一种用于研究激素在人类乳腺中作用的ex vivo模型

摘要

我们开发了一种新型 离体 用于研究激素在人类乳腺中作用的模型。该模型基于从手术获取的乳腺组织标本中分离的组织微结构，可保留组织架构、细胞间相互作用及旁分泌信号传导。

摘要

人类乳腺中激素作用的研究因缺乏适当的模型系统而受到阻碍。 体外 培养过程中，原代乳腺上皮细胞 tends to lose 激素受体表达。常用的激素受体阳性乳腺癌细胞系对研究的 relevance 有限 体内 情况。在此，我们描述一种 离体 用于研究激素在人类乳腺中作用的模型。通过机械法和酶解法处理外科手术废弃的人类乳腺组织样本（如乳房缩小成形术或乳房切除术标本），获得包含导管、小叶及多种间质细胞类型的组织片段。这些组织微结构在不含生长因子的基础培养基中可维持数天，保持细胞间连接、组织架构以及对激素的响应能力。组织样本可直接用于RNA和蛋白质提取、组织学分析，或保存于冻存液中。荧光激活细胞分选（FACS）可用于富集特定细胞群体。本方案为利用高度复杂且多样化的临床人类组织样本开展转化医学研究提供了一种简便、标准化的方法。

引言

关于乳腺癌突变图谱的信息正在迅速增加。相比之下，影响乳腺癌发生发展的系统性因素受到的关注较少。生殖激素暴露对疾病进展具有重大影响^1-3。然而，生殖激素作用于人类乳腺的机制仍不清楚。利用基因工程小鼠模型的研究表明，这些机制涉及通过多个下游效应分子介导的细胞内在信号和旁分泌信号通路⁴。

关于激素在人类乳腺中作用机制的知识有限，主要归因于缺乏合适的模型。目前对雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）信号传导机制的研究大多使用激素受体阳性的乳腺癌细胞系，如 MCF-7 和 T47D。这些细胞系来源于已接受过多种治疗的晚期乳腺癌患者的胸腔积液。⁵. 此类简单模型中发现结果的生物学相关性 体外 人类乳腺模型的可靠性存疑，且在这些模型中鉴定出的靶基因 体外 模型与在动物模型中鉴定出的靶基因有所不同⁶当原代人乳腺上皮细胞被培养时 体外 它们往往失去激素受体表达，从而丧失激素应答能力^7,8.  该问题可通过使用Matrigel的复杂3D方法加以克服。通过该方法，C. Clarke及其同事成功建立了能够维持激素受体表达，并对孕酮刺激产生增殖反应的乳腺上皮细胞⁹然而，两个重要的 体内 孕酮受体靶基因 Wnt-4 和 RANKL在此系统中，黄体酮刺激并未诱....

方案

一般注意事项：提前制定伦理方案，准备患者问卷，并安排临床人员培训。在使用缩乳手术获取的组织材料前，需获得相关授权，并确保患者知情同意。组织可能具有传染性，应相应地进行处理。本方案已获得ISREC（瑞士实验癌症研究所）伦理委员会批准。

1. 组织回收、处理与生物样本库

为确保生物样本库的样本质量，在样本运送至实验室之前，医院需完成多个步骤。

在医院：

1. 在无菌条件下获取乳房缩小整形手术中的人类乳腺组织，如需要，同时采集血液样本。组织需由病理学家进行检查，取样以排除恶性病变的存在。
2. 将乳腺组织置于超净台内的无菌操作板上，准备好已通过蒸汽灭菌器灭菌的剪刀、手术刀和镊子。使用手术刀在乳腺组织的不同部位做深部切口以将其打开。在人类乳腺组织中，寻找由导管和小叶组成的白色条索状结构，这些结构嵌于黄色的脂肪组织中。
   注意：白色实质组织与黄色脂肪组织的比例因人而异；通常年轻女性含有更多的上皮组织。
3. 用镊子夹取白色组织碎片，并用剪刀小心地将其从脂肪组织中分离。避免夹取血管组织。
4. 用磷酸盐缓冲液（PBS）pH 7.2冲洗组织碎片以去除血液。将组织转移至含有F12培养基（Dulbecco改良Eagle培养基F12）的250 ml塑料瓶中，培养基不含酚红，并添加2%青霉素/链霉素（含5,000单位/ml....

结果

为了研究雌激素和孕激素的作用，并更好地理解它们在人类乳腺中的分子功能，我们在获得患者知情同意后，收集接受乳房缩小成形术患者的乳腺新鲜组织样本（图1）。我们同时获取患者的医疗史和生殖史，以及血液样本，以测定手术时的血清孕激素水平。来自新鲜乳房缩小成形术的组织通过机械和酶解方法进行解离。所获得的组织微结构包含具有乳腺组织来源特征的导管和小叶（图2A）。对琼脂糖和石蜡包埋的组织微结构进行免疫组织化学分析，使用肌上皮标记物ΔNp63染色（图2B），结果显示这些微结构不仅保留了正常乳腺组织的形态学特征，也保留了细胞群体的分子表达谱。

为评估激素反应，将组织微结构分别用合成的孕酮受体激动剂 promegestone（R5020）或乙醇对照处理。为了富集激素受体阳性的腔细胞，根据上皮细胞标记物（EpCAM）和肌上皮细胞标记物（CALLA；图 3A），在使用抗 CD31、抗 FAP 和抗 CD45 抗体混合物去除内皮细胞、成纤维细胞和免疫细胞后，进行流式细胞术分选.......

讨论

本文所述的ex vivo培养方法可获得包含完整导管和小叶的乳腺组织微结构，同时保留了正常存在于女性人类乳腺中的其他细胞类型。在处理通常来自乳房缩小成形术获取的人类乳腺组织时，通过去除脂肪组织、对基质进行机械和酶消化，以及裂解红细胞，可富集乳管片段和终末导管小叶单位。在适当的浓度和时间下进行温和的酶消化，对于确保组织微结构保持完整、保留多种细胞类型并最大程度地维持其细胞外基质至关重要。此外，组织一旦从患者体内取出，应尽快进行处理。不同患者的样本差异较大，当组织胶原含量特别高时，可能需要延长机械和酶消化时间，和/或添加额外的酶。

尽管微结构在长达6天内仍能保持90%的存活率，但该模型在长期激素刺激方面存在局限性。由于不同细胞类型的半衰期各不相同，细胞组成可能会随着时间推移而发生变化。虽然组织微结构能够保留浸润的免疫细胞，但由于组织已脱离机体循环系统，这些细胞无法得到补充。此外，由于患者间存在差异，需要分析大量样本，因此必须建立与提供手术标本的临床合作伙伴之间的稳定流程。组织微结构可被冷冻以供后续使用。然而，冷冻和解冻在多大程度上影响细胞活力（可能对不同细胞类型产生差异.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
微升离心机	Heraeus Biofuge Fresco	75005521
5810R 离心机	Eppendorf	5810 000.327
冻存盒	Nalgene	5100-0001
程序降温冷冻仪 EF600 Grant	Asymptote	EF600
CO2 培养箱	Hera Cell Heraeus	51022391
滚轴混合器 SRT9D	Sturt	SRT9D
组织学包埋盒	Medizintechnik	81-0021-00
细胞筛	Falcon	352340
斯特莱外科刀片	Aesculap	BB536
手术刀	Aesculap	BB084R
镊子	Aesculap	BD047R
剪刀	Aesculap	BC374R
石蜡底座模具	SAKURA	4166
最佳切割温度（OCT）冷冻包埋剂	Thermoscientific	6769006
青霉素/链霉素	Life Technologies	15070-063
抗生素/抗真菌剂	Life Technologies	15240-062
DMEM F/12	Life Technologies	11039-021	预热（37 °C）
胶原酶	Roche	11 088 793 001	预热（37 °C）
胎牛血清	Life Technologies	10270	可用新生小牛血清替代
红细胞裂解缓冲液	Sigma	R7757
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma	D2650
胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies	15400-054
琼脂糖	Invitrogen	16500-500
甲醛	Sigma	F1635
多聚甲醛	Roth	335
异戊烷	Sigma	M32631
乙醇	Merck	1009831000
冻存管（5.0 ml）	VWR, International	479-0820
超低吸附培养皿	Corning, NY 14831	3471