Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Dyrkning af Published: April 6, 2015 doi: 10.3791/52412
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1, 1, 1, 1
1Institute of Immunology and Infection Research, University of Edinburgh, 2Manchester Collaborative Centre for Inflammation Research

Summary

Heligmosomoides polygyrus er en muse nematode med magtfulde immunmodulerende kapaciteter, som svarer bedre til dem af meget udbredt menneskelig helminth-infektion. Her beskriver vi en protokol til vedligeholdelse af H. langsigtet polygyrus livscyklus.

Abstract

Heligmosomoides polygyrus (tidligere kendt som Nematospiroides dubius, og også nævnt af nogle som H. Bakeri) er en gastrointestinal helminth, der beskæftiger flere immunmodulerende mekanismer til at etablere kronisk infektion i mus og ligner fremherskende humane helminthinfektioner. H. polygyrus blevet omfattende undersøgt med hensyn til helminth-afledte immune regulering og er blevet fundet at kraftigt undertrykke eksperimentelle modeller af allergi og autoimmunitet (begge med aktiv infektion og isolerede udskilte produkter). Beskrevet i dette papir protokol beskriver styring af H. polygyrus livscyklus for ensartet produktion af L3 larver, genvinding af voksne parasitter, og indsamling af deres ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter (HES).

Introduction

Heligmosomoides polygyrus er en naturlig murine gastrointestinal helminth der er nært beslægtet med højt fremherskende humane nematode parasitter 1. I modsætning til andre nematoder modeller som Nippostrongylus brasiliensis, H. polygyrus konsekvent etablerer kronisk infektion i mus som et direkte resultat af flere magtfulde immunmodulerende mekanismer den beskæftiger at undertrykke værtens immunrespons 2.

H. polygyrus har en direkte livscyklus: infektiøse L3 larver indtages af FeCO-oral transmission (eller administreres af oral sonde i indstillingen laboratorium), hvorefter de vandrer til subserosal lag af duodenum og encyst før han vendte tilbage til tarmlumen som voksne orme cirka otte dage efter indledende infektion. Parring og ægproduktion sker ved dag 10, og det er muligt at høste voksne orme for kultur og indsamling af ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter fra day 14 og fremefter 3. H. polygyrus også interagerer med kommensal mikroflora, med øget Lactobacilli stede i inficerede modtagelige mus 4-6 og øgede niveauer af H. polygyrus infektion efter eksponering af mus til Lactobacilli 6.

Aktiv infektion med H. polygyrus har vist sig at beskytte mod immunpatologi i mange dyremodeller for autoimmunitet 7-10, colitis 11,12 og allergi 13-16. Der har derfor været stor interesse for mulighederne i Ekskretionsorganerne-Sekretoriske molekyler fra denne parasit ("HES") til ned-modulere patologi in vivo 17,18. Faktisk er beskyttende virkninger ses efter behandling af mus med HES-produkter 19 gennem veje som nu identificeret 18,20. Her beskriver vi en protokol for pålidelig produktion af Heligmosomoides polygyrus og inddrivelse af sine udskilte produkterder kan yderligere anvendes til en række af funktionelle biokemiske og immunologiske undersøgelser.

Protocol

BEMÆRK: Alle procedurer denne protokol udføres i overensstemmelse med retningslinjerne fra Det Forenede Kongeriges indenrigsministerium og University of Edinburgh Veterinary Services.

1. Infektion af mus med sonde

  1. Store Heligmosomoides polygyrus L3 larver i destilleret vand i op til seks måneder ved 4 ° C.
  2. Før brug, vask L3 larver tre gange i destilleret vand: centrifugeres ved 300 xg i 10 min (med bremse), fjerne alle men 500 pi vand (for at undgå forstyrrende pelleteret L3 larver), og pellet resuspenderes hver gang.
  3. For den tredje vask, tilsæt vand til en nøjagtig mængde (typisk 40 ml) og aspireres 20 pi med 200 pi tip cut udvide dens åbning. Placer to 20 pi prøver på overfladen af ​​en 60 mm dyrkningsskål og tælle L3 larver (normalt mobil, og ses bedst under 50X forstørrelse med et dissektionsmikroskop). Resuspender den endelige pellet i destilleret vand til en concentration på 2.000 L3 larver pr ml.
  4. For livscyklus produktion, inficere 8 uger gamle F1 (C57BL / 6xCBA) mus med 400 H. polygyrus L3 larver i 200 pi destilleret vand ved oral gavage (begrænse mus i opretstående stilling ved nakken og forsigtigt passere stump sonde nål gennem munden og spiserøret ind i maven). Omrør grundigt før hver infektion (larver afregne hurtigt i vand) og aspireres 200 pi i en 1 ml sprøjte; bruge en dedikeret gavagenål med en afrundet ende. For eksperimentel infektion af yngre mus (6-8 uger gamle), eller andre indavlede stammer (f.eks C57BL / 6 eller BalbC), inficere mus med 200 L3 larver.

2. Formering og Vedligeholdelse af H. polygyrus

  1. Placer trækul i midten af ​​en stor plastik badekar og tillade koldt ledningsvand til at køre over det i mindst 30 min (uvaskede aktivt kul er toksisk for L3 larver). Dræn vandet fra karret og sæt kul på two lag af absorberende papir, der forlader det udsættes for rumluft indtil helt tør.
  2. Hvis æg er nødvendige, skrabe fæces først ud af tyktarmen med pincet (og sakse hvis nødvendigt). Hvis et stort antal L3 larver er nødvendig, anbringes musene på et trådgitter og indsamle fækalpellets over flere dage.
  3. Bland fæces med granuleret kul i et forhold på mindst 1: 1, for at opnå en konsistens bare fugtig nok til at klæbe til filterpapir. Smør et tyndt lag på midten af ​​nogle afdæmpede filterpapir i en petriskål og placere denne i et fugtigt kasse (tilføje nogle fugtigt køkkenrulle og en skål af vand) i mørke i 12-14 dage.
  4. Fjern L3 larver fra dag 7 og frem, og samle dem på mindst to gange, inden papiret kasseres. Larverne danner en ring omkring kanten af ​​filteret papir; løfte filtrerpapiret ud af petriskålen og skyl larver, der er tilbage af pladen (ved hjælp af en pipette og 5 ml sterilt vand pr plade) i et 50 ml rør.
  5. Liftoff filtrerpapiret og høste de resterende larver tilbage på pladen med destilleret vand i et 50 ml rør. Centrifugeres spildevandet opløsning ved 300 xg i 10 min. Vask larverne tre gange med destilleret vand og derefter opbevares ved 4 ° C i op til 50 ml destilleret vand, indtil behov.
    BEMÆRK: Larver forbliver levedygtige og smitsomme i mindst 6 måneder.

3. Indsamling af Adult H. polygyrus Worms

  1. Forbered modificerede Baermann Apparat på forhånd som vist i figur 1.
  2. Cull mus Fjorten dage efter infektion.
  3. Vask maven med 70% ethanol. Skær huden over maven og trække sig tilbage for at afsløre maveskindet. Gør midtlinieincision at indtaste bughulen.
  4. Fjern hele tynd- og tyktarmen (fra proksimale duodenum til den distale rektum). Placer i en tør petriskål.
  5. Ret tarmen langs hele sin længde; udskære fæces indeholdende kolon; placere denne i en separat skål for æg præparater senere.
  6. Udskære proksimale 20 cm af tyndtarmen, der indeholder de voksne orme -identified af forholdsvis tyk væg af duodenum og ofte en rød udseende på grund af intra-luminale orme. Anbringes i et (100 mm i diameter) petriskål med 5 ml Hanks opløsning, opvarmet til 37 ° C (to prøver pr skål).
  7. Åbn ormen fyldt proksimale gut portion på langs med en saks (runde ender saks er bedst til dette), og skrab ned indersiden af ​​tarmen foring med to glasplader til at fjerne orme. Derefter kasseres ren tarmvæggen.
  8. Tip orme i små musselin poser, hæfte lukket og sikkert med papirclips omkring kanten af tragten glasset (figur 1).
  9. Fyld tragt med Hanks Solution og tilsæt ca. 4 petriskåle af orme i hver tragt.
  10. Placer apparatet i 37 ° C inkubator i 1-2 timer, forsigtigt omrøring halvvejs igennem for at fjernerester fra tarmen præparat, der kan okkludere musselin filter. Sørg for at undgå spild af vragdele uden for musselin taske - dette vil medføre forurening af den endelige HES forberedelse. Voksne orme skulle langsomt migreret gennem musselin klud og afregnes i bunden af ​​glasset reagensglas. Frigør forsigtigt reagensglasset fra den forbindende gummislange over vasken (Pas på ikke at miste orme på dette tidspunkt).
  11. Ved hjælp af en plastik pipette ormene i et 50 ml rør og vask seks gange med Hanks Solution (tillade orme nøjes med tyngdekraften, fjerne medier med en stripette, tilsættes 40 ml Hanks opløsning og gentag fem gange).
    BEMÆRK: orm kultur skal holdes sterilt fra dette punkt og fremefter.
    1. Flyt til en laminær strømning og vaskes yderligere seks gange i steril Hanks 'opløsning suppleret med 100 U / ml penicillin og 100 pg / ml streptomycin, klar til in vitro kultur.
  12. Tælvoksne orme inddrevet ved at tage to prøver af 20 pi taget op med en gul spids snit til at udvide sin blænde; forvente ca. 50% af den mængde af inokuleret larver.

4. Opsætning af kulturer til HES: Medium Forberedelse, vask voksne orme

  1. Soak orme fra 3,11 i ca. 10 ml RPMI suppleret med 10% Gentamycin i 20 minutter, hvorefter røret hviler i en vinkel for at sikre, orme er fuldt dækket.
  2. Udfør dette i en laminær strømning: Vask igen seks gange med Hanks 'opløsning (suppleret med 5 U / ml penicillin og 5 ug / ml streptomycin).
  3. Forbered H. polygrus medier.
  4. Fastholdelse sterilitet i en laminær strømning, til 500 ml RPMI1640, tilsættes 11,1 ml af 45% glucose (slutkoncentration 1,2% RPMI1640 indeholder 0,2% glucose), 5 ml 100x Peniclllin-streptomycin (slutkoncentration 5 U / ml penicillin, 5 ug / ml streptomycin), 5 ml L-glutamin (slutkoncentration 2 mM), og5 ml gentamycin (slutkoncentration 1%). Tilføj ikke FCS.
  5. Alikvote orme i ventilerede T25 kolber ca. 1.000 orme i 15 ml H. polygyrus medier pr kolbe og sted oprejst i 37 ° C inkubator (5% CO2) i 3 uger.

5. Fremstilling af HES

  1. Saml HES-holdige dyrkningsmedier fra kulturer med intervaller på højst to gange om ugen, en ophævelse af den første kollektion efter 24 timer af kultur (på grund af høje niveauer af LPS forurening og værtsproteiner - kan behandles hver for sig eller kasseret). Hold hver kollektion adskilt og tydeligt mærket med dato og batchnummer. Erstat med et lige volumen af H. polygyrus medier hver gang.
  2. Centrifuge HES-holdige medier ved 400 x g i 5 minutter. Derefter Filtersteriliser gennem 0,2 um lav proteinbindende filtre i 50 ml rør. Opbevares i -20 ° C fryser tydeligt mærket med dato for orm høst og dato for HES collection.
  3. Efter 21 dage HES kollektion fra kultur, kassere orme.
  4. Pool 500-1.000 ml HES supernatant (normalt fra frossen lager, og ikke inklusive den første 24 timers samling) og koncentrere over en 3.000 MWCO filter i ultrafiltreringsindretningen under nitrogen pres.
    BEMÆRK: Vær meget forsigtig med ikke at lade filteret køre tør.
    1. For at opsætte filteret enheden først vaske 3 kDa membran blanke side nedad i en 1 liters bæger med destilleret vand i 3 x 20 min under omrøring. Saml ultrafiltreringsindretningen ifølge producentens anvisninger med filtermembran skinnende opad. Anbring i skab ved 4 ° C og videregive 50 ml destilleret vand igennem, før du begynder at koncentrere puljede HES.
    2. Tilføj hvert rør af HES til filtrering enhed efter behov (100-140 ml pr dag), indtil lydstyrken er koncentreret ned til 2-5 ml.
  5. For at fjerne kontaminanter fra HES-holdige dyrkningsmedier, tilsættes 50 ml pyrogen-fri PBS til filtrering enheden og derefter koncentreres til ca. 2 ml. Gentag dette trin to gange (150 ml PBS i alt). Overførsel HES i et 15 ml rør, Filtersteriliser (med et 0,2 um filter) i en laminær strømning og måle proteinkoncentrationen ved hjælp af et spektrofotometer (E 280 = 10) eller ved Bradford assay.
  6. Alikvot, label med batchnummer og dato, og fryse ved -80 ° C.
  7. Udfør en chromogen LAL assay ifølge producentens protokoller for hvert parti af HES før brug. Hvis LPS niveauer er større end 1 U LPS per 1 ug protein, overveje ikke at bruge denne batch til in vivo eksperimenter eller in vitro kulturer.
  8. Behandle HES indsamlet på 24 timer hver på samme måde; den vil indeholde LPS og nogle værtsproteiner, og samtidig ikke egnet til funktionelle eksperimenter, er det en nyttig kilde til de enkelte molekyler, der kan isoleres ved monoklonalt antistof affinitetsoprensning.

Representative Results

Modtagelighed for infektion med H. polygyrus styres i høj grad af den genetiske baggrund af muse-stamme (Tabel 1); C57BL / 6 og CBA-mus er meget modtagelige 21,22. Til vedligeholdelse af parasitten livscyklus, har F1 hybrid mellem disse to stammer valgt for sin evne til at modstå meget højere ormen byrder uden morbiditet (overdreven intestinal epitelbeskadigelse) sammenlignet med enten parentale stamme. Oral sondeernæring på 400 L3 larver anvendes til at opretholde livscyklus i F1-mus (resulterende i voksne orm byrder vist i figur 2), mens en dosis på 200 L3 larver anvendes generelt til eksperimenter i homozygote indavlede stammer (f.eks C57BL / 6 eller Balbc-). Men måske har brug for denne dosis, reduceres afhængigt af miljømæssige co-faktorer, der kan variere fra dyr faciliteter, såsom variationer i tarmfloraen.

Partier af HES har vist reproducerbar Efficacy i funktionelle assays og i proteinsammensætning; Desuden, når supernatanter fra hver successiv uge kultur blev analyseret, op til i alt 4 uger blev proteinprofiler fundet at være meget ens (figur 3). Når HES koncentrationen måles med Bradford-assay (se 5.5), den samlede protein er sædvanligvis ca. 1 mg / ml (figur 4).

En alternativ fremgangsmåde til at koncentrere HES er med en centrifugal-koncentrator (f.eks VIVASPIN 3 kDa cut-off membran), hvor prøverne centrifugeret ved op til 4000 g i et udsvingsrotor centrifuge, fjernelse buffersalte og lavmolekylære bestanddele. Centrifugal koncentration er bedst egnet til små behandling mængder (1-10 ml) og er begrænset til en maksimal koncentration faktor på ca. 30x.

Ved afhentning HES, hindring af kontaminering er kritisk. For at undgå forurening med værten molekyler, vi kassere HES-containing dyrkningsmedier fra de første 24 timer efter voksne orm høst fra musen tarmen. Vi kvantificere også niveauet af LPS forurening i hver batch af HES med en Chromogenic LAL-assay (se 5.7). 1 U af LPS svarer til ~ 100 pg LPS og niveauer under dette betragtes ubetydelige 23. I vores hænder, de fleste partier af HES er væsentligt under denne grænse, var den gennemsnitlige koncentration af LPS i HES er 0,23 U / ug (figur 5). Virkningerne af LPS i in vivo modeller for patologi (fx undertrykkelse af astmatiske reaktioner) kræver mindst 10 ng LPS 23. Derfor in vivo administration af 5 mg HES fra et parti med 100 pg LPS / ug HES vil omfatte 500 pg LPS, et godt stykke under den effektive koncentration, hvor LPS bliver et problem.

Figur 1
Figur 1: Baermann Apparat Baermann Apparatur setup for indsamling af voksne H. polygyrus (som beskrevet i afsnit 2).

Figur 2
Figur 2: Middel Worm Burden 14 dage efter infektion med 400 L3 Larver Mean orm byrder 14 dage efter infektion med 400 L3 larver. Datapunkter vises er fra 19 forskellige runder af infektion af C57BL / 6xCBA mus. Middelværdi ± SEM er vist.

Figur 3
Figur 3: Protein Profiler af HES fra efterfølgende uger i Kultur SDS-PAGE profil HES proteiner indsamlet i successive ugers dyrkning.

Figur 4
Figur 4: sidste mængde HES fra 500 ml ES-holdige medier Udbytte af HES protein fra 11 forskellige batches afledt fra ca. 500 ml kultursupernatant. Middelværdi ± SEM er vist.

Figur 5
Figur 5: LPS Forurening af HES Niveauer af LPS forurening i 41 partier af HES målt ved Limulus ameobocyte assay. Median LPS koncentration = 86 U pr mg HES.

Figur 6
Figur 6: Animated Skematisk af H. polygyrus Life Cycle Resumé af de vigtigste stadier i livscyklussen fra oral sonde af L3 larver gennem Påvisning af larver og voksne orme til isolering af HES.


Figur 7: Animated Skematisk af HES og dens funktioner Vigtige immunmodulerende virkninger af opløselige mediatorer og exosomer indeholdt i HES.

Genotype (og baggrund stamme) Primær infektion Fænotype Reference
Indavlede stammer
A / J, CBA, C3H Meget modtagelige 22,29
C57BL / 6 og C57BL / 10 Modtagelige 22,30
BALB / c, DBA / 2, 129 / J Intermediate 22,31
NIH, SJL, SWR Lav modtagelighed 22,32
Transgene for cytokiner eller cytokinreceptorer
IL-1β - / - Mere modtagelige 33
IL-1R - / - Mindre modtagelige (a); ingen ændring i følsomhed, men steg granulomer (b) (A) 33
(B) 34
IL-2Rβ Transgene (C57BL / 6) Resistent 35
IL-4 - / - Højere frugtbarhed 36
IL-4R - / - (C57BL / 6 eller BALB / c) Meget modtagelige 22
IL-6 - / - (BALB / c eller C57BL / 6) Meget resistent 37
IL-9 Transgene(FVB) Resistent 38
IL-21R - / - (C57BL / 6) Mangelfulde Th2, nedsat granuloma gormation 39,40
IL-25 - / - (BALB / c) Mere modtagelige 33
IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / c) Ingen ændring i følsomhed 33
TGFβRIIdn (C57BL / 6) High Th1, øget modtagelighed 41,42
Transgene for T-celle-markører
CD28 - / - (BALB / c) Marginalt højere frugtbarhed 43
CD86 (B7-2) - / - (BALB / c) Højere frugtbarhed 44
OX40L - / - (BALB / c) Højere frugtbarhed &# 160; 45
Transgene for medfødte immunsystem loci
Type 1 interferon receptor (IFNAR) - / - (C57BL / 6) Højere frugtbarhed, flere granulomer 34
MyD88 - / - (C57BL / 6) Mere modstandsdygtige, mere granulomer 34
C-KitW / Wv (WBB6) Mere modtagelige 46,47

Tabel 1: Primære infektioner med H. polygyrus i genetisk forskellige og gen-målrettet musestammer.

Discussion

Livscyklus H. polygyrus provenuet i et pålideligt konsekvent. Efter naturlig indtagelse eller oral sonde af L3 larver på dag 0, cyster begynder at danne under duodenal serosa ved dag 5, udvikler sig til larver fælder og så fremstår som voksne orme i tarmen lumen fra dag 10, kan æg ses i afføring fra dag 14 og granulomer er synlige på den duodenale serøse overflade fra dag 21. Den ovenfor beskrevne (og opsummeret i figur 6) protokol giver mulighed for high-throughput produktion af H. polygyrus ekskretionsorganerne-sekretoriske produkter (HES), foruden pålidelig inddrivelse af levedygtige L3 larver for fremtidige forsøg og livscyklus infektioner.

H. polygyrus infektion har vist sig at være beskyttende i modeller for astma afhængige OVA eller Der p 1 (husstøvmideallergen) 14. Endvidere kunne undertrykkelse af luftvejsinflammation overføres med CD4 + CD25 + 14 eller CD19 + CD23 hi regulatoriske B-celler 24 fra ikke-lysfølsomme, H. polygyrus inficerede mus. I modeller af autoimmunitet, H. polygyrus infektion har vist sig at være undertrykkende i eksperimentel autoimmun encephalomyelitis (EAE) model for dissemineret sklerose 9 og undertrykkelse kan overføres med enten CD4 + T-celler eller CD19 + B-celler fra inficerede mus 24.

Heligmosomoides polygyrus udskillelsesvej-sekretorisk produkter (HES) modulere værtens immunrespons og undertrykke Th2-medieret inflammation af en række mekanismer (beskrevet i figur 7), herunder: a) Inhibering af dendritisk celle respons på stimulering 25, b) induktion af CD4 + Foxp3 + regulatoriske T-celler 18. og c) blokade af IL-33 produktion 20. HES har vist sig at være beskyttende, når de indgives ent sensibilisering eller udfordring i OVA-alun astmamodel 19 og også, når det indgives intranasalt med Alternaria ekstrakt allergen 20 gennem suppression af tidlig IL-33 release. Undgåelse af LPS forurening af HES er ofte afgørende for succes i fremtidige immunologiske eksperimenter. I protokollen beskrevet her, de kritiske trin i at opnå dette er at sikre, at affald indeholdt i musselin sække af Baermann apparatet ikke komme ind i sidste HES forberedelse (se 2.10), og at afsætte ES løsning fra de første 24 timer af kultur (se 5.1).

I de seneste år har HES blevet grundigt karakteriseret ved proteomisk niveau med over 370 forskellige proteiner identificeret 26,27. Desuden har ES fra 4. stadie larver blevet underkastet proteomanalyse 28. Igangværende arbejde omfatter karakterisering af store glycan komponenter HES, der vides at være stærkt immunogene 3 og udskilles mikro-RNDa der er indkapslet i 50-100 nm vesikler eller exosomer (Buck et al., Der er indsendt til publikation). Med etableringen af reproducerbare protokoller for indsamling af ES fra denne meget immunmodulerende parasit, og med omfattende proteomiske data, der identificerer de molekylære komponenter i HES, er scenen nu indstillet til identifikation og terapeutiske test af individuelle molekyler fra H. polygyrus der kan mediere vigtige virkninger på værtens immunsystem.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon concentrator Millipore 5112 Model 8050 50 ml
http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM
_NF-5122
Hanks’ buffered salt solution Sigma H9394 500 ml
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&region=GB
Penicillin streptomycin Invitrogen 15070-063 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063
L-glutamine Invitrogen 25030-081 200 MM 100ml
https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081
Activated charcoal Merck 1.09624.0500 18-35 mesh
http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624
Glucose solution Sigma G8769 100 ml 45% solution
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&region=GB
Falcon tubes Sarstedt 62.547.254 50 ml
http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon
T25 Flasks Sigma CLS430639  25cm vented flask
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&region=GB
Chromogenic LAL assay Lonza 50-647U QCL-1000 assay
http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx
Gentamicin Gibco 15710-049 100 ml
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 Gibco 11875093 500 ml; without L-glutamine
http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Monroy, F. G., Enriquez, F. J. Heligmosomoides polygyrus : a model for chronic gastrointestinal helminthiasis. Parasitol. Today. 8, 49-54 (1992).
  2. Maizels, R. M., et al. Immune modulation and modulators in Heligmosomoides polygyrus infection. Exp. Parasitol. 132, 76-89 (2012).
  3. Hewitson, J. P., et al. Heligmosomoides polygyrus elicits a dominant nonprotective antibody response directed at restricted glycan and peptide epitopes. J Immunol. 187, 4764-4777 (2011).
  4. Walk, S. T., Blum, A. M., Ewing, S. A., Weinstock, J. V., Young, V. B. Alteration of the murine gut microbiota during infection with the parasitic helminth Heligmosomoides polygyrus. Inflamm Bowel Dis. 16, 1841-1849 (2010).
  5. Rausch, S., et al. Small intestinal nematode infection of mice Is associated with increased enterobacterial loads alongside the intestinal tract. PLoS ONE. 8, e74026 (2013).
  6. Reynolds, L. A., et al. Commensal-pathogen interactions in the intestinal tract: Lactobacilli promote infection with, and are promoted by, helminth parasites. Gut Microbes. 5, 10-19 (2014).
  7. Saunders, K. A., Raine, T., Cooke, A., Lawrence, C. E. Inhibition of autoimmune type 1 diabetes by gastrointestinal helminth infection. Infect Immun. 75, 397-407 (2007).
  8. Liu, Q., et al. Helminth infection can reduce insulitis and type 1 diabetes through CD25- and IL-10-independent mechanisms. Infect Immun. 77, 5347-5358 (2009).
  9. Donskow-Łysoniewska, K., Krawczak, K., Doligalska, M. Heligmosomoides polygyrus: EAE remission is correlated with different systemic cytokine profiles provoked by L4 and adult nematodes. Exp Parasitol. 132, 243-248 (2012).
  10. Mishra, P. K., Patel, N., Wu, W., Bleich, D., Gause, W. C. Prevention of type 1 diabetes through infection with an intestinal nematode parasite requires IL-10 in the absence of a Th2-type response. Mucosal Immunol. 6, 297-308 (2013).
  11. Sutton, T. L., et al. Anti-Inflammatory mechanisms of enteric Heligmosomoides polygyrus infection against trinitrobenzene sulfonic acid-induced colitis in a murine model. Infect Immun. 76, 4772-4782 (2008).
  12. Hang, L., et al. Heligmosomoides polygyrus bakeri infection activates colonic Foxp3+ T cells enhancing their capacity to prevent colitis. J Immunol. 191, 1927-1934 (2013).
  13. Bashir, M. E., Andersen, P., Fuss, I. J., Shi, H. N., Nagler-Anderson, C. An enteric helminth infection protects against an allergic response to dietary antigen. J Immunol. 169, 3284-3292 (2002).
  14. Wilson, M. S., et al. Suppression of allergic airway inflammation by helminth-induced regulatory T cells. J. Exp. Med. 202, 1199-1212 (2005).
  15. Kitagaki, K., et al. Intestinal helminths protect in a murine model of asthma. J Immunol. 177, 1628-1635 (2006).
  16. Hartmann, S., et al. Gastrointestinal nematode infection interferes with experimental allergic airway inflammation but not atopic dermatitis. Clin Exp Allergy. 39, 1585-1596 (2009).
  17. Pritchard, D. I., Lawrence, C. E., Appleby, P., Gibb, I. A., Glover, K. Immunosuppressive proteins secreted by the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. Int. J. Parasitol. 24, 495-500 (1994).
  18. Grainger, J. R., et al. Helminth secretions induce de novo T cell Foxp3 expression and regulatory function through the TGF-β pathway. J Exp Med. 207, 2331-2341 (2010).
  19. McSorley, H. J., et al. Suppression of type 2 immunity and allergic airway inflammation by secreted products of the helminth Heligmosomoides polygyrus. Eur. J. Immunol. 42, 2667-2682 (2012).
  20. McSorley, H. J., Blair, N. F., Smith, K. A., McKenzie, A. N. J., Maizels, R. M. Blockade of IL-33 release and suppression of type 2 innate lymphoid cell responses by helminth secreted products in airway allergy. Mucosal Immunol. 7, 1068-1078 (2014).
  21. Behnke, J. M., Menge, D. M., Noyes, H. Heligmosomoides bakeri: a model for exploring the biology and genetics of restance to chronic gastrointestinal nematode infections. Parasitology. 136, 1565-1580 (2009).
  22. Filbey, K. J., et al. Innate and adaptive type 2 immune cell responses in genetically controlled resistance to intestinal helminth infection. Immunology and Cell Biology. 92, 436-448 (2014).
  23. Bortolatto, J., et al. Toll-like receptor 4 agonists adsorbed to aluminium hydroxide adjuvant attenuate ovalbumin-specific allergic airway disease: role of MyD88 adaptor molecule and interleukin-12/interferon-gamma axis. Clin Exp Allergy. 38, 1668-1679 (2008).
  24. Wilson, M. S., et al. Helminth-induced CD19+CD23hi B cells modulate experimental allergic and autoimmune inflammation. Eur J Immunol. 40, 1682-1696 (2010).
  25. Segura, M., Su, Z., Piccirillo, C., Stevenson, M. M. Impairment of dendritic cell function by excretory-secretory products: A potential mechanism for nematode-induced immunosuppression. Eur J Immunol. 37, 1887-1904 (2007).
  26. Hewitson, J. P., et al. Proteomic analysis of secretory products from the model gastrointestinal nematode Heligmosomoides polygyrus reveals dominance of Venom Allergen-Like (VAL) proteins. J Proteomics. 74, 1573-1594 (2011).
  27. Moreno, Y., et al. Proteomic analysis of excretory-secretory products of Heligmosomoides polygyrus assessed with next-generation sequencing transcriptomic information. PLoS Negl Trop Dis. 5, e1370 (2011).
  28. Hewitson, J. P., et al. Secretion of protective antigens by tissue-stage nematode larvae revealed by proteomic analysis and vaccination-induced sterile immunity. PLOS Pathogens. 9, e1003492 (2013).
  29. Prowse, S. J., Mitchell, G. F. On the choice of mice for dissection of strain variations in the development of resistance to infection with Nematospiroides dubius. Austral J Exp Biol Med. 58, 603-605 (1980).
  30. Behnke, J. M., Robinson, M. Genetic control of immunity to Nematospiroides dubius: a 9-day anthelmintic abbreviated immunizing regime which separates weak and strong responder strains of mice. Parasite Immunol. 7, 235-253 (1985).
  31. Zhong, S., Dobson, C. Heligmosomoides polygyrus: resistance in inbred, outbred, and selected mice. Exp. Parasitol. 82, 122-131 (1996).
  32. Behnke, J. M., et al. Genetic variation in resistance to repeated infections with Heligmosomoides polygyrus bakeri, in inbred mouse strains selected for the mouse genome project. Parasite Immunol. 28, 85-94 (2006).
  33. Zaiss, M. M., et al. IL-1β suppresses innate IL-25 and IL-33 production and maintains helminth chronicity. PLoS Pathog. 9, e1003531 (2013).
  34. Reynolds, L. A., et al. MyD88 signaling inhibits protective immunity to the gastrointestinal helminth parasite Heligmosomoides polygyrus. J Immunol. , (2014).
  35. Morimoto, M., Utsumiya, K. Enhanced protection against Heligmosomoides polygyrus in IL-2 receptor β-chain overexpressed transgenic mice with intestinal mastocytosis. J Vet Med Sci. 73, 849-851 (2011).
  36. Urban, J. F., Katona, I. M., Paul, W. E., Finkelman, F. D. Interleukin 4 is important in protective immunity to a gastrointestinal nematode infection in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 88, 5513-5517 (1991).
  37. Smith, K. A., Maizels, R. M. IL-6 controls susceptibility to helminth infection by impeding Th2 responsiveness and altering the Treg phenotype in vivo. Eur J Immunol. 44, 150-161 (2014).
  38. Hayes, K. S., Bancroft, A. J., Grencis, R. K. Immune-mediated regulation of chronic intestinal nematode infection. Immunol Rev. 201, 75-88 (2004).
  39. Fröhlich, A., et al. IL-21 receptor signaling is integral to the development of Th2 effector responses in vivo. Blood. 109, 2023-2031 (2007).
  40. King, I. L., Mohrs, K., Mohrs, M. A nonredundant role for IL-21 receptor signaling in plasma cell differentiation and protective type 2 immunity against gastrointestinal helminth infection. J Immunol. 185, 6138-6145 (2010).
  41. Ince, M. N., et al. Role of T cell TGF-β signaling in intestinal cytokine responses and helminthic immune modulation. Eur J Immunol. 39, 1870-1878 (2009).
  42. Reynolds, L. A., Maizels, R. M. Cutting Edge: In the absence of TGF-β signaling in T cells, fewer CD103+ regulatory T cells develop, but exuberant IFN-γ production renders mice more susceptible to helminth infection. J Immunol. 189, 1113-1117 (2012).
  43. Ekkens, M. J., et al. Memory Th2 effector cells can develop in the absence of B7-1/B7-2, CD28 interactions, and effector Th cells after priming with an intestinal nematode parasite. J Immunol. 168, 6344-6351 (2002).
  44. Greenwald, R. J., et al. B7-2 is required for the progression but not the initiation of the type 2 immune response to a gastrointestinal nematode parasite. J. Immunol. 162, 4133-4139 (1999).
  45. Ekkens, M. J., et al. The role of OX40 ligand interactions in the development of the Th2 response to the gastrointestinal nematode parasite Heligmosomoides polygyrus. J. Immunol. 170, 384-393 (2003).
  46. Hashimoto, K., et al. Immunity-mediated regulation of fecundity in the nematode Heligmosomoides polygyrus--the potential role of mast cells. Parasitology. 137, 881-887 (2010).
  47. Hepworth, M. R., et al. Mast cells orchestrate type 2 immunity to helminths through regulation of tissue-derived cytokines. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 6644-6649 (2012).

Tags

Immunologi , Helminth Life Cycle Ekskretionsorganerne-sekretionsprodukter Immunologi Infektion Mouse
Dyrkning af<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; Et immunmodulatorisk Nematode Parasite og dens udskilte produkter
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Johnston, C. J. C., Robertson, E.,… More

Johnston, C. J. C., Robertson, E., Harcus, Y., Grainger, J. R., Coakley, G., Smyth, D. J., McSorley, H. J., Maizels, R. Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products. J. Vis. Exp. (98), e52412, doi:10.3791/52412 (2015).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter