के कान उभार को क्षेत्र पीछे करने के लिए दुमदारी कान से पीछे चुपचाप कान मे कहा नस का पता लगाने के लिए स्थान का निर्धारण करने के लिए। उभार को 3 मिमी पीछे - वसंत कैंची का प्रयोग, एक 4 मिमी चीरा 2 बनाते हैं।
- कुंद विच्छेदन का उपयोग कर वसा और प्रावरणी के माध्यम से काटना। रक्त वाहिकाओं या मांसपेशियों के ऊतकों को आसानी से क्षतिग्रस्त हो सकता है क्योंकि कैंची के साथ सीधे काटने से बचें।
- खून बह रहा होता है, तो एक बाँझ कपास झाड़ू के साथ शल्य साइट के लिए दबाव लागूकम से कम 30 सेकंड के लिए। महत्वपूर्ण द्रव नुकसान होता है, तो एक 25 या 27 जी सुई का उपयोग बाँझ 0.9% खारा समाधान के मिलीलीटर 0.5 के साथ intraperitoneally माउस इंजेक्षन।
- चेहरे तंत्रिका पता लगाने के लिए, कई महत्वपूर्ण स्थलों, रीढ़ की हड्डी में गौण तंत्रिका, कान नहर का प्रयोग करें, और (नीचे वर्णित) द्वितुंदी मांसपेशी पूर्वकाल। चेहरे तंत्रिका की शाखाओं कल्पना कर रहे हैं जब तक इन स्थलों के आसपास काटना। यह पता चला है जब तंत्रिका एक महत्वपूर्ण ठोस सफेद संरचना के रूप में दिखाई देगा और प्रावरणी की एक परत अंतर्निहित संरचनाओं के लिए यह पालन करता है।
- वसा और प्रावरणी विच्छेदित किया गया है एक बार, trapezius मांसपेशी अंदर आना खोपड़ी की दुम भाग से यात्रा जो रीढ़ की हड्डी में गौण तंत्रिका, का पता लगाएं। चेहरे तंत्रिका रीढ़ की हड्डी में गौण तंत्रिका को गहरा है।
- मोती सफेद लग रहा है और चेहरे की हिम्मत करने के लिए व्याख्यान चबूतरे वाला देखा जा सकता है कि उपास्थि कान नहर का पता लगाएं।
- के शीर्ष और ग पर स्थित है कि पूर्वकाल द्वितुंदी मांसपेशियों की मांसपेशियों पेट का पता लगाएंचेहरे तंत्रिका को audal।
- चेहरे तंत्रिका की मुख्य शाखाओं में कल्पना कर रहे हैं, जब stylomastoid रंध्र से उनके मूल खोजने के लिए पीछे की ओर से उन्हें पता लगा। , खुले शल्य साइट पकड़ तंत्रिका के मार्ग का अनुसरण वसंत कैंची सुझावों अग्रिम, फिर खुला नव उन्नत क्षेत्र रखने के लिए पीछे की ओर संदंश स्थानांतरित करने के लिए ठीक इत्तला दे दी Dumont संदंश # 5/45 का उपयोग करना।
- इस बिंदु पर गाल की हड्डी, मुख के साथ चेहरे तंत्रिका के ट्रंक, और सीमांत जबड़े शाखाओं कल्पना।
नोट: अस्थायी शाखा रंध्र के करीब मिल जाएगा। इसकी ऊपरी और निचले भागों में सीमांत जबड़े तंत्रिका शाखाओं के करीब जबड़े के लिए, इस प्रकार उन तंत्रिका शाखाओं इस स्तर पर नहीं दिखाई देंगे।- एक तंत्रिका transection प्रदर्शन कर करते हैं, तो ठीक टिप संदंश के साथ धीरे तंत्रिका को स्थिर करने और वसंत कैंची से तंत्रिका काटा। Brainstem से तंत्रिका avulsing को रोकने के लिए संदंश के साथ तंत्रिका करने के लिए बहुत ज्यादा कर्षण लागू करने से बचें। धक्का देंदूर एक दूसरे को, या कटौती और बाहर का तंत्रिका के एक हिस्से को हटाने से स्टंप कोई कनेक्शन हो सकता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए।
- एक क्रश चोट के प्रदर्शन है, तो, सभी एक्सोन तोड़ पहला क्रश साइट सीधा करने के लिए एक दूसरे के कोण पर इस कुचलने दोहराने के लिए लगातार दबाव का उपयोग कर 30 सेकंड के लिए तंत्रिका सेक करने के लिए ड्यूमॉन्ट # 5/45 संदंश का उपयोग करें। अन्यथा चोट जानवरों के बीच असंगत हो जाएगा, 30 सेकंड कुचलने के दौरान दबाव के चर मात्रा में आवेदन करने से बचें।
4. बंद करने और वसूली
- अंतर्निहित संरचनाओं से अधिक वसा और मांसपेशियों का स्थान बदलें।
- चीरा के किनारों अनुमानित और एक 7.5 मिमी घाव क्लिप का उपयोग कर घाव को बंद करें। टांके या गोंद भी घाव बंद करने के लिए स्वीकार्य हैं। Postsurgical दर्दनाशक दवाओं इस समय उपलब्ध कराया जा सकता है।
- माउस के कान से टेप निकालें। Isoflurane के प्रवाह को बंद करें और माउस एक मिनट 30 सेकंड के लिए शुद्ध ऑक्सीजन साँस लेने के लिए अनुमति देते हैं। Plसंज्ञाहरण से उबरने के लिए कोई बिस्तर के साथ एक खाली पिंजरे में माउस ऐस।
- माउस बरामद किया जाता है, चेहरे का पक्षाघात की पुष्टि के संकेत के लिए अपने व्यवहार की जांच। मूंछ पंगु और वापस गाल की ओर angled किया जाएगा, नाक भटक जाएगा, और आंख हवा का एक कश के जवाब में झपकी नहीं होगा।
- घर पशुओं संयुक्त रूप से सर्जरी के बाद वे महिला हैं। वे अधिक आक्रामक हो रहे हैं और जबरन संक्रमण की ओर जाता है जो उनके cagemate के घाव क्लिप, को दूर करने के लिए करते हैं क्योंकि संयुक्त रूप से पुरुष चूहों आवास से बचें। यदि आवश्यक हो, इस समय postsurgical दर्दनाशक दवाओं प्रदान करें।
- कोई संक्रमण या अन्य जटिलता postoperatively होता है कि यह सुनिश्चित करने के लिए ऑपरेशन के बाद कई दिनों के लिए एक दिन में एक बार चूहों मॉनिटर। वे अपने दम पर बाहर गिर नहीं किया है तो सर्जरी के बाद 10 दिन - घाव क्लिप 7 निकालें।
- आंख झपकी पलटा पुनः है या तो जब तक, दैनिक कॉर्निया जटिलताओं को रोकने के लिए प्रभावित आंख से आंख मरहम चिकनाई लागू करेंकवर या इच्छामृत्यु जब तक।
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Representative Results
चेहरे तंत्रिका axotomy के लिए किया जाता है के बाद, motoneuron नुकसान चोट का एक परिणाम के रूप में होता है। चोट के बाद motoneuron अस्तित्व में इस तरह दोनों motoneuron अस्तित्व डेटा को संक्षेप में लिंग, सर्जरी के समय पशु उम्र, और motoneuron मायने रखता है काम कर रहे हैं, जिस पर timepoint, और मोरन और Graeber समीक्षा 24 और Jinno और यामादा की समीक्षा 22 के रूप में कई चर, पर निर्भर करता है। आमतौर पर, motoneurons के बारे में 86% के बाद axotomy के 14,15,26 28 दिनों में जीवित रहते हैं। Motoneuron नुकसान के कैनेटीक्स Serpe एट अल में वर्णित हैं। 2000 चित्रा 1 कई आनुवंशिक रूप से संशोधित चूहों में motoneuron अस्तित्व में बदलाव को दिखाता है। कोई महत्वपूर्ण मतभेद आनुवंशिक परिवर्तन आधारभूत मायने रखता प्रभाव नहीं है यह दर्शाता है कि नियंत्रण पक्ष के चेहरे motoneuron मायने में मनाया जाता है। महत्वपूर्ण सेल नुकसान एक माउस मॉडल में मनाया जाता है,, (चित्रा 1 ए, डी 84% 2.0 ±) जंगली प्रकार चूहों में motoneuron अस्तित्व की तुलनाamyotrophic पार्श्व काठिन्य की (SOD1 G93A; 68% ± 1; चित्रा 1 बी, ई) के साथ-साथ immunodeficient पुनर्संयोजन सक्रिय जीन-2 पीटकर माउस 27 (चीर-2 - - /; चित्रा 1C, एफ, 57% 2.5 ±) ।
चित्रा 2 चेहरे मोटर नाभिक के लिए लागू लेजर कब्जा microdissection तकनीक को दर्शाता है। पूरे चेहरे मोटर नाभिक (2A चित्रा-सी) पर कब्जा कर लिया जा सकता है, या subnuclei (चित्रा 2 डी-एफ) को अलग से एकत्र किया जा सकता है। अधिक से अधिक परिशुद्धता के लिए, motoneurons व्यक्तिगत रूप से कब्जा किया जा सकता है, और शेष neuropil विश्लेषण (चित्रा 2 जी-आई) के लिए एकत्र किया जा सकता है। 3 subnuclear ventromedial की तुलना नमूने और ventrolateral subnuclei से निकाले शाही सेना सामग्री की qPCR परिणाम दर्शाया गया चित्र। चार जीनों का परीक्षण किया, β द्वितीय ट्यूबिलिन, विकास प्रोटीन-43 (गैप-43) जुड़े, hemopoietic- और तंत्रिका संबंधी व्यक्त अनुक्रम -1 (Hn1), और मस्तिष्क व्युत्पन्न neurotrophic कारक (BDNF) सभी तंत्रिका पुनर्जनन प्रतिक्रिया के साथ जुड़े और axotomy के 16 के बाद दो subnuclei और उनके जीन की अभिव्यक्ति प्रोफाइल के बीच दिलचस्प मतभेद हैं कर रहे हैं।
चित्रा 1. प्रतिनिधि राज्याभिषेक चेहरे मोटर नाभिक वर्गों thionin के साथ दाग और 28 दिनों के चेहरे तंत्रिका transection के बाद मात्रा निर्धारित। चेहरे मोटर नाभिक (ए, डी) गुम्मट, (बी, ई) SOD1 G93A, और (सी, एफ) RAG- से दिखाए जाते हैं 2 - / - चूहों (नियंत्रण पक्ष, axotomized की ओर)। स्केल सलाखों 120 माइक्रोन =। यह आंकड़ा 27 से संशोधित किया गया है। वें का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करेंआंकड़ा है।
चेहरे की मोटर नाभिक चित्रा 2. लेजर microdissection के। (ए) आंशिक axotomized चेहरे नाभिक की लेजर microdissection, और लेजर microdissected ऊतक (सी) के संग्रह के साथ axotomized चेहरे नाभिक, (बी) के Thionin से सना हुआ अनुभाग। Subnuclei के एक टेम्पलेट (डी) ventromedial की पहचान करने और लेजर microdissection (ई, एफ) के लिए चेहरे का subnuclei ventrolateral करने के लिए कंप्यूटर स्क्रीन पर आरोपित किया गया था। चेहरे motoneurons लेजर एक दृश्य नाभिक और nucleolus के साथ उनकी आकृति विज्ञान पर आधारित microdissected थे, तीर (जी) ने संकेत दिया FMN सेल शरीर के टुकड़े, लेजर अलग से microdissected और समाप्त करने के लिए का निपटारा किया गया, जबकि FMN mRNA के (* motoneuron, जी, एच इंगित करता है) neuropil एस मेंamples। सभी FMN और सेल शरीर के टुकड़े एकत्र किए गए थे, के बाद शेष चेहरे नाभिक ऊतक neuropil नमूना (मैं) के रूप में microdissected लेजर था। स्केल सलाखों 100 माइक्रोन =। यह आंकड़ा 16 से संशोधित किया गया है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
चित्रा 3. समर्थक उत्थान और समर्थक अस्तित्व mRNA अभिव्यक्ति ventromedial में (वीएम) और ventrolateral (वीएल) चेहरे तंत्रिका axotomy के निम्नलिखित चेहरे मोटर subnuclear क्षेत्रों के। के लिए transected वीएम और वीएल चेहरे subnuclei सापेक्ष में SEM ± mRNA अभिव्यक्ति का औसत प्रतिशत unoperated नियंत्रण subnuclei (विज्ञापन)। MRNA अभिव्यक्ति के समय पाठ्यक्रम βII ट्यूबिलिन के लिए कोई चोट (0), 3, 7, 14, और 28 DPO (ए भी शामिल (बी), Hn1 (सी), और BDNF (डी)। # पी <0.05 पर वी एम की तुलना में वीएल की महत्वपूर्ण मतभेद, का प्रतिनिधित्व करता है। यह आंकड़ा 16 से संशोधित किया गया है।
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereo microscope | Leica | M60 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | 15-952 | |
| Vannas-Tübingen spring scissors - straight/sharp/8.5 cm/5 mm cutting edge | Fine Science Tools | 15003-08 | Sterilize before use |
| Dumont #5/45 forceps - standard tips/angled 45°/Dumoxel/11 cm | Fine Science Tools | 11251-35 | Sterilize before use |
| Michel suture clips - 7.5 mm x 1.75 mm | Fine Science Tools | 12040-01 | Described as "wound clip" in protocol, sterilize before use |
| Hagenbarth cross action wound clip applier 5" | George Tiemann & Co | 160-910 | Used to apply wound clip, sterilize before use |
| Michel suture clip applicator & remover - For 7.5 mm clips | Fine Science Tools | 12029-12 | Used to remove wound clip |
| 0.9% Sodium chloride injection, USP | Hospira | 0409-4888-10 | |
| Betadine, 16 oz, with dispenser | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% Ethanol | |||
| Glass bead sterilizer |
References
- Kaufman, M., Bard, J. The Anatomical Basis of Mouse Development. , Elsevier. New York, NY. (1999).
- Ashwell, K. The adult mouse facial nerve nucleus: morphology and musculotopic organization. Journal of Anatomy. 135, 531-538 (1982).
- Sunderland, S. A classification of peripheral nerve injuries producing loss of function. Brain : A Journal Of Neurology. 74, 491-516 (1951).
- Beahrs, T., Tanzer, L., Sanders, V. M., Jones, K. J. Functional recovery and facial motoneuron survival are influenced by immunodeficiency in crush-axotomized mice. Experimental Neurology. 221, 225-230 (2010).
- Mesnard, N. A., Haulcomb, M. M., Tanzer, L., Sanders, V., Jones, K. J. Delayed functional recovery in presymptomatic mSOD1G93A mice following facial nerve crush axotomy. Journal of Neurodegeneration & Regeneration. 4, 21-25 (2013).
- Komiyama, M., Shibata, H., Suzuki, T. Somatotopic representation of facial muscles within the facial nucleus of the mouse. A study using the retrograde horseradish peroxidase and cell degeneration techniques. Brain Behav Evol. 24, 144-151 (1984).
- Canh, M. Y., Serpe, C. J., Sanders, V., Jones, K. J. CD4(+) T cell-mediated facial motoneuron survival after injury: Distribution pattern of cell death and rescue throughout the extent of the facial motor nucleus. Journal of Neuroimmunology. 181, 93-99 (2006).
- Isokawa-Akesson, M., Komisaruk, B. Difference in projections to the lateral and medial facial nucleus: anatomically separate pathways for rhythmical vibrissa movement in rats. Exp Brain Res. 65, 385-398 (1987).
- Streit, W., Kreutzberg, G. Response of endogenous glial cells to motor neuron degeneration induced by toxic ricin. The Journal of Comparative Neurology. 268, 248-263 (1988).
- Serpe, C. J., Tetzlaff, J. E., Coers, S., Sanders, V., Jones, K. J. Functional recovery after facial nerve crush is delayed in severe combined immunodeficient mice. Brain, Behavior, And Immunity. 16, 808-812 (2002).
- Lal, D., et al. Electrical stimulation facilitates rat facial nerve recovery from a crush injury. Otolaryngology--Head And Neck Surgery. Official Journal Of American Academy Of Otolaryngology-Head And Neck Surgery. 139, 68-73 (2008).
- Tomov, T., et al. An Example of Neural Plasticity Evoked by Putative Behavioral Demand and Early Use of Vibrissal Hairs after Facial Nerve Transection. Experimental Neurology. 178, 207-218 (2002).
- Skouras, E., Angelov, D. N. Experimental studies on post-transectional facial nerve regrowth and functional recovery of paralyzed muscles of the face in rats and mice. Anatomy (International Journal of Experimental and Clinical Anatomy). 4, 1-27 (2010).
- Xin, J., et al. IL-10 within the CNS is necessary for CD4+ T cells to mediate neuroprotection). Brain, Behavior, And Immunity. 25, 820-829 (2011).
- Mesnard, N. A., Sanders, V. M., Jones, K. J. Differential gene expression in the axotomized facial motor nucleus of presymptomatic SOD1 mice. The Journal of Comparative Neurology. 519, 3488-3506 (2011).
- Mesnard, N. A., Alexander, T. D., Sanders, V. M., Jones, K. J. Use of laser microdissection in the investigation of facial motoneuron and neuropil molecular phenotypes after peripheral axotomy. Experimental Neurology. 225, 94-103 (2010).
- Franchi, G. Changes in motor representation related to facial nerve damage and regeneration in adult rats. Experimental Brain Research. 135, 53-65 (2000).
- Munera, A., Cuestas, D. M., Troncoso, J. Peripheral facial nerve lesions induce changes in the firing properties of primary motor cortex layer 5 pyramidal cells. Neuroscience. 223, 140-151 (2012).
- Liu, L., et al. Hereditary absence of complement C5 in adult mice influences Wallerian degeneration, but not retrograde responses, following injury to peripheral nerve. Journal of the Peripheral Nervous System. 4, 123-133 (1999).
- Ferri, C., Moore, F., Bisby, M. Effects of facial nerve injury on mouse motoneurons lacking the p75 low-affinity neurotrophin receptor. Journal of Neurobiology. 34, 1-9 (1997).
- Zhou, R. Y., Xu, J., Chi, F. L., Chen, L. H., Li, S. T. Differences in sensitivity to rocuronium among orbicularis oris muscles innervated by normal or damaged facial nerves and gastrocnemius muscle innervated by somatic nerve in rats: combined morphological and functional analyses. The Laryngoscope. 122, 1831-1837 (2012).
- Jinno, S., Yamada, J. Using comparative anatomy in the axotomy model to identify distinct roles for microglia and astrocytes in synaptic stripping. Neuron Glia Biology. 7, 55-66 (2011).
- Jones, K. J., Serpe, C. J., Byram, S. C., Deboy, C. A., Sanders, V. M. Role of the immune system in the maintenance of mouse facial motoneuron viability after nerve injury. Brain, Behavior, And Immunity. 19, 12-19 (2005).
- Moran, L. B., Graeber, M. B. The facial nerve axotomy model. Brain research. Brain research. 44, 154-178 (2004).
- Council, N. R. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals: Eighth Edition. , The National Academies Press. New York, NY. (2011).
- Serpe, C. J., Kohm, A. P., Huppenbauer, C. B., Sanders, V., Jones, K. J. Exacerbation of Facial Motoneuron Loss after facial nerve transection in severe combined immunodeficient (scid) mice. Neuroscience. 19, (1999).
- Mesnard-Hoaglin, N. A., et al. SOD1(G93A) transgenic mouse CD4(+) T cells mediate neuroprotection after facial nerve axotomy when removed from a suppressive peripheral microenvironment. Brain, Behavior, And Immunity. 40, 55-60 (2014).
- Wang, H., et al. Establishment and assessment of the perinatal mouse facial nerve axotomy model via a subauricular incision approach. Experimental Biology And Medicine. 237, 1249-1255 (2012).
- Sharma, N., Moeller, C. W., Marzo, S. J., Jones, K. J., Foecking, E. M. Combinatorial treatments enhance recovery following facial nerve crush. The Laryngoscope. 120, 1523-1530 (2010).
- Lieberman, D. M., Jan, T. A., Ahmad, S. O., Most, S. P. Effects of corticosteroids on functional recovery and neuron survival after facial nerve injury in mice. Archives of Facial Plastic Surgery. 13, 117-124 (2011).
- Serpe, C. J., Coers, S., Sanders, V. M., Jones, K. J. CD4+ T, but not CD8+ or B, lymphocytes mediate facial motoneuron survival after facial nerve transection. Brain, Behavior, And Immunity. 17, 393-402 (2003).
- Haulcomb, M. M., et al. Axotomy-induced target disconnection promotes an additional death mechanism involved in motoneuron degeneration in ALS transgenic mice. The Journal of Comparative Neurology. , (2014).
- Bauder, A. R., Ferguson, T. A. Reproducible mouse sciatic nerve crush and subsequent assessment of regeneration by whole mount muscle analysis. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (60), (2012).
- Richner, M., Bjerrum, O. J., Nykjaer, A., Vaegter, C. B. The spared nerve injury (SNI) model of induced mechanical allodynia in mice. Journal of Visualized Experiments : JoVE. (54), (2011).
