Abstract
קרום החומוס chorioallantoic (רמ"א) מתחיל לפתח על ידי יום 7 לאחר הפריה ומתבגר ביום 12. CAM הוא באופן טבעי immunodeficient וכלי דם מאוד, מה שהופך את מערכת אידיאלית להשתלת גידול. יתר על כן, CAM מכיל חלבונים תאיים מטריצה כגון פיברונקטין, laminin, קולגן, אלפא integrin (נ) beta3, וMMP-2, מה שהופך את מודל אטרקטיבי ללמוד פלישת גידול וגרור. מדענים רבים ניצלו את הפיסיולוגיה של CAM על ידי שימוש בו כמודל של אנגיוגנזה. לאחרונה, assay CAM שונתה כדי לעבוד כמערכת in vivo xenograft מודל לסוגי סרטן שונים שמגשרת על הפער בין עבודה בסיסית במבחנה ודגמי סרטן בבעלי החיים מורכבים יותר. Assay CAM מאפשר לחקר צמיחת גידול, טיפולים אנטי-סרטניים, ומסלולים מולקולריים פרו-סרטניים במערכת רלוונטית מבחינה ביולוגית שהוא גם עלות וזמן יעיל. כאן, אנו מתארים את ההתפתחות של Xen CAMמודל ograft של קרצינומה hepatocellular (HCC) עם שיעורי הישרדות עובריים של עד 93% וגידול אמין לקחת מוביל לצמיחה של גידולים תלת-ממדיים, כלי דם.
Introduction
קרצינומה hepatocellular (HCC) הוא הגורם המוביל 3 בתמותה מהסרטן בעולם 1. כיום רק 30% מחולי HCC זכאים לטיפולים כירורגיים פוטנציאל מרפא 2, וכימותרפיה מערכתית אינה יעילה 3. לכן, יש צורך דחוף שלא סופקו קליני לטיפולי HCC רומן, והפיתוח של מערכות מודל מתאימות לבדיקות יעילים של סוכנים חדשים. Assay חומוס chorioallantoic קרום (CAM) מספק שיטה לשחזור, חסכונית, מהירה ובינונית תפוקה של בדיקת תרופות אנטי-סרטניים פוטנציאליות in vivo.
Assay CAM כבר נעשה שימוש נרחב ללמוד אנגיוגנזה 4. כמו כן פיתח בהצלחה למודל xenograft גידול של סרטן, כולל גליובלסטומה 5, סרטן לבלב 6, מלנומה 7-9, ואוסטאוסרקומה 10-11. שני באובו 12 ולשעבר אובו13 טכניקות כבר נוצלו בספרות, עם פרטים שונים מפרוטוקול לפרוטוקול. אחד אתגרים עיקריים למודל xenograft CAM הוא יחסית השכיחות הגבוהה של מוות עוברי לאחר המניפולציה של הביצה, עם שיעורי תמותה שפורסמו עובר אפרוח החל 25-50 אחוזים 11-14.
במאמר זה, אנו מתארים את הפיתוח של מודל באוב xenograft של HCC שמייצר באופן מהימן צמיחה של גידולים תלת-ממדיים, כלי דם שהיסטולוגית דומה HCC מובחן. יש לנו מותאם פרוטוקול שתואר לראשונה על ידי Ossowski et al. 14 והשיגו שיעורי הישרדות חומוס עוברי של עד 93% בקליטתם גידול גבוה מאוד.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
דגירה 1. ביצה
- להשיג ביצי 8 יום ישנים ספציפיות הפתוגן ללא embryonated.
- מניחים את הביצים במגש מסתובב ביצה, קצות חותמת יפנו כלפי מעלה, ומניח את המגש מסתובב בתוך חממת ביצה. דגירה ביצים במשך 48 שעות ב 36 מעלות צלזיוס ולחות של 50%.
2. הפלת CAM ופתיחת הביצים
- לאסוף ביצים מחממה. ביצי מקום במדף ביצה, חותמת הצד, ולהביא לזרימה למינרית.
- כבה את האורות בחדר ומכסה מנוע.
- החזק את הקצה חותם של ביצה קלה לקנדלר הביצה כדי לחשוף את כלי הדם של CAM, כמו גם את שק האוויר.
הערה: קנדלר הביצה הוא מקור אור המציג את העובר המתפתח וצק האוויר קשור וכלי הדם. - מציב סימן עיפרון בין שני כלי דם גדולים.
- להדליק את האורות ולהשתמש סיכה לדחוף סטרילי לעשות חור אחד בקצה הביצה מעל (סוף החותמת) שק האוויר וחור אחד בPEסימן ncil. לא לדחוף הסיכה לדחוף לאורך כל הדרך; חור בסביבות 3 מ"מ עמוק בדרך כלל יספיק.
- לכבות את האורות. לסחוט הנורה בטיחות, לחיצה על הקצה הפתוח בתקיפות נגד החור מעל שק האוויר. החל יניקה לשאוף אוויר אל תוך החור בסימן העיפרון, גורם CAM לרדת מהפגז בסימן העיפרון.
- בדוק שצק האוויר עבר מהקצה החותמת של הביצה לחור מסומן העיפרון באמצעות קנדלר. אם לא, השתמש בסיכת הדחיפה לעשות שני החורים מעט עמוקים יותר ולאחר מכן להירשם מחדש באמצעות שאיבת הנורה הבטיחות.
- הדלק את האור. מחזיק את הביצה ביד אחת, להפעיל את הכלי הסיבובי DREMEL עם חתך גלגל 15/16 אינץ 'המצורף ולעשות שני חתכים רוחביים רק עמוק מספיק כדי לחתוך דרך הקליפה אבל לא עמוק מספיק כדי לחתוך את כל הדרך עד לדיכאון CAM. להפוך את החתכים סביב 2 סנטימטר באורך 1 סנטימטר ומלבד אחד את השני. הפוך את הקיצוצים רחבים מספיק כך שטבעת סיליקון 1 סנטימטר קוטר יכול לעבור דרךאבל רזה יותר רוחב הסרט דביק לסטנדרטי.
- בשלב הבא, לעשות חתך אורכי 1 בין ובקצוות של שני חתכים רוחביים בקלילות הנגיעה הגלגל החתוך לקליפה.
- Slide מלקחיים סטריליות תחת חתיכת קליפה ובמקביל לקליפה. תפוס את חתיכת הקליפה עם המלקחיים ולהסיר את כל החתיכה נקיה.
- מניחים נייר דבק מעל החלון החדש שנפתח, והקפד לקפל קצה אחד מעל בעצמו על מנת להקל על ההסרה.
- ביצי מקום בחזרה בחממה במגש הביצה (לא במדפי הביצה מסתובבים) עד הזמן של חיסון.
3. הרכבת חיסון
- שמור תערובת חלבוני קרום במרתף, כגון Matrigel, על קרח (כדי למנוע פילמור) ומקום במכסת מנוע.
- השתמש 2 מ"מ EDTA לנתק תאים (4 - 5 מיליליטר לכל בקבוק T75) וצלוחיות מקום בתרבית רקמת חממה במשך 5 דקות.
- Resuspend התאים המנותק בתקשורת ולספור באמצעות hemocytometer וtrypan כחול. השתמש בין 500,000 to 2,000,000 תאים להשתלה על CAM, בהתאם לקו תא. לייעל את המספר הנכון בניסויים ראשוניים.
- מדד הנדרש למספר תא המתאים וצנטריפוגות ב XG 500 במשך 5 דקות נפח.
- בטל supernatant ואז resuspend תא גלולה ב 40 μ l של PBS ++ ו- 20 μ l של תערובת קרום במרתף.
הערה: בשלב זה, ניתן לטפל בתאים עם סמים או סוכני מבחן אחרים כנדרש לניסויים על ידי resuspending להשעית תערובת קרום תא / מרתף. לחלופין, ניתן pipetted סוכנים על ההשעיה תערובת קרום תא / מרתף לאחר השתלה. - אחזר מדף ביצה עם ביצים מן החממה והמקום בזרימה למינרית.
- קלטת לקלף את החלון, לשלוף טבעת סיליקון 1 מ"מ מהכובע של בקבוקון קריוגני באמצעות מלקחיים מעוקרים, ושחרר את הטבעת דרך החלון.
- mixtur Pipet פתרון תא l 60 μ של PBS ++ וקרום במרתףדואר ישירות למרכז זירת סיליקון נח על CAM.
- Re-קלטת החלון ולעבור מדף ביצה חזרה לחממה. בשלב זה, בזהירות בעת הזזת הביצים כטבעת והשעית התא יכול בקלות להיות שנעקר.
- לאפשר גידולים לגדול במשך 5 עד 7 ימים.
4. גידולי קציר
- מניחים מתחת לכרית במכסת מנוע. הכן 35 x 10 מ"מ צלחות ומכולות paraformaldehyde לפי צורך להיסטולוגיה. שים 1 מיליליטר PBS ++ בכל צלחת 35 מ"מ x 10.
- מניחים שקית Biohazard במכסת מנוע. קח מספריים לנתיחה סטרילית והכנס את הקצה המחודד לביצה בחור קרוב לסוף החותמת.
- חותך סביב כל הביצה longitudinally.
הערה: CAM והגידול עם הטבעת צריך לדבוק במחצית העליונה של הקליפה עם החלון. - בעזרת מספריים לנתיחה ומלקחיים, לנתח את הגידול מCAM ולמקם את הגידול בצלחת 35 מ"מ x 10. למדוד ולשקול גידולים. גידולים קבועים בparaformaldehyדה ולאחר מכן פרפין-להטביע אותם לשימוש בניסויי היסטולוגיה ואימונוהיסטוכימיה.
5. (אופציונאלי): דיסוציאציה תאים סרטניים
- השתמש במספריים לנתיחה כדי לרכך את הגידול בצלחת 35 מ"מ x 10. יוצקים גידול טחון לתוך צינור 15 מיליליטר צנטריפוגות ולהסיר כמה שיותר PBS ++ ככל האפשר באמצעות pipetting.
- הוסף 2 מיליליטר של collagenase (1 מ"ג / מיליליטר PBS ++), להפוך את הצינור על פני כמה פעמים, ודגירת צינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 30 דקות (עד כמה שעות).
- הוסף 5 מיליליטר תקשורת על צינור אחד וresuspend ביסודיות על ידי pipetting למעלה ולמטה 20 - 40X. pipetting היסודי הוא קריטי לתא דיסוציאציה מלאה.
- לאפשר משקעים להתיישב, ולהעביר את supernatant לצינור טרי. צנטריפוגה XG ב 500 במשך 5 דקות. הסר supernatant, משאיר מאחורי תא גלולה ניתק.
הערה: בשלב זה, כדורי תא יכולים לשמש לניסויים שונים (cytometry זרימה, תמוגה לשימוש בסופג מערבי, בידוד RNA, וכו '). ניתן להשיג ספירת תאי גידול כוללת באמצעות hemocytometer וצביעת trypan כחולה. שימו לב שתאים קטנים יותר, סגלגלים הם תאי עוף מCAM ולא צריך להיחשב כתאים סרטניים. לא צריך להיות מספר מינימאלי של זיהום תאים שאינם סרטניים (CAM) אם הגידול הוא גזור מCAM בזהירות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
תמונות נציג של שלבים עיקריים בפרוטוקול מוצגות כאן. איור 1 א מדגים את השימוש של קנדלר לדמיין את העובר המתפתח, שק האוויר, וכלי הדם של CAM. איור 1-1C להראות את התהליך של נשירת CAM על ידי ביצוע שני חורים ולאחר מכן הפעלת לחץ שלילי באמצעות הנורה הבטיחות, ו1D איור מראה ירד בהצלחה CAM עם בועת אוויר גדולה מתחת לחור מסומן העיפרון. איור 1E ואיור 1F להדגים את השימוש בכלי הסיבובי DREMEL לעשות דרוש קיצוצים בפגז מעל בועת האוויר והחלון נפתח במעטפת עם CAM כלי הדם החשוף בתוך.
גידולים תלת-ממדיים, כלי דם גדלו בהצלחה באמצעות שורות התאים האנושי HCC HUH7 (איור 2 א-2B) וPLC / PRF / 5 (איור 2 ג-2D). גידולים גדלו מ HUH7 וPLC / PRF / 5 תאים היי stologically דומה HCC מובחן (איור 2E-2F) וגם דומה 5 HUH7 וPLC / PRF / גידולים גדלו במודלי xenograft עכבר 15,16. יתר על כן, השימוש במשקל גידול קבל תוקף מדידה של גודל גידול על ידי הוכחה כי משקל גידול היה בקורלציה גבוהה עם ספירת תאי גידול כוללת המתקבלת לאחר ניתוק של גידולים באמצעות collagenase (איור 3) שלם.
שימוש בפרוטוקול זה, שיעורי הישרדות עובריים של עד 93% הושגו (טבלה 1). מופעי 1 הטבלה מצטברים נתונים משלושה ניסויי HCC נפרדים במודל xenograft CAM. מתוך סך כולל של 33 ביצים שמורכבים בהצלחה עם 500,000 תאים סרטניים (HUH7 או PLC / PRF5), רק 3 ביצים הסתיימו במוות עובר אפרוח, שיעור הישרדות כולל של 90.9%. יתר על כן, גידולים גדלו מאוד באופן מהימן לאחר 5 ימים, 100% (30/30) של ביצים עם עוברים ששרדו הייתה הצלחת היווצרות גידול.
ss = "jove_content" FO: לשמור-together.within עמודים = "תמיד"> 
איור 1. הפלת CAM ופתיחת חלון במעטפת. זיהוי של העובר (כחול חץ) וכלי דם (חץ שחור) באמצעות קנדלר, (ב) ביצוע חור במעטפת, (ג) היניקה יישום לחור באוויר Sac טבעי המתחוללים, (ד) חזותי () בועת האוויר מציג השמטת מוצלחת של CAM מהמעטפת, (E - F). פתיחת חלון במעטפת באמצעות Dremel רוטרי הכלי אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2. CAM תומך בצמיחה של שלושה ממדים, גידולי כלי דם שהיסטולוגית דומה HCC המובחן. (- B) גידול לאחר 5 ימים במודל CAM, תאי HUH7 (500,000 תאי זרע) (ברים בקנה מידה = 1 סנטימטר), (C - D) גידול לאחר 5 ימים במודל CAM, PLC / PRF / 5 תאים (500,000 תאים שנזרעו) (ברים בקנה מידה = 1 סנטימטר), (E-F) היסטולוגיה של HUH7 וPLC / PRF / 5 גידולים, בהתאמה (ברים בקנה מידה = 100 μ מ ') אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו .
מגרש איור 3. במשקל גידול לעומת ספירת תאים. משקל גידול הוא בקורלציה גבוהה עם ספירת תאי גידול כוללת לאחר collagenasניתוק דואר.
| מספר כולל של ביצים | אחוזים מביצים בהישרדות עובר אפרוח | שיעור הגידול לקחת בביצים עם עוברים ששרדו | |
| HUH7 | 27 | 92.6% (25/27) | 100% (25/25) |
| PLC / PRF / 5 | 6 | 83.3% (5/6) | 100% (5/5) |
| באופן כללי | 33 | 90.9% (30/33) | 100% (30/30) |
טבלה 1. שיעורי הישרדות עובריים ומחירים של גידול קחו בדגם CAM באמצעות שתי שורות תאי HCC האנושי.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
כמה שלבים עיקריים בפרוטוקול זה סביר ביותר להסביר את ההישרדות העוברית המשופרת, כמו גם אמינות מוגברת של צמיחת גידול. הפלת CAM מהפגז על ידי יישום יניקה לצק האוויר היא פחות פולשני יותר משיטות קיימות אחרות (באמצעות מחט כדי להסיר אלבומין מהביצה, לנתיחה בוטה, וכו '). באמצעות סיכה לדחוף סטרילי כדי ליצור שני חורים קטנים הנדרשים לשיטה זו הוא החלק המאתגר ביותר של הפרוטוקול. שימוש בכוח רב מדי עלולה לגרום נזק לכלי הדם וCAM דרך על-חדירה עם פין הדחיפה או אפילו יכול לגרום לפיצוח או להרוס את הביצה. ידיים על תרגול באמצעות סיכת דחיפה לעשות חורים קטנים בביצים שאינן מופרות, שקונים במכולת יכולה למזער טעויות שנעשו במהלך הניסיון הראשון בהפלת CAM. יתר על כן, השימוש באתנול או פתרונות חיטוי אחרים כדי לנקות את הקליפה יורד כדאיות עוברית, ויש להימנע. לבסוף, באמצעות טבעת סיליקון סטרילי אל &# 8220; מכלאה "התאים הסרטניים במקום אחד ספציפי לאחר זריעה מסייעת בצמיחת גידול ותורם לשיעור הגבוה של גידול לקחת ראו בפרוטוקול שלנו.
אופטימיזציה חלק משלבים קריטיים בפרוטוקול תהיה ככל הנראה תידרש בעת העבודה עם שורות תאים שונות ו / או תרופות. מספר תאים הציע לזריעה הוא בין 0.5 ו -2 מ', אבל כמה שורות תאים עשויות לדרוש צפיפות זריעה גבוהה יותר או נמוכה יותר כדי ליצור גידול נחמד, תלת-ממדי. השתלה מעט מדי תאים יכולה לגרום להיווצרות גידול עניה, ואילו השתלת תאים רבים מדי יכולה לגרום לצמיחת יתר של גידול שבו הגידול תופס את כל טבעת סיליקון, הופך תלת-ממדי שטוח ופחות מאידיאלי, ויכול לברוח הגבול של הטבעת . אנו ממליצים על הקמת ניסוי ראשוני כדי לקבוע את צפיפות זריעת תא האופטימלית עבור כל קו תא מסוים. יתר על כן, חלק מההתאמה לסטנדרט בריכוזי תרופת מבחנה ניתן לדרושד. אנחנו לחשב ריכוזי תרופה עם התייחסות להיקף הכולל שזורע על CAM (60 μl), אבל לפעמים ריכוזי תרופה "גבוהים" יותר מאלו המשמשים בניסויים מקבילים במבחנה נדרשים על מנת לראות השפעות על צמיחת גידול, ככל הנראה בשל ספיגה דרך CAM והפיזור של תרופה לשאר הביצה.
לאחר אופטימיזציה מוצלחת של הפרוטוקול לשורות תאים ספציפיות ותרופות, מודל xenograft CAM יכול לשמש כדי לחקור מגוון רחב של נכסי גידול ומנגנונים תאיים. גידול ניתן להעריך באמצעות משקל ומדידות גודל כמו גם סך ספירת תאי גידול. יכולים להיות קבועים וגידולים נתון אימונוהיסטוכימיה להכתים לסמני סרטן או חלבונים ספציפיים של עניין. אנגיוגנזה ניתן להעריך על ידי מכתים לSNA1, שדווקא כתמי תאי האנדותל אפרוח 17. תאי גידול יכולים להיות lysed לחקירה של מסלולים מולקולריים. כשלב ביניים בגישור טהור בעבודת מבחנה עם מודלים מורכבים יותר של הסרטן כגון מודלים של בעלי החיים orthotopic, מודל xenograft CAM היא דרך חסכונית להשגת במהירות נתונים בהגדרה שהיא יותר מבחינה ביולוגית רלוונטי מאשר תאים שגודלו בתרבית.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Premium incubated eggs | Charles River | N/A | http://www.criver.com/files/pdfs/avian/av_c_spf_egg_price_list.aspx |
| Egg incubators | GQF | Hova-Bator 2362N | |
| Rotating egg trays | GQF | 1611 Automatic Egg Turner | |
| Egg candler | Lyon | Hi-Power 950-070 | |
| Dremel 100 rotary tool with 15/16 cut-off wheel | Dremel | 100-N/7 | |
| Sterile forceps, push pin, dissection scissors, Scotch tape | |||
| Matrigel | BD Biosciences | 356234 | |
| Cryogenic vials, external thread with silicone washer | Corning | 430659 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum | Sigma | C9891 |
References
- Sangiovanni, A., et al. Increased survival of cirrhotic patients with a hepatocellular carcinoma detected during surveillance. Gastroenterology. 126 (4), 1005-1014 (2004).
- Lopez, P. M., Villanueva, A., Llovet, J. M. Systematic review: evidence-based management of hepatocellular carcinoma--an updated analysis of randomized controlled trials. Aliment Pharmacol Ther. 23 (11), 1535-1547 (2006).
- Llovet, J. M., Burroughs, A., Bruix, J. Hepatocellular carcinoma. Lancet. 362 (9399), 1907-1917 (2003).
- Folkman, J. What is the evidence that tumors are angiogenesis dependent. J Natl Cancer Inst. 82, 4-6 (1990).
- Hagedorn, M., et al. Accessing key steps of human tumor progression in vivo by using an avian embryo model. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (5), 1643-1648 (2005).
- Dumartin, L., et al. Netrin-1 mediates early events in pancreatic adenocarcinoma progression, acting on tumor and endothelial cells. Gastroenterology. 138 (4), 1595-1606 (2010).
- Aguirre-Ghiso, J. A., Estrada, Y., Liu, D., Ossowski, L. ERK(MAPK) activity as a determinant of tumor growth and dormancy; regulation by p38(SAPK). Cancer Res. 63 (7), 1684-1695 (2003).
- Baroni, T. E., et al. Ribonomic and short hairpin RNA gene silencing methods to explore functional gene programs associated with tumor growth arrest. Methods Mol Biol. 383, 227-244 (2007).
- Lopez-Rivera, E., et al. Inducible nitric oxide synthase drives mTOR pathway activation and proliferation of human melanoma by reversible nitrosylation of TSC2. Cancer Res. 74 (4), 1067-1078 (2014).
- Balke, M., et al. A short-term in vivo model for giant cell tumor of bone. BMC Cancer. 11, 241 (2011).
- Balke, M., et al. Morphologic characterization of osteosarcoma growth on the chick chorioallantoic membrane. BMC Res Notes. 3, 58 (2010).
- Sys, G. M., et al. The in ovo CAM-assay as a xenograft model for sarcoma. J Vis Exp. (77), e50522 (2013).
- Dohle, D. S., et al. Chick ex ovo culture and ex ovo CAM assay: how it really works. J Vis Exp. (33), (2009).
- Ossowski, L., Reich, E. Experimental model for quantitative study of metastasis. Cancer Res. 40 (7), 2300-2309 (1980).
- Ghanekar, A., Ahmed, S., Chen, K., Adeyi, O. Endothelial cells do not arise from tumor-initiating cells in human hepatocellular carcinoma. BMC Cancer. 13, 485 (2013).
- Ho, J. W., et al. Effects of a novel immunomodulating agent, FTY720, on tumor growth and angiogenesis in hepatocellular carcinoma. Mol Cancer Ther. 4 (9), 1430-1438 (2005).
- Hagedorn, M., et al. VEGF coordinates interaction of pericytes and endothelial cells during vasculogenesis and experimental angiogenesis. Dev Dyn. 230 (1), 23-33 (2004).
