Abstract
Kryptokockos är en livshotande infektion som orsakas av patogena svampar av släktet Cryptococcus. Infektion sker vid inandning av sporer, vilka är i stånd att replikera i den djupa lungan. Fagocytos av Cryptococcus av makrofager är ett av de sätt som sjukdomen är i stånd att sprida sig in i det centrala nervsystemet för att orsaka dödlig meningoencefalit. Därför är det viktigt att förstå utvecklingen av infektionen studie av sambandet mellan Cryptococcus och makrofager. Den aktuella studien beskriver en steg-för-steg-protokoll för att studera makrofag smitt av C. neoformans in vitro. Med hjälp av detta protokoll, studeras betydelsen av värd steroler värd och patogen interaktioner. Olika koncentrationer av metyl - cyklodextrin (MCD) användes för att utarma kolesterol från murin retiklet sarkom makrofagliknande cellinjen J774A.1. Kolesterol utarmning bekräftades och kvantifierades med både ett kommersiellt tillgänglig före kolesterol kvantifiering kit och tunnskiktskromatografi. Kolesterol utarmat celler aktiveras med Lipopolysacharide (LPS) och interferon gamma (IFNy) och infekterade med antikropps opsoniserad Cryptococcus neoformans vildtyp H99 celler vid en förhållande effektor-till-mål på 1: 1. Infekterade celler övervakades efter 2 h av inkubation med C. neoformans och deras fagocytiska index beräknades. Kolesterol utarmning resulterade i en signifikant minskning av den fagocytiska indexet. De presenterade protokollen erbjuder en bekväm metod för att efterlikna initieringen av infektionsprocessen i laboratoriemiljö och studera rollen av värd lipidsammansättningen på smittsamhet.
Introduction
Fagocytos är en process genom vilken extracellulära enheter internaliseras av värdceller. Det är ett viktigt vapen i immunsystemets arsenal för att försvara sig mot patogener, men processen kan ofta undermineras av patogener för att möjliggöra internalisering och spridning i hela kroppen 1. Fagocytos medieras av flera signaleringshändelser som resulterar i fastsättning och omvälvning via omlagringar i värdcellens cytoskelettet. "Professionella" fagocyter kan känna igen och binda till opsoniner på ytan av den invaderande patogen för att signalera för fastsättning och bildandet av lamellipodia, som uppsluka patogenen och bildar en phagosome 2. Bland de så kallade "professionella" fagocyter är makrofager. Makrofager är högt specialiserade celler som utför skyddsfunktioner som inkluderar söka upp och eliminera sjukdomsframkallande ämnen, reparera skadade vävnader, och medla inflammation, de flesta avdessa genom processen för fagocytos 1,2.
Cryptococcus neoformans är en art av patogen jäst som orsakar en allvarlig sjukdom som kallas kryptokockos. Cryptococcus sporer inandning av värden och resultera i en lunginfektion som vanligtvis asymtomatisk. Man tror att exponeringen är extremt utbredd; ett urval av 61 barn från Pediatric Infectious Diseases kliniken vid Bronx-Libanon Hospital Center fann att alla tillfrågade dem hade antikroppar mot cryptococcal polysackarid glucuronoxylomannan och andra studier har visat förekomst i både humant immunbristvirus (hiv) oinfekterade och infekterade vuxna 3, 4. alveolära makrofager är den första raden i svar på den lunginfektion och i de flesta fall lyckas klara patogenen. Men med nedsatt immunförsvar (t.ex., HIV och AIDS patienter) jästen kan överleva inom makrofager. I dessafall kan makrofagerna fungera som en nisch för replikering av den patogen och kan underlätta dess spridning till det centrala nervsystemet (CNS) där sjukdomen blir dödlig 5-8. Man tror att makrofager ens kan leverera jästen direkt i mening, hjälpa jästen att passera blod-hjärnbarriären via "trojansk häst" modell 3,9 - 11. Således är det viktigt att förstå processen för fagocytos och de faktorer som påverkar det, särskilt i kryptokockinfektioner.
Tidigare arbete i andra patogener system pekar på kolesterol och lipidaggregat bildade av kolesterol som har en viktig roll att spela i fagocytos 12-15. Kolesterol är den mest förekommande lipidförening i däggdjursceller och innefattar 25-50% av däggdjurscellmembranet 16. Det har visat sig spela en roll vid modulering BlOPhysical egenskaper membran genom att ändra sin styvhet 17. Kolesterol och sfingolipider tillsammans bildar lipid mikro inom membranet kallas lipidaggregat. Lipidaggregat har befunnits vara inblandade i bildandet av caveolae, samt att ge en isolerad domän för vissa typer av signalering 16-18. På grund av deras ringa storlek, är det svårt att studera lipidaggregat in vivo. Ett bra sätt att studera rollen av lipidaggregat är att ändra sina väljare. Metyl-β-cyklodextrin (MβCD) är en förening som har visat att tömma kolesterol från däggdjurs membran och används ofta för att studera vilken roll lipidaggregat 18.
I detta protokoll presenterar vi en metod för att utarma kolesterol från värdcellmembran och kvantifiera effekten av utarmning på förmågan hos värdcellerna att fagocytera C. neoformans in vitro. Denna procedur använder sig av cellodlings techniqderingar på en odödlig makrofagliknande cellinje (J774A.1) som en modell för infektion. Kolesterol utarmning åstadkoms genom exponering för MβCD, som har en hydrofob kärna är specifik för den storleken av steroler och är i stånd att fungera som en sänka för kolesterol för att dra den ut ur membranet 19. Kolesterol utarmning mättes kvantitativt med hjälp av ett kommersiellt tillgängligt kit och kvalitativt med hjälp av en modifierad Bligh-Dyer lipidextraktion följt av tunnskiktskromatografi (TLC) 20. . Fagocytos mättes genom att infektera cellen linje med en kultur av opsoniserad jäst blandat med en cocktail av interferon-γ och lipopolysackarid för aktivering av makrofager Cryptococcus ades opsoniserad med hjälp av en glucuronoxylomannan (GXM) antikropp 21-23. Färgning och mikroskopi experiment tillåtet för visualisering av cellerna och beräkning av fagocytiska index för att bedöma graden av fagocytos. Sammantaget detta protokoll describes en grundläggande metod som integrerar förändringen av lipidkompositionen med en fysiologisk process.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kolesterol Utarmning av J774A.1 Celler med MβCD
- I en steril biosäkerhet skåp, utsädes 10 5 J774A.1 makrofagliknande celler per brunn på en 96-brunnars cellodlingsplatta i 200 | il Dulbeccos modifierade Eagles medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (P / S). Inkubera vid 37 ° C och 5% CO 2 O / N.
- Ta ut mediet från cellmonolagret och tvätta cellerna två gånger med 1x fosfatbuffrad saltlösning (PBS) som har filtrerats eller autoklaveras.
- Lägg 200 pl av MβCD lösning vid den önskade koncentrationen (10 mM eller 30 mM i PBS) eller 1 x PBS som en kontroll och inkubera under 30 minuter vid 37 ° C med skakning. Avlägsna supernatanten och reserv vid RT för kvantitativ analys med kommersiellt tillgängligt kit omedelbart efter ingreppet.
- Tvätta cellerna två till tre gånger med 1 x PBS eller serumfritt DMEM och fortsätta med infektion eller lyserar celler genom pipetting 2-3 gånger med avjoniserat H2O för analys med tunnskiktskromatografi eller med ett kit.
OBS: Efter kolesterol utarmning ett kommersiellt tillgängligt kolesterol kvantifiering kit kan användas. Se material avsnitt för detaljer. Följ tillverkarens anvisningar som skrivet.
2. Observation av kolesterolinnehåll genom tunnskiktskromatografi (TLC)
- Tvätta en TLC tank två gånger med aceton och en gång med en lösning av petroleumeter: dietyleter: ättiksyra (65: 30: 1 i volym). Mätta vannan med petroleumeter: dietyleter: ättiksyra (65: 30: 1 i volym) lösning och lämna O / N.
OBS: Organiska lösningsmedel ska alltid användas under en huv för att förhindra inandning av ånga. Handskar och labbrock ska bäras vid alla tillfällen. Ättiksyra är en stark syra och bör användas med försiktighet. - I en steril biosäkerhet skåp, frö 10 6 J774A.1 makrofagliknande celler per brunn på en 6-brunnars cell odlingsplatta i en volym av 5 ml varmt DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% P / S. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Utarma makrofager av kolesterol genom att följa stegen 1,2-1,4, ersätta 1 ml för 200 l förekommande fall ta hänsyn till den större väl storleken.
- Lägg 500 pl av trypsin-EDTA till varje brunn, inkubera i 3 min vid 37 ° C och försiktigt skrapa celler med en cellskrapa.
- Överför till ett mikrofugrör och tillsätt ytterligare 500 pl av varm DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% P / S.
- Snurra cellerna under 5 min vid 300 xg och avlägsna supernatanten.
- Tillsätt ytterligare 500 pl av varm DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% P / S till cellpelleten och återsuspendera noggrant genom pipettering upp och ned.
- Avlägsna 10 pl celler och räkna cellerna på en hemocytometer. Normalisera cellkoncentrationer från varje prov och tillsätt en lika antal celler till glasrör.
OBS: I detta steg, en majväljer att kombinera celler från samma behandlingsgrupperna för att få en mer koncentrerad slut lipidextraktet. - Centrifugera cellerna vid 300 xg under 5 min vid RT och avlägsna media.
- Tillsätt 2 ml metanol och virvel. Lägg sedan till 1 ml kloroform och skaka. Kontrollera fasstatus att se lösningen i monofasiska.
OBS: Rör kan lagras vid 4 ° CO / N. - Centrifugera vid 1700 xg under 10 min vid RT och överför supernatanten till ett nytt rör
- Lägg ytterligare 1 ml kloroform följt av 1 ml dH 2 O. Vortex två gånger för 30 sek. Centrifugera vid 1700 xg under 5 min vid RT.
- Väg ett glasrör i en känslig balans och använda ett glas pasteurpipett för att överföra den undre fasen i glasröret med känd vikt.
- Torka ned lipider i en centrifugal förångare tills torr (ca 2 tim). Väg rör med torkade lipider och beräkna torr lipidvikten.
OBS: Torra lipider kan lagras i -20 ° C tills redo att utföra TLC. - Späd torkade lipiderna i tillräckligt kloroform för att normalisera koncentrationen av lipid (vanligen 20-50 | il) och belastning 20 | il av den utspädda lipid på en kiseldioxid-TLC-platta. Belastning 20 xg kolesterol utspädd i 20 ul av kloroform som en standard.
- Lägg torkad TLC-platta till den mättade TLC tanken och låt lösningsmedels att migrera upp till 1 cm före plattkant. Ta TLC-plattan från vannan och låt den torka ca 5 min.
- Visualisera lipider genom att placera i ett jodånga tank för att kontrollera migration. Ta ut och låta fläckar att blekna under ca 10-15 minuter under huven.
OBS: Jod är en inandningsrisk. Använd alltid under en huv. - Bered en lösning för neutral lipid färgning genom att kombinera 60 ml metanol med 60 ml avjoniserat H2O, 4 ml svavelsyra, och 630 mg mangan klorid.
- Försiktigt och långsamt doppa TLC-plattan i neutral lipid färglösningen i ett fack och ta bort utan avsked kiseldioxid layer.
OBS: Den neutrala lipiden färgningslösningen kan återanvändas flera gånger och så att det kan hämtas från brickan och placeras tillbaka i en flaska för senare användning. - Låt plattan torka under huven vid RT tills alla bubblor försvunnit. Värm TLC-plattan på ett värmeblock uppsättning till 160 ° C och röding till önskad färg.
OBS: Ett densitometry program som Vision Works LS kan användas för att kvantifiera de förkolnade banden att jämföra lipid prover.
3. Infektion av makrofager med C. neoformans (H99)
- I en steril biosäkerhet skåp, frö 10 5 makrofag-liknande celler per brunn på en 96-brunnars cellodlingsplatta i 200 | il DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% P / S. Inkubera vid 37 ° C, 5% CO2, 5% CO 2 O / N.
OBS: Infektion kan också göras i glas bottnat konfokala rätter för enklare bildbehandling; alla belopp förblir desamma. - Odla en kultur av C. neoformans (H99)genom ympning 10 ml YNB med en koloni som erhållits från en slog plattan och inkubera det O / N vid 30 ° C med skakning.
- Tvätta och räkna C. neoformans (H99) -celler.
- Centrifug C. neoformans O / N-kulturen vid 1700 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Ta bort media och kasta. Tvätta cellerna med 5 ml 1 x PBS. Centrifugera vid 1700 xg under 10 min vid 4 ° C.
- Avlägsna PBS och tvätta med 5 ml filtrerat 1x PBS. Centrifugera vid 1700 xg under 10 min vid 4 ° C. Upprepa detta steg 2 gånger.
- Ta bort PBS och resuspendera i 5 ml 1 x PBS.
- Gör en seriespädning i PBS för erhållande av en 1: 500 spädning av den tvättade kulturen.
- Lägg 100 pl av det ursprungliga provet till 900 ^ il 1 x PBS för att erhålla en 1:10 utspädning.
- Lägg 100 ul av 1:10 utspätt prov till 900 pl av 1 x PBS för erhållande av en 1: 100 utspädning.
- Lägg 200 ul av 1: 100 utspätt prov till 800 pl av 1 x PBS för erhållande av en 1: 500 dilutipå
- Ta 10 pl 1: 500 utspädning och räkna med hemocytometer att beräkna antalet celler.
- Bered arbetslösning för aktivering makrofager och opsoniserande C. neoformans.
- Späd LPS och IFNy 100x från stamlösningar genom tillsats av 10 pl till 990 pl.
OBS: LPS och IFNy används för att förbättra fagocytisk upptag men behövs inte för fagocytos. Om det finns ett intresse för fungicid aktivitet av makrofager, utför aktiverings O / N vid 37 ° C med skakning före infektion. - Per prov kombinera 7.5 pl utspädda LPS, 1.25 pl utspätt IFNy, 1.25 pl GXM antikropp och volymen för C. neoformans kultur som ger 1,25 x 10 5 celler. Bringa volymen upp till 250 | il multiplicerat med antalet prover med DMEM kompletterat med 10% FBS och 1% P / S.
- Vortexa och inkubera lösningen under 20 min vid 37 ° C med skakning.
NOTERA:Kolesterol utarmning (steg 1,2-1,4) kan göras samtidigt med opsonisering steget. Var noga med att behandla makrofager före kombinera arbetslösning, eftersom de opsoniserade celler bör optimalt användas längre än 20 minuter efter steg 3.4.3 inkubation.
- Späd LPS och IFNy 100x från stamlösningar genom tillsats av 10 pl till 990 pl.
- Infect Makrofager
- Tvätta makrofager två gånger med serumfritt DMEM och lägga 200 pl opsoniserad C. neoformans arbetslösning till varje brunn.
- Inkubera i 2 h vid 37 ° C.
- Fix och Stain Cells
- Ta bort media och tvätta cellerna 2 gånger med DMEM.
- Lufttorka cellmonoskiktet under 10 minuter och tillsätt 200 | il iskall metanol för att fixera cellerna.
- Inkubera i 15 minuter vid RT och ta bort eventuella återstående metanol.
- Lägg 200 ul av 10x Giemsa och inkubera under 5 min vid RT.
- Tvätta 2-3 gånger med avjoniserat vatten och torr O / N med mössan.
OBS: Imaging kan göras nästa dag eller upp till en vecka following färgning.
- Visualisera och Count
- Med hjälp av ett mikroskop, räkna 300 celler per datapunkt (om det finns två av samma behandling räkna 150 per brunn) och notera antalet infekterade makrofager och antalet uppslukas Cryptococcus celler.
OBS: För att säkerställa en jämn sampling per datapunkt användning 2 plattor per tillstånd, välja 3 icke-överlappande områden per platta och räkna 50 celler per område. - Beräkna fagocytisk index genom att multiplicera andelen infekterade makrofager med medelantalet C. neoformans per makrofag. Normalisera fagocytisk index genom att uttrycka värden som en procentandel av den 1x PBS behandlad kontroll. Efter flera försök beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet för att bestämma trender i fagocytisk index. Använd elev t-test för att avgöra betydelse.
- Ta mikrofotografier av celler vid 1,000X eller 400 gångers förstoring.
- Med hjälp av ett mikroskop, räkna 300 celler per datapunkt (om det finns två av samma behandling räkna 150 per brunn) och notera antalet infekterade makrofager och antalet uppslukas Cryptococcus celler.
4. Trypan Blue-analys
- I en steril biosäkerhet skåp, frö 10 6 makrofagliknande celler per brunn på en 6-brunnars cellodlingsplatta i en volym av 5 ml Dulbeccos minimala essentiella medium (DMEM) kompletterat med 10% fetalt bovint serum och 1% penicillin / streptomycin . Inkubera vid 37 ° C, 5% CO 2 O / N.
- Utarma makrofager av kolesterol genom att följa stegen 1,2-1,4 ersätta 2 ml för 200 l förekommande fall ta hänsyn till den större väl storleken.
OBS: Var noga med att inkludera en kontroll som behandlats med 1x PBS samt en kontroll som skrapas innan någon behandling. - Lägg 500 pl av 1 x PBS till varje brunn och försiktigt skrapa celler med en cellskrapa. Överför till en mikrofugrör och suspendera cellerna genom att försiktigt pipettera upp och ned.
- Avlägsna 10 pl celler och fläcken med 1 pl av 4% Trypanblått.
- Räkna celler i en hemocytometer och beräkna viabilitet med användning av följande ekvation:% viabilitet = [1 - (blått celler / totala celler)]x 100. Normalisera värden till den kontroll som var obehandlad. Efter flera försök beräkna medelvärdet och standardavvikelsen för att bestämma trender i viabilitet. Använd elev t-test för att avgöra betydelse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kolesterol Depletion
Analys av supernatanten reserverad i steg 1.3 i protokollet genom att följa tillverkarens anvisningar i Amplex Red Kolesterol Assay kit ger en förhöjd koncentration av kolesterol i MβCD behandlade provet jämfört med 1x PBS kontroll. Beroende på celltyp och MβCD koncentration används kolesterol utarmning kan variera. För J774 behandlades med 10 mM MβCD ades en utarmning av ca 50% observerats. Utarmning kan beräknas med användning av värden erhållna från supernatanten och cellysat som uppsamlats i steg 1,4 (figur 1).
Cell-lysat analyserades med användning av TLC visar en markant minskning av färgning av kolesterol i celler behandlade med ökande koncentration av MβCD (Figur 2A). Densitometri analys av TLC visar en liknande trend den kvantitativa analysen (Figur 2B). Den Bligh-Dyer-metoden ger en rå extract av totala lipider och det är viktigt att tillåta tillräcklig åtskillnad av lipider för att identifiera rätt bandet användning av kolesterol standarden.
Infektion
Efter att ha följt infektionsförfarandet förblir celler vidhäftade och intakt. Cell morfologi är oförändrad mellan behandlingsgrupperna. En kontrollgrupp som inte har utsatts för C. neoformans tjänar som en kontrollpunkt (Figur 3). Det är möjligt att få suboptimala resultat och kan manifesteras som lys av celler och andra onormala morfologier. Den mest sannolika orsaken är kontaminering av den cellinje eller reagens som används i förfarandet. Mikrofotografier av optimalt infekterade celler visar tydligt C. neoformans engulfed inom däggdjurscellerna. Skillnader i antal fagocytiserade jäst kan noteras genom observation mellan behandlingsgrupperna (Figur 4). Efter beräkning fagocytiska index från 300 makrofagceller per behandlingsgrupp enminskning fagocytisk index finns i kolesterol utarmat celler (Figur 5). Minskningen av fagocytiska indexet verkar inte vara beroende av eventuella skillnader i makrofagaktivering, även om de kan förekomma. Utföra infektionen i frånvaro av makrofag aktivatorer, men efter behandling med MCD resulterar i en liknande reduktion av fagocytisk index (data visas ej).
Trypan Blue
Trypan Blå färgning används för att bedöma lönsamheten av celler efter kolesterol utarmning. Ingen förändring av livskraften observeras mellan PBS behandlade och 10 mM MCD behandlade cellerna. Livskraft verkar släppa något efter behandling med 30 mM MCD, vilket kan förväntas på grund av den cirka 75% utarmning av kolesterol (en viktig lipid) observerades i densitometry analys (Figur 6 och Figur 2B).
Figur 1. Kolesterol innehållet i supernatanten efter Kvantifiering av kolesterol i supernatanten samlas in från behandlade celler behandling. Visar anrikning i MCD jämfört med 1x PBS. Kolesterol utarmning är 50 ± 5% beräknat från totalt kolesterol i 1x PBS (supernatanten + cellysat). Felstaplar visar standardavvikelsen (n = 5).
Figur 2. TLC av kolesterol i cellysat och densitometri. Bild av utvecklade TLC-platta visualiseras med MnCI2 förkolning. En markant minskning av kolesterol ses efter MβCD behandling (A). Densitometri analys av band i jämförelse med PBS-behandlade kontroll (visad som 100%) bekräftar trend hittades i Kolesterol kvantifiering analys (B Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Oinfekterade kontrollmikrofotografier av behandlade J774 makrofager. Bilder av oinfekterade J774 celler tagna vid 200 gångers förstoring. Skala bar är 50 pm. 1x PBS (A), 10 mM MβCD (B), och 30 mM MβCD (C) behandlade celler visar ingen förändring. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4. Infektion av J774 makrofager medC. neoformans Bilder från infekterade J774 celler tagna vid 400X (översta raden A.1 - C.1). Och 1,000X (nedersta raden A.2 - C.2) förstoring visas. Internaliserad C. neoformans celler visas som blå-violetta sfärer med en ljusare ring som omger dem. Celler behandlade med 1 x PBS (A), 10 mM MβCD (B) och 30 mM MβCD (C) visar på skillnader i C. neoformans upptag. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5. fagocyterande index. Fagocyterande index visas med avseende på kontrollgruppen som behandlades med PBS (Markerade vid 100 för jämförelse). Fagocytiska index minskade med 25% från 10mM MβCD behandling och med nästan 55% från 30 mM behandling. Felstaplar visar standardavvikelsen för medelvärdet (n = 4).
Figur 6. Cellviabilitet. Variationer i cellviabilitet genom trypanblått-analysen visar liten variation när man jämför alla tre behandlingsgrupperna. Det finns en liten minskning av i lönsamhet i 30 mM MβCD behandlingsgrupp, som kan förväntas från utarmning av en sådan viktig del av membranet. Felstaplar visar standardavvikelsen (n = 4).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I arbetet med detta protokoll är det viktigt att få exakta celltal vid plätering däggdjursceller och opsoniserande C. neoformans celler. Detta minimerar variationen mellan försöken och säkerställer en exakt 1: 1 målet till effektor-förhållande under hela studien. Det är också viktigt att samordna tidpunkten för kolesterol utarmning och infektion för att förhindra de opsoniserad jästceller eller behandlade makrofagceller från vila vid RT mellan förfarandena. Långa väntetider kan leda till förlust av Opsonisering eller påfyllning av utarmat kolesterol innan infektionen kan börja. Om försök görs med precision dataanalysen möjliggör slutsatser skall kunna urskiljas om rollen av kolesterol i fagocytos.
De begränsningar av tekniken förhindrar några slutsatser om den specifika mekanism genom vilken kolesterol utarmning sänker fagocytiska index för makrofagliknande celler, och det är oklart om den effect är direkt beroende på kolesterol eller på grund av en sekundär mekanism. Ytterligare arbete längs denna anda undersöker andra beståndsdelar i lipidaggregat såsom sfingolipider eller proteiner kända för funktion i fagocytos såsom Fcy-receptorn och komplementreceptor 3 2. Ändra denna teknik för att använda antingen Opsonisering eller komplement ensamt kunde hjälpa skilja en roll för kolesterol i en eller båda av dessa kända vägar. Det är också viktigt att komma ihåg att MβCD extraherar kolesterol baserat på dess hydrofobicitet och storlek, vilket steroler av liknande storlek kan också vara uttömda och kommer att migrera på en liknande takt som kolesterol på en TLC. Det är också viktigt att notera att kolesterol utarmning kan delvis påverka makrofagaktivering, är detta inte troligt att ansvara för skillnaden observerats i upptag som utför infektionen i frånvaro av IFN och LPS visar samma minskning av upptaget av C. neoformans (data ej visade), but det är av intresse när modifiera denna teknik för att studera antisvamp verksamhet makrofager och roll aktivering. Denna metod också tillåter oss inte att urskilja om kolesterol utarmning har några terapeutiska implikationer i svampinfektion. Ytterligare arbete in vivo med kolesterolsänkande läkemedel och epidemiologiska studier av patienter som använder kolesterolsänkande läkemedel kan ytterligare belysa en roll för kolesterol utarmning i behandlingen av sjukdomen och kan erbjuda ett mer selektivt sätt att hämma kolesterol ackumulering.
Detta förfarande skulle lätt kunna användas för att studera upptag av andra patogener eller fasta partiklar (dvs, glaspärlor) som fagocyterats och möjliggöra studier av grundläggande biologi fagocytos. Modifikationer kan möjliggöra för studiet av andra aspekter av fagocytos genom behandling av makrofagceller med enzymer för att selektivt nedbryta andra membrankomponenter eller olika läkemedel och inhibitorer som kan vara av interest. Det bör också noteras att flödescytometri kan utgöra en mer exakt och kvantitativt sätt att karakterisera fagocytos och kunde användas för att ersätta den direkta mikroskopiska räkningen 24. Sammantaget är detta en ganska enkel teknik som kan användas som utgångspunkt för mer djupgående studier som svarar på frågor om hur lipider kan spela en viktig roll i infektion och immunsvar.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Detta arbete stöddes av NIH bidrag AI56168, AI71142, AI87541 och AI100631 till MDP. Maurizio Del Poeta är Burroughs Wellcome Investigator i infektionssjukdomar.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Class II type A2 Biosafety Cabinet | Labconco | 3460009 | |
| J774A.1 cell line | ATCC | TIB-67 | Arrives Frozen. See ATCC instructions for culturing. |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium | Gibco | 11995-065 | Store at 4 °C and warm to 37 °C prior to use |
| HI Fetal Bovine Serum Performance Plus | Gibco | 10082-147 | Keep frozen at -20 °C and thaw before adding to DMEM |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/ml) | Gibco | 15140-122 | Used to suplement DMEM |
| Isotemp Cell culture incubator | Fisher Scientific | Model # 3530 | |
| 96-Well culture dish | Corning Inc. Costar | 3595 | |
| 10x Phosphate Buffered Saline | Fisher Scientific BioReagents | BP3994 | Dilute to 1x and filter or autoclave prior to use. |
| Methyl-β-cyclodextrin | Sigma Life Science | C4555-10G | Dissolve in 1x PBS to make solutions of 10 mM and 30 mM concentrations |
| Orbital shaker | Labline | ||
| Amplex Red Cholesterol Assay Kit | Life Technologies Molecular Probes | A12216 | All reagents for Cholesterol Assay are contained within the kit. Follow Manufacturer instructions. |
| 96-Well Black Assay plate | Corning Inc. Costar | 3603 | |
| FilterMax microplate reader | Molecular Devices | Model F5 | |
| TLC chamber | Sigma-Aldrich | Z126195-1EA | |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 650498-4L | |
| Methanol | Sigma-Aldrich | 34860-2L-R | |
| TLC Paper | Whatman | 3030917 | Cut down to size needed for TLC tank |
| Fume hood | Any fume hood that complies with AIHA/ANSI Standards | ||
| 6-Well plate | Corning Inc. Costar | 3506 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | |
| Cell scraper | Corning Inc. Costar | 3010 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1490 | |
| Centrifuge | Beckman Coulter | Model Alegra x-30R | |
| Votex mixer | Fisher Scientific | 12-812 | |
| Balance | Mettler Toledo | Model # MS104S meaures down to 0.1 mg | |
| Glass Pasteur pipette | Fisherbrand | 13-678-20A | |
| Cholesterol | Avanti Polar Lipids | 700000 | |
| SpeedVac concentrator | Thermo Scientific | Model # SPD2010 | |
| Petroleum ether | Fisher Scientific | E139-1 | |
| Diethyl ether | Sigma-Aldrich | 309966 | |
| Acetic acid | Sigma-Aldrich | 320099 | |
| TLC Silica Gel 60 with concentrating zone | Analytical Chromatograhy Millipore | 1.11845.0001 | |
| Iodine chips | Sigma-Aldrich | 376558-50G | |
| Sulfuric acid | Sigma-Aldrich | 320501 | |
| Manganese chloride | Sigma-Aldrich | 244589 | |
| UVP EC3 Imaging System | Ultra-Violet Products Ltd. | Use the Vision Works LS software for densitometry analysis | |
| Glass bottom confocal dish | MatTek | P35G-1.5-10C | www.glassbottomdishes.com |
| Cryptococcus neoformans (H99) | Obtained from Duke University Medical Center | ||
| YNB | BD | 239210 | See manufacturer for preparation instructions. Use a glucose concentration of 20 g/L. |
| Lipopolysaccharide | Sigma | L4391-1MG | Dissolve in 1x PBS to make 1 mg/ml stock. Store at -20 °C. |
| Interferon gamma | Sigma | I4777 | Dissolve in 1x PBS to make 0.1 mg/ml stock solution |
| Glucuronoxylomannan antibody (anti-GXM) | Gift from Arturo Casadevall's Lab concentration is 1.98 mg/ml | ||
| Giemsa | MP Biomedicals | 194591 | Dissolve 0.8 g of Giemsa in 25 ml of glycerol and heat to 60 °C for 1 hr. Add 25 ml of methanol to the solution and allow to age at room temperature for at least 1 month. |
| Microscope | Zeiss | Observer.D1 microscope with AxioCam MRm for taking images |
References
- Sarantis, H., Grinstein, S. Subversion of phagocytosis for pathogen survival. Cell Host & Microbe. 12 (4), 419-431 (2012).
- Rougerie, P., Miskolci, V., Cox, D. Generation Of Membrane Structures During Phagocytosis And Chemotaxis Of Macrophages: Role And Regulation Of The Actin Cytoskeleton. Immunological Reviews. 256 (1), 222-239 (1111).
- Liu, T., Perlin, D. S., Xue, C. Molecular Mechanisms Of Cryptococcal Meningitis. Virulence. 3, 173 (2012).
- Abadi, J., Pirofski, L. A Antibodies Reactive With The Cryptococcal Capsular Polysaccharide Glucuronoxylomannan Are Present In Sera From Children With And Without Human Immunodeficiency Virus Infection. The Journal Of Infectious Diseases. 180 (3), 915-919 (1999).
- Kechichian, T. B., Shea, J., Del Poeta, M. Depletion Of Alveolar Macrophages Decreases The Dissemination Of A Glucosylceramide-Deficient Mutant Of Cryptococcus Neoformans In Immunodeficient Mice. Infection And Immunity. 75 (10), 4792-4798 (2007).
- Casadevall, A. Cryptococci At The Brain Gate: Break And Enter Or Use A Trojan Horse. The Journal Of Clinical Investigation. 120 (5), 1389-1692 (1172).
- Chrétien, F., et al. Pathogenesis Of Cerebral Cryptococcus Neoformans Infection After Fungemia. The Journal Of Infectious Diseases. 186 (4), 522-530 (2002).
- Luberto, C., Martinez-Mariño, B., et al. Identification Of App1 As A Regulator Of Phagocytosis And Virulence Of Cryptococcus Neoformans. The Journal Of Clinical Investigation. 112 (7), 1080-1094 (1172).
- Mcquiston, T. J., Williamson, P. R. Paradoxical Roles Of Alveolar Macrophages In The Host Response To Cryptococcus Neoformans. Journal Of Infection And Chemotherapy: Official Journal Of The Japan Society Of Chemotherapy. 18 (1), 1-9 (2012).
- García-Rodas, R., Zaragoza, O. Catch Me If You Can: Phagocytosis And Killing Avoidance By Cryptococcus Neoformans. FEMS Immunology And Medical Microbiology. 64 (2), 147-161 (2012).
- Coelho, C., Bocca, A. L., Casadevall, A. The Intracellular Life Of Cryptococcus Neoformans. Annual Review Of Pathology. 9. 219, 10-1146 (2014).
- Rao, M., Peachman, K. K., Alving, C. R., Rothwell, S. W. Depletion Of Cellular Cholesterol Interferes With Intracellular Trafficking Of Liposome-Encapsulated Ovalbumin. Immunology And Cell Biology. 81, Doi. 415-423 (2003).
- Sein, K. K., Aikawa, M. The Prime Role Of Plasma Membrane Cholesterol. In The Pathogenesis Of Immune Evasion And Clinical Manifestations Of Falciparum Malaria. Medical Hypotheses. 51 (2), 10-1016 (1998).
- Pucadyil, T. J., Tewary, P., Madhubala, R., Chattopadhyay, A. Cholesterol Is Required For Leishmania Donovani Infection: Implications In Leishmaniasis. Molecular And Biochemical Parasitology. 133, 145-152 (2004).
- Tagliari, L., et al. Membrane Microdomain Components Of Histoplasma Capsulatum Yeast Forms, And Their Role In. Alveolar Macrophage Infectivity. Biochimica Et Biophysica Acta. 1818 (3), 458-466 (2012).
- Crane, J. M., Tamm, L. K. Role Of Cholesterol In The Formation And Nature Of Lipid Rafts In Planar And Spherical Model Membranes. Biophysical Journal. 86 (5), 2965-2979 (2004).
- Brown, D. A., London, E. Functions Of Lipid Rafts In Biological Membranes. Annual Review Of Cell And Developmental Biology. 14, 111-136 (1998).
- Simons, K., Toomre, D. Lipid Rafts And Signal Transduction Nature Reviews. Molecular Cell Biology. 1 (1), 31-39 (2000).
- Ilangumaran, S., Hoessli, D. C. Effects Of Cholesterol Depletion By Cyclodextrin On The Sphingolipid Microdomains Of The Plasma Membrane. The Biochemical Journal. 335 (Pt 2), 433-440 (1998).
- Bligh, E. G., Dyer, W. J. A Rapid Method Of Total Lipid Extraction And Purification). Canadian Journal Of Biochemistry And Physiology. 37 (8), 911-917 (1959).
- Mukherjee, S., Lee, S., Casadevall, A. Antibodies To Cryptococcus Neoformans Glucuronoxylomannan Enhance Antifungal Activity Of Murine Macrophages. Infect. Immun. 63 (2), 573-579 (1995).
- Deshaw, M., Pirofski, L. A. Antibodies To The Cryptococcus Neoformans Capsular Glucuronoxylomannan Are Ubiquitous. In Serum From HIV+ And HIV- Individuals. Clinical And Experimental Immunology. 99 (3), 425-432 (1995).
- Tripathi, K., Mor, V., Bairwa, N. K., Del Poeta, M., Mohanty, B. K. Hydroxyurea Treatment Inhibits Proliferation Of Cryptococcus Neoformans In Mice. Frontiers In Microbiology. 3, 187 (2012).
- Chaka, W., et al. Quantitative Analysis Of Phagocytosis And Killing Of Cryptococcus Neoformans By Human Peripheral Blood Mononuclear Cells By Flow Cytometry. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2 (6), 753-759 (1995).
