Summary
ここでは、連続的に細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージング分析により、非侵襲的に高い時間分解能での細胞接着及び脱接着プロセスを定量化するためのプロトコルを提示する。これらのアプローチは、マトリックス修飾および接着依存性のシグナル伝達事象に対する時間的関係によって誘発される細胞接着/脱接着プロセスのダイナミクスを明らかにした。
Abstract
細胞 - マトリックス接着細胞の形態を制御し、シグナル伝達において重要な役割を果たしている。細胞-マトリックス接着性（ 例えば 、ミエロペルオキシダーゼおよび他のマトリックス修飾酸化剤/炎症の間に放出される酵素）を崩壊させる刺激が多くの疾患において細胞機能、表現型と生存率の病理学的変化をトリガに関与している。ここでは、（病態生理学的マトリックス修飾刺激として内皮細胞およびミエロペルオキシダーゼを用いて）、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージングのアプローチを容易に正確に細胞接着およびマトリックス修飾により誘導される脱接着におけるリアルタイムの変化を定量化するために使用することができる方法について説明高い時間分解能でかつ非侵襲的な方法で。 xCELLigence細胞 - 基質インピーダンスシステムは、連続的に金微小電極アレイ上で増殖させた細胞における細胞 - 基板界面での電気インピーダンスを測定することにより細胞 - マトリックス接着面積を定量化する。タイムラプスdifferenの画像解析TiAlの干渉コントラストムービー細胞 - マトリックスの接触面積の変化を示す、経時的な個々の細胞の投影面積の変化を定量化する。両方の技術を正確に細胞接着と脱接着プロセスへの急速な変化を定量化する。微小バイオセンサアレイ上の細胞 - 基質インピーダンスは、堅牢、ハイスループット測定のためのプラットフォームを提供する。生細胞イメージングは、細胞 - 基質インピーダンス測定によって定量化の形態学的変化の性質および力学に関するさらなる詳細を提供する分析。これらの補完的なアプローチは細胞内、細胞外マトリックス成分のミエロ触媒による酸化修飾は、細胞接着の急激な変化をトリガし、形態および内皮細胞におけるシグナル伝達方法に貴重な新しい洞察を提供する。これらのアプローチはまた、他のマトリックス修飾刺激に応答し、関連接着細胞（ 例えば、上皮細胞）における細胞接着のダイナミクスを研究するために適用可能である。
Introduction
細胞とその周囲の細胞外マトリックスとの間の安定した接着剤の接点は、組織恒常性の維持のために必要とされる。例えば、血管の内皮下マトリックスの内皮細胞接着は、内皮層および規制、半透過性、血管障壁1としての恒常性維持機能の完全性を維持する上で重要な役割を果たしている。アクチン細胞骨格は、機械的に中央に指向アクトミオシンの引張力に抵抗することにより、細胞膜の位置を決定する際に重要な役割を果たす細胞 - マトリックス界面での細胞 - マトリックス接着と接着接触する部位におけるマトリックス分子を接着するように結合される。必ずしも細胞 - マトリックス界面における力のバランスを変化させる細胞 - マトリックス接着を改変細胞外刺激、急速にあるイベントは「アウトサイドインシグナル伝達」の形質導入をもたらし、機械刺激感受性シグナル伝達タンパク質によって「感知」。このクロストーク賭け予期する細胞とその周囲の細胞外マトリックスは、細胞の形状、運動性、機能、増殖及び生存2の制御において重要な役割を果たしている。
多様な病態生理学的プロセス（胚発生、炎症、創傷修復および癌転移）は、マトリックス分解酸化剤および/ または酵素3,4により接着剤マトリクス基板のダイナミックリモデリングによって特徴付けられる。例えば、血管の内皮下マトリックスタンパク質を接着剤（ 例えば 、フィブロネクチン）は、反応性酸化剤の局部的な生産にヒト炎症性疾患における修飾または分解のための主要な標的として示唆されている（ 例えば 、次亜塩素酸HOClの）白血球由来酵素による炎症性血管疾患（ 図1）5-9の間、内皮下層内に蓄積ミエロ（MPO）、。 MPO由来の酸化剤および他のマトリックス修飾刺激によって誘導される細胞 - マトリックス接着の変化は、リクある今度は内皮機能とバリアの完全性を乱し、内皮細胞のシグナル伝達、形態学および生存を変化させることによって、 例えば 、エリーは、病理学的プロセスの様々な時に血管の恒常性を変化させることにおいて重要な役割を果たしている。しかし、細胞外マトリックスの修正に接着した細胞の形態学的および細胞シグナル伝達応答は、理解され始めている。
マトリックスの修飾は、細胞接着のダイナミクスと接着依存性の細胞シグナル伝達経路の変化を駆動する方法を理解するために、この技術は、正確に、高い時間分解能で、リアルタイムで細胞 - マトリックス接着の変化を定量化することが必要である。ここでは、相補的な細胞 - 基質インピーダンスと、これらの基準を満たし、非侵襲的な方法で細胞接着及び脱接着過程を定量化するためのプラットフォームを提供し、生細胞イメージング技術を記述する。
私たちはどのようにこれらの細胞 - 基質インピーダンスとライブセルイメージングアプロ示し痛みは、容易には、（i）天然の及び変性マトリクス基板上に細胞接着および拡散（ すなわち 、 デノボ細胞接着）の動態をモニターし、（ii）細胞-マトリックス剥離のダイナミクスを測定するために（ すなわち 、脱接着に用いることができる）マトリックス修飾刺激にさらさ接着細胞による。 xCELLigence細胞 - 基質インピーダンスバイオセンサシステムは、96ウェルの金微小電極アレイの表面における電気インピーダンスを定量することにより細胞 - マトリックス接触の面積の連続的な測定を提供し、「セルインデックス '、無次元の値としてこれらの電気インピーダンスの測定値を表すまた（絶縁）細胞膜と電極表面11との間の平均距離の変化に敏感である一方、細胞-基板コンタクト10（ 図2）の面積に大きく比例する。細胞指数値のさらなる増加はまた、タイト、細胞 - 細胞接触の股関節形成時に達成される。tが、本研究に記載された実験の中勝訴しない11の条件を傍細胞電流が流れを制限する。経時微分干渉コントラスト（DIC）映画の画像解析による経時的な個々の細胞の投影面積の測定は、細胞 - 基質の接触面積の変化の相補的な尺度を提供するとの正確な性質および力学に関する追加情報を提供する細胞 - 基質インピーダンス法によって定量化し、形態学的変化。
具体的には、接着剤、内皮下のマトリックスタンパク質のMPO媒介酸化（ 例えば 、フィブロネクチン）（i）は、精製フィブロネクチンに懸濁した内皮細胞のデノボ癒着を減少させ、（ii）細胞-マトリックスドをトリガする方法を監視するため、これらのアプローチの適用を説明するフィブロネクチン上で確立された接着性を有する内皮細胞における-adhesion。関連BIOCHEMを用いて経時的に分析シグナル並列セルを行うことによりiCalのアッセイ（ 例えば 、ウエスタンブロット法）、接着依存性細胞シグナル伝達事象における接着/脱接着プロセスと関連した変化の間の時間的かつ因果関係を決定することができる。
これらのアプローチは、最近MPOの内皮下の堆積物によって触媒される細胞外マトリックスの酸化は、既存のアクトミオシン収縮力9によって駆動される内皮細胞の細胞-マトリックス接着の急速な減少を誘発することを実証するために使用した。重要なことは、両方の細胞接着の変化と決定されるシグナリング接着依存性細胞との間の時間的関係を可能にすることによって、これらのアプローチは、MPO誘発性マトリックス修飾および細胞の脱接着はSrcキナーゼなどの重要な接着依存性の細胞シグナル伝達経路の変化をトリガすることを同定し依存性パキシリンのリン酸化およびミオシン軽鎖IIリン（ 図1）9。レドックス依存性シグナル、INVのこのモード細胞-マトリックス接着を破壊する細胞外の酸化反応によって、細胞内シグナル伝達事象の活性化をolving、（ 図1）9 "外で酸化還元シグナル伝達」と呼ばれる細胞シグナル伝達の新規のモードを示す。
一般に、これらの補完的な細胞 - 基質インピーダンスバイオセンサーと生細胞イメージングのアプローチは、マトリックス修飾刺激または薬剤は、多種多様な対象の異なる付着細胞型内の細胞接着のダイナミクスの変化、形態学およびシグナル伝達を駆動する方法の異なる明らかに価値があるはず実験的な設定を行います。
以下のプロトコルは、デノボ内皮細胞接着（ 実験1）および内皮細胞脱接着（ 実験2）プロセス上のMPO媒介マトリックス酸化の影響を定量化する方法について説明します。 MPOは、フィブロネクチンおよび他の接着内皮下の細胞外マトリックスタンパク質に貪欲に結合し、私達塩化物イオン（のCl - ）を変換するエス過酸化水素（H 2 O 2）、これらのマトリックスタンパク質を局所的に反応し、その細胞接着性（ 図1）8,9 を破壊する反応性の高い塩素化酸化剤、次亜塩素酸（HOClの） に12。
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Protocol
1.一般内皮細胞の培養
- 培養ウシ大動脈内皮細胞をゼラチンコーティングした組織培養フラスコに（継代4-9）（コート組織培養表面15分間室温でPBS中/ vのゼラチン0.1重量％の）EGM-2弾丸とのEGM-2培地中で（ 5％ウシ胎児血清、成長因子およびヒドロコルチゾンを除いて、製造業者によって提供されるすべてのサプリメント）を含むキット。
- 細胞（1後約3日後に播種：4分割）、ほぼコンフルエントである場合、重量/体積トリプシン0.05％/ 37℃でのPBS中のEDTA w / vの0.02％での処理によって収穫細胞。細胞の大部分が分離した後、トリプシン、その後遠心分離（100×gで、5分）を急冷し、完全EGM-2メディアを追加。
- そして、この基板上に確立された密着性（実験2：第3節）と内皮細胞のその後の脱接着：フィブロネクチンへの内皮細胞のデノボ密着性（第2節実験1）の研究のために細胞を準備します。
- 洗って収穫一度/ vのウシ血清アルブミン（BSA）および再遠心分離（100×gで、5分間）を1％wを含有する無血清199培地での細胞。
- 再懸 濁（生細胞イメージング分析）2.5×10 5細胞/ ml（細胞-基質インピーダンス測定）または5×10 5細胞/ mlで、1％のw / vのBSAを含有する無血清199培地中で細胞を37に維持する使用前°C。
注：細胞の接着応答がそのように、以下のプロトコルの間に細胞を処理し、治療するために使用されるすべての機器との溶液を37℃の一定温度に保たれるべきである（対流効果によるなど ）の温度差に非常に敏感である。
2.実験1：ネイティブおよびMPO酸化フィブロネクチン（細胞-基質インピーダンス）で定量化·デ·ノボ内皮細胞接着
注：実験1は、フィブロネクチンのMPO媒介酸化デノボをサポートする能力を損なう程度を調べ
- 96ウェル金細胞 - 基質インピーダンス微小電極アレイ上にコートフィブロネクチン。 PBS中5μg/ mlで80μL/ウェルの精製したウシのフィブロネクチンを追加し、37℃で2時間インキュベートし、溶液を除去する。
- 表面に結合したフィブロネクチンへMPOの結合を可能にするためにMPOとのフィブロネクチンでコーティングされた表面をインキュベートする。 80μL/ウェルのハンクス平衡塩溶液（HBSS）で20 nmで精製されたヒト好中球MPOを追加し、37℃で0.5時間インキュベートする。
- ウォッシュは、未結合のMPOを削除するには、HBSSで二回表面。
- 開始するために、80 /ウェルHBSSを含む微小電極アレイプレートのウェルにH 2 O 2（0〜10μMの最終濃度）を加えるHOClの依存性フィブロネクチン酸化、MPOの触媒による、37℃でさらに0.5時間インキュベートする。
- MPO触媒反応（ 例えば 、代替のMPO酵素の関連阻害剤またはモジュレーターの効果を調べるため基質、酵素阻害剤または抗酸化剤; ）詳細については9を参照してください、H 2 O 2添加の直前にHBSSにこれらを追加します。
- 0.5時間後、残留表面結合酸化種をクエンチするメチオニンで表面を処理する。交絡細胞活性を発揮することができるすなわち 、反応性タンパク質結合クロラミン、。ウェルあたり80μlのHBSS中の10mMメチオニンを追加し、37℃で10分間インキュベートする。
- ブロックは、BSAで表面。 37℃で2時間インキュベートし、溶液を除去、0.2％BSAの80 /ウェルを追加W / V PBSに。
注：残留コーティングされていない表面領域は、細胞接着を支持し、非接着性タンパク質、これらを遮断する（ すなわち 、BSA）は、細胞接着応答が厳密にこの場合のフィブロネクチンに用いる精製された細胞接着性マトリックスに依存することを保証する。 - ウォッシュをHBSSで二回表面。
注：上記の表面処理はいずれもかなり細胞 - 基質の読影に影響を与えないGS。 - 種子懸濁内皮細胞は、（追加200μl/ウェルで、約2.5×10 5細胞/ mlで、血清を含まない199培地を含む1％BSAで調製し、1.3を参照のこと）、天然またはMPO酸化フィブロネクチンでコーティングされた表面上に。
- すぐに細胞を播種した後（ すなわち 、前のいずれかの細胞接着および拡散する）、（5％CO 2存在下、37℃のインキュベーター内に収容された）インキュベーターポート上に微小電極アレイ板を取り付ける。
- 機器のソフトウェアを使用すると、すぐに細胞接着の非存在下で得られた初期バックグラウンド値に続く細胞 - 基質インピーダンス（「セル·インデックス '）の値を正規化するために読んで「空白」を取る。
- 連続細胞インデックスデータ（1セル·インデックス·読み取り/分以上）の取得を開始します。
- 2時間後、最大の細胞接着および拡散が達成される期間のためにCO 2、37℃で、5％の細胞をインキュベートする。これにより反射され細胞指数値のプラトー（ 図3A参照 ）。
注：上記の実験（実験1）は、フィブロネクチンの最初のMPO媒介酸化は、この基板上に細胞接着を確立する内皮細胞の能力を制限する方法を調べる。以下の実験（実験2）MPO媒介フィブロネクチン酸化は、この基板上に確立された接着性を有する内皮細胞における細胞-マトリックス接着（ すなわち 、脱接着性）の減少を促進する方法を調べる。これら二つの実験において処置はMPO媒介フィブロネクチン酸化のタイミングを除いて、本質的に同一である（細胞接着の前に、すなわち 、 -実験1;細胞接着後-実験2）。
3.実験2：MPO媒介フィブロネクチン酸化（細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージング）に応じて、フィブロネクチンから内皮細胞脱接着の定量化
- 96ウェルの金微小電極aの上にコートフィブロネクチン生細胞イメージングの分析のための細胞 - 基質インピーダンス測定（PBS中5μg/ mlで80 /ウェルフィブロネクチンを追加し、37℃で2時間インキュベート）または35mmのガラス底の細胞培養皿用rrays（2 mlで加える/ PBS中5μg/ mlのフィブロネクチンの皿を37℃で2時間インキュベート）。
- ブロックは、BSAで表面。 3.1に示されている音量で、PBS中w / vの0.2％BSAを追加し、37℃で2時間インキュベート。
- フィブロネクチンへMPOの結合を可能にするためにMPOで表面をインキュベートします。 3.1に示されている音量でHBSS中に20 nMの精製したヒトMPOを追加し、37℃で0.5時間インキュベートする。
- ウォッシュは、未結合のMPOを削除するには、HBSSで二回表面。
- 天然またはMPO担持フィブロネクチンでコーティングされた表面上に、シードは、内皮細胞（1.3を参照BSA w / vの1％を含有する無血清199培地中で調製）を懸濁させた。
- 96ウェル細胞-基質インピーダンス微小電極アレイに2.5×10 5細胞/ mlで200μl/ウェルを追加。 <李は>細胞培養ディッシュ底35ミリメートルガラスに5×10 5細胞/ mlで2ミリリットル/皿を追加します。
- （5％CO 2存在下、37℃のインキュベーター内に収容された）細胞-基質インピーダンスインキュベーターポート上にマウントし、96ウェルの微小電極アレイプレートおよびセル·インデックス·データの連続的な取得を開始するために「ブランク」読み取りを行う（参照、2.10 ）。
- 転送35mmのガラスを、5％CO 2存在下、37℃のインキュベーターに細胞培養皿底。
注：後者は酸化反応を妨害する酸化可能な種を含むように代わりに完全な培地のMPO触媒による酸化反応を研究する際にHBSSを使用する。
注：HBSSで0.5時間の平衡化の後、セルインデックス値はわずかに低い値で安定する。酵素基質、酵素および細胞シグナル伝達阻害剤または抗酸化剤を用いて細胞をプレインキュベートするとき、最初にそのトンを確保するHESE大幅に平衡後に得られた値に影響を与えません。
- 96ウエル微小電極アレイプレートを用いた細胞のインピーダンス試験のために：
- インキュベーターから微小電極アレイプレートを取り外し、セル·インデックス·測定を一時停止する。
- HBSSにH 2 O 2（0〜10μMの最終濃度）を加え、穏やかに繰り返しピペッティングにより混合します。
- 直ちに、背面37℃インキュベーターポート上に微小電極アレイを再マウントし、細胞指数測定値の取得を再度開始する。
- 35mmのガラスを用いて生細胞イメージング研究のための細胞培養皿の底。
- インキュベーターから培養皿を取り出し、生細胞ムービーを記録するのに適しDIC光学系と63X水の対物レンズを備えた倒立型共焦点顕微鏡の37℃で加熱されたステージにマウントします。
- 細胞に焦点を当て、DIC光学系（;詳細については、13を参照してくださいケーラー照明、バイアス遅滞とカメラオフセット/ゲイン）を最適化する。
- DICムービーを開始し、1分間の未処理細胞のベースライン測定値を記録します。
- H 2 O 2（0〜10μMの最終濃度）を加え、穏やかに繰り返しピペッティングにより混合します。顕微鏡を再フォーカス（必要な場合）、必要な時間だけ処理した細胞のDICの動画を撮影し続ける。
4.データ分析とプレゼンテーション
- 細胞 - 基質インピーダンスデータ
- スプレッドシートにエクスポートし、生データ（セルインデックス対時間）。
- 細胞の脱接着試験（実験2：セクション3）については、（ すなわち 、直ちに3.11でH 2 O 2を添加する前に、前の1の値でMPO媒介フィブロネクチン酸化の開始にすぐに記録された値を設定することによってデータを正規化する.1.1）。
注：これは相対的なことが保証さMPO媒介フィブロネクチン酸化により誘発される細胞指数値の変化は、ウェル間の絶対的な細胞指数値の小さい初期差異によってマスクされていない。- 時間（x軸）に対する正規化された細胞指数（y軸）のプロットとして存在するデータ。
- 細胞イメージングデータ（細胞脱接着試験は、実験2：セクション3）生きる
- DICの直前に、標準的画像解析プログラム（ 例えば、ImageJソフトウェア）でMPO媒介フィブロネクチン酸化の開始後に記録細胞イメージング映画を生きる開きます。
- 少なくとも2つの別個のDIC·ムービー、ランダムに複数のセルを選択し、手動でそれらの膜のエッジをトレースし、囲まれたピクセルの数を定量化することによって連続フレーム（ 例えば、1分間隔で）での投影面積を測定します。
- Excelスプレッドシートにエクスポートし、生データ（時間に対する投影細胞面積）とすぐに記録された値を設定することによりセル面積のデータを正規化する前1の値でのMPO媒介フィブロネクチン酸化の開始（ すなわち 、直ちに3.11.2.3におけるH 2 O 2の添加前）。
- 時間（x軸）に対する正規化されたセル面積（y軸）のプロットとして存在するデータ。
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Representative Results
MPO媒介フィブロネクチン酸化（実験2）に応答して、フィブロネクチンからの内皮細胞の脱接着のリアルタイム定量化内皮細胞懸濁液を播種最大の細胞付着におけるネイティブ（MPOフリー）フィブロネクチンまたはMPO含有フィブロネクチン結果へと拡散2時間以内に、セル基板のインピーダンス測定（ 図3A）における細胞指数値のプラトーによって判断される。 MPO媒介フィブロネクチン酸化は実験1で詳述したプロトコールに従って実施された実験における細胞播種の前に開始されたとき、細胞の付着および拡散のこの初期段階では著しく減少した（データは示していない。詳細は9を参照してください）。最大の細胞接着は、天然またはMPO含有フィブロネクチン上で確立されると、（MPOの補基質H 2 O 2を添加することによって開始される）MPO触媒さのHOClにより媒介フィブロネクチン酸化はシュールの急速な減少を引き起こす標的、 映画1を参照して代表的なDICの映画のために;（ 図3A、B）細胞-基質インピーダンスと生細胞イメージング（ 図3Cにより測定される細胞-マトリックス接触の顔領域H 2 O 2添加後の細胞指数またはセル面積の損失）MPO 9の非存在下では最小である。 MPO誘発性脱接着時のセルインデックス及びセル面積の変化が非常に類似していた一方で、細胞指数値の比較的遅い減少が縮小時に細胞周辺での「無細胞」領域に存在する細胞膜材料の絶縁効果を反映することができる投影細胞面積の測定で定量化されていない接着。 2 O 2処理Hに応答して、MPO含有フィブロネクチンに結合している内皮細胞において明らかで急速細胞の脱接着単独でH 2 O 2で処理した細胞には存在しない（ すなわち 、MPOを含有しない細胞）（ 図3A）とBはブロックされているyのMPO酵素阻害剤またはHOClのスカベンジャー（データは示していない。詳細については9参照）、このプロセスはHOClののMPO触媒による生産（参照： 図1）に依存していることを識別する。ブレビスタチンとミオシンII運動機能の阻害は応答して、その細胞の脱接着および収縮を識別する、細胞-基質インピーダンス（ 図3B）で、ライブセルイメージング（ 図3C、映画2）で測定し、内皮細胞の脱接着率を抑制するMPO触媒による細胞内基質酸化にアクトミオシン張力9によって駆動される。
図1. MPO媒介細胞内マトリックス酸化は、細胞-マトリックス脱接着および細胞シグナリングをトリガします。MPOは、対象Oを媒介することによって急速な脱接着応答および接着依存性のシグナル伝達の変化をトリガ次のイベント9を含む接着内皮下マトリックスタンパク質のxidation、（A）MPOは内皮下マトリックスに貪欲に結合し、反応性の高い酸化剤のHOClを生成するH 2 O 2を使用してマトリックスタンパク質（ 例えば 、フィブロネクチン）と局所的に反応し、それらを破壊細胞接着。 （B）は、この損傷は、無競争のアクチン細胞骨格の緊張とリースらから許可を得て複製接着依存性細胞シグナル伝達経路（の変化によって駆動（C）膜の後退につながる、細胞-マトリックス界面での接着剤の接触が中断されます。9 ）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
FIGUR細胞-基質インピーダンスの電子2.ワーク·フローと原理はMPO媒介フィブロネクチン酸化（実験2）に応答して、フィブロネクチンからの内皮細胞の脱接着性を定量するために分析する。細胞-基質マイクロアレイインピーダンスバイオセンサシステムによって測定されたセルのインデックス値が反映され電極表面で電界誘起イオン電流を制限し、細胞-基質接点10の面積に比例するために、細胞膜の能力。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3.リアルタイムMPO媒介フィブロネクチン酸化（実験2）に応答して、フィブロネクチンからの内皮細胞の脱接着性の定量。内皮細胞懸濁液（無血清199培地を含む1％でBSA）を96ウェルマイクロ電極アレイ（細胞 - 基質インピーダンス測定）または35ミリメートルのガラス底を20 nMのMPOの不在下または存在下でインキュベートし、5で被覆された天然またはMPO担持フィブロネクチン（フィブロネクチングラム/ mlで）上に播種し細胞培養皿（生細胞イメージング分析）。次いで、細胞を（設定H 2 O 2添加時に最大の細胞付着を可能にするために2時間37℃でインキュベートし、HBSSで細胞を平衡化し、H 2 O 2（10μM）を添加することによりMPO媒介フィブロネクチン酸化を開始する前に拡散し時刻t = 0分）。 MPOの存在（+ MPO）および非存在下（-MPO）におけるH 2 O 2での処理前後の細胞-基質インピーダンス測定の（A）全時間経過。生細胞イメージングによる（B）細胞-基質インピーダンス測定値と（C）セル面積の測定は、（存在下でH 2 O 2とのMPO含有細胞の処理後に、分析+ブレビスタチン）とミオシンII阻害剤のブレビスタチン（40μM）の不在（-blebbistatin）。セルインデックス及びセル面積の値が直前の代表的な実験からのn = 6反復測定、1セルインデックスデータの値を所定の平均±SEMを表したH 2 O 2添加時に値に正規化される。セル面積の値は、平均±SEMを表し、N = 10細胞（2複製映画、映画あたり5無作為に選択したセル：参照ビデオが1及び2）。 （ 図3B、図3Cは 、 映画1ムービー2はリースらから許可を得て複製されている。9）。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
映画1 。タイムラプスDICマイクロ0オーバーMPO-ベアリングフィブロネクチンに付着した内皮細胞のSCOPY映画- H 2 O 2（10μM）に曝露した後の15分。 1秒= 3分。
映画2 。0の上にMPO-ベアリングフィブロネクチンに付着した内皮細胞の時間経過DIC顕微鏡映画-ブレビスタチン（40μM）の存在下でのH 2 O 2（10μM）に曝露した後の15分。 1秒= 3分。
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Discussion
細胞 - マトリックス接着及び脱接着プロセスは、細胞 - 基質インピーダンスと生細胞イメージング解析を用いて高時間分解能でリアルタイムで正確に定量することができる。これらのリアルタイムのアプローチは悪い時間分解能を提供し、細胞接着のエンドポイント分析を、上の大きな利点を提供する。正確に高い時間分解能で迅速な脱接着応答を定量化することによって、これらの分析は、行列の変更への対応は、関連する生化学的ア ッセイ（ 例えば 、使用して制御され、彼らはプロセスのシグナル接着依存性細胞に影響を与えるかを、並行して測定する方法を形態学的に重要な洞察を提供することができますウエスタンブロット法）。
最近の研究では、これらのアプローチは、内皮細胞の脱接着をトリガに内皮下マトリックスのMPO媒介酸化のための新規の役割を明らかにするために使用されたと示した：（i）の脱接着率が事前に決定的に依存していること既存のアクトミオシン収縮（参照、 図3Bおよび3C）および（ii）細胞マトリックス接着の損失はのSrc依存パキシリンのリン酸化ミオシン軽鎖IIリン9（ 図1参照）などの重要な接着依存性の細胞シグナル伝達経路の変化を運転していること。これらのデータは、内皮下細胞外マトリックスは、マトリックス結合MPOまたは反応性酸化3,5-9の他の供給源の内皮下の堆積物によって生成オキシダントのための重要なターゲットとして関与している炎症反応、中に内皮機能とバリアの完全性を理解するために重要な意味を持っている14。
マイクロアレイに基づく、細胞 - 基質インピーダンスバイオセンサーシステムの使用は、堅牢、ハイスループット細胞接着の測定のためのプラットフォームを提供する。 96ウェル細胞-基質インピーダンス微小電極アレイの各ウェルは、同時に32の異なる実験条件（ すなわち 、3つのウェルのpeのを分析する可能性を有するrの条件）。細胞接着の小さな変化を比較した場合しかし、少なくとも4つ以上のウェルは、実験条件ごとに使用されるべきである。細胞播種およびケアは、37℃で全ての溶液を維持し、37℃のインキュベーター環境外で細胞を処理するために要する時間を最小限に抑えるように注意すべきであるその後の細胞治療、（中にこの接着応答に影響を与える可能性微小電極アレイの両端の電位の温度差を回避する）。特に、細胞-基板界面での電流は、細胞上清10のイオン強度に敏感である。その結果として、細胞は効果をモニタリングする前に安定した細胞指数応答を得るために新しいバッファ/培地の添加後に平衡化させるべきである興味のある刺激の（3.10と図3（a）参照 ）。細胞指数の減少は、細胞 - マトリックス接触の平均面積の減少を反映し得るだけでなく、付着した細胞の数の減少を反映することができる。区別するためにこれらの可能性を、微小電極アレイ上に付着した細胞数の変化は、このアプローチはMPO媒介フィブロネクチン酸化の平均面積の急激な減少をトリガすることを確認するために使用されたクリスタルバイオレット染色によって細胞 - 基質インピーダンス測定の直後に定量化することができる細胞-マトリックス接触が、（詳細は、9を参照のこと）、細胞剥離を促進しない。
細胞 - 基質インピーダンス技術の制限は、微小電極表面上に存在するすべての細胞上の接着性の変化の平均測定値を提供し、それは個々の細胞のレベルでの接着または形態学的変化の正確な性質についての情報を与えないということである。この制限に対処するために、生細胞のDIC顕微鏡および画像解析は、接着の変化の相補的な尺度を提供し、個々の細胞の形態学的変化を明らかにしている。従って、MPO媒介フィブロネクチン酸化MEAに応答した細胞指数の減少細胞-基質インピーダンス（ 図3A）によってsured DICムービー（ 図3B）の生細胞画像解析によって測定された細胞の投影面積の減少とよく相関する。重要なことは、DICムービーは、個々の細胞では、脱接着をMPO誘発性の基層及び隣接セルから末梢細胞膜の急速な後退を伴うことを明らかにし、最終的には、結果として得られることなく、コンパクトな「切り上げ」の形態を想定した細胞になる細胞の剥離中（ 動画1）。細胞 - 基質インピーダンス測定と同様に、再現可能な細胞応答を確保する、注意を細胞に加熱顕微鏡ステージ（または同等の温度制御装置）に使用前に37℃での溶液を維持するように注意すべきで生細胞イメージングの間に使用されなければならない録音。
ここで説明するプロトコルは、（他の精製されたマトリクス基板でフィブロネクチンを置換することによって容易に変更することができる
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Disclosures
著者は、作るの開示全くない。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96 well gold cell-substrate impedance microelectrode array | ACEA Biosciences / Roche | E-Plate 96 | single-use plate used for performing cell-based assays on the xCELLigence system |
| blebbistatin | Sigma | B0560 | selective inhibitor of non-muscle myosin-II |
| Bovine Aortic Endothelial Cells, cryopreserved | Lonza | BW-6001 | |
| Bovine serum albumin | Sigma | 05470 | |
| EGM-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | endothelial cell growth media kit |
| Fibronectin, lyophilized powder | Sigma | F-4759 | from bovine plasma |
| Fluorodish 35 mm glass-bottomed cell culture dish | World Precision Instruments | FD35-100 | Cell cuture dish with optical quality glass bottom for imaging |
| Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | cell culture substratum |
| Hank's Balanced Salt Solution | Life Technologies | 14025076 | |
| Hydrogen peroxide | Merck | 107298 | |
| Medium-199 | Life Technologies | 11150-059 | serum-free cell media |
| Methionine | Sigma | M9500 | quenches chlorinating oxidants generated by myeloperoxidase |
| Myeloperoxidase, Human Polymorphonuclear Leukocytes | Millipore | 475911 | |
| RTCA MP Instrument / xCELLigence cell substrate impedance system | ACEA Biosciences / Roche | Consists of RTCA Analyzer, RTCA (Multiple Plate) MP Station and RTCA Control Unit | |
| Trypsin-EDTA (0.5%) | Gibco | 15400-054 |
References
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