Introduction
Substantia nigra gelen dopaminerjik nöronların kaybı compacta Parkinson Hastalığı (PH), ikinci en yaygın nörodejeneratif bozukluk kardinal motor belirtiler neden pars. Bu mezensefalik nöronal nüfusun ölümü yatan nedeni bilinmemektedir. Kullanılmıştır geliştirilmesi ve nörofizyolojik özellikleri ve mesDA nöron, bir kaç hücre kültürü ve hayvan modeli sistemlerinde hayatta modüle edilmesi için sorumlu biyokimyasal yollar incelenmesi. Sıçan dopaminerjik hücre çizgisi 1RB 3, 27 (N27), insan dopaminerjik nöroblastoma hücre çizgisi SH-SY5Y, MN9D ve insan mezensefalik hücreleri LUHMES fare dopaminerjik melez hücre hattı olmak üzere ölümsüzleştirilmiş hücre çizgileri, biyokimyasal ve sınırlı mekanik çalışmalar 1 kullanılmaktadır -5. MesDA nöronların spesifik kaybı çalışmada, birkaç nörotoksin bazlı ve genetik modeller 6-8 geliştirilmiştir. Primer ventral orta beyin kültürlerDopaminerjik nöronlarının nöronal ve sinaptik özellikleri ve bu ortak hastalık patojenezinde rol yolları çalışmak için vazgeçilmez bir araç sağlar.
Burada daha yüksek yaşama şansına sahiptir her embriyo için lamelleri verim artışı ile sonuçlanan değişiklikleri içeren mezensefalik dopaminerjik nöronların izolasyonu için detaylı bir protokol mevcut. Önceden olgun E12.5 fare mezensefalona (sıçan E14.5) kullanımı beka geliştirir. Bu yaşta nöronlar diseksiyonu sırasında sağlam hücreleri bırakır, henüz akson geliştirilen ve böylece önemli ölçüde canlılığını arttırarak stresi en aza indirir değil. Ayrıca, bu protokolün 2. bölümünde açıklandığı gibi ventral orta beyindeki dikkatli diseksiyon, daha beka geliştirir. Embriyo başına lamelleri sayısını artırmak için, alternatif bir kaplama yöntemi, bu protokolün 4. bölümde sunulmuştur. Bu altında 4 lamelleri ile karşılaştırıldığında embriyo başına en fazla 10 lamelleri bir ürün verimine yol açarStandart kaplama koşulları dolayısıyla deney başına hayvan miktarını azaltarak.
Akson ve dentrites kültür sergi akıbet nöronlar, sinaptik bağlantıları oluşturmak ve canlı hücre görüntüleme, İmmünositokimya'da ve elektrofizyolojik çalışmalar için bu kültürlerin uygun hale nöronal ve sinaptik belirteçlerinin varlığını ortaya koymaktadır. Ayrıca, sinir hücresi kültürlerinde kullanılması genetik ve farmakolojik manipülasyonunu daha da kolaylaştırır. In vitro olarak 2 gün itibaren dışa doğru büyümesini geliştirme çalışmaları sağlar. Ayrıca, kültür uzun dönem hayatta kalmaları (en fazla altı hafta) bu nöronların yavaş ilerleyici dejenerasyonu çalışma için uygun hale getirmektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
NOT: hayvanlar muhafaza ve onaylanan kurumsal kurallar ve tüm hayvan prosedürlere uygun ele Imperial College'ın Hayvan Refahı tarafından edildi ve Etik İnceleme Vücut (AWERB) ve Ev Ofis ve Harvard Üniversitesi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC), Federal ve eyalet yönetmeliklerine uygun olarak.
1. Reaktif ve Ekipmanları Kurulum
- Çözülme, kısım ve -80 ºC mağaza 1 mg / ml laminin çözümü. 1-2 ug / cm2 'lik bir kaplama konsantrasyonunda elde edilen 1 ml DMEM / F12 içinde 2 ul çözülür.
NOT: yavaşça buz üzerinde ve plakaları / lamelleri eklemek hemen soğuk DMEM / F12 çözülür ve çözülme laminin. - 4 ° C'de 75 ml% 0.01 425 ml PBS Poly-ornitin L-ve mağaza içinde seyreltin.
NOT: Çalışma çözümün raf ömrü bir ay kadardır. - Bir ye kadar 4 ° C'de% 25 (ağırlık / hacim) PBS içinde BSA, pH 7.4, ve mağaza çözülürar.
- (HBSS)% 50 FBS devre dışı bırakma ortamı hazırlayın.
- (+) - - Glikoz (ağırlık / hacim),% 0.25 BSA (ağırlık / hacim), 50 U / ml penisilin ve streptomisin, 1 x N2 ek,% 5 (hacim / hacim) FBS,% 0.36 ilave edilmesi ile tam bir ortam hazırlama DMEM / F12 ve mağaza 4 ºC'de.
NOT: raf ömrü 10 gün kadardır. - En az 30 dakika boyunca% 70 (hacim / hacim) kaynayan etanol içinde yer lamelleri yağ ve otoklavın kalıntılarını gidermek için.
- Talep 24 oyuklu plakalarda lamelleri ve her bir oyuğa 500 ul Poli-L-ornitin solüsyonunu ilave edin. Oda sıcaklığında doku kültürü başlık altında 1 saat inkübe ve daha sonra 500 ul su ile 3 kez yıkanır. Her plaka için 500 ul, laminin solüsyonu eklenir ve 37 ° C'de, nemlendirilmiş bir doku kültürü inkübatörü içinde, O / N inkübe edin.
NOT: yıkamalar 24 saat kültürden sonra hücrelerin ölümü ile poli-L-ornitin en az üç kez yıkama sonuçlarını laminin tedaviden sonra gerekli olsa da. - Doğal gaz veya meşale f üzerinde cam pipetler ipuçları parlatmaktopal.
NOT: Bu adımdan sonra ucu çapı normal boyutunun yaklaşık yarısı olmalıdır. - Bir otoklav makas ve otoklav kullanarak, bir 1.5 ml mikrosantrifüj tüpleri kapakları kesilir.
Embriyonik ventral orta beyindeki 2. Diseksiyon
- Uyuşturmak zamanlanmış-gebe (E12.5) CO 2 inhalasyon yoluyla barajlar ve daha sonra servikal dislokasyon ile euthanize.
- % 70 etanol ile karın Sprey ve rahim keseler tüm maruz kadar bir karın kesi yapmak. Forseps vajinal eki kesme ve rahim kaldırmak. 100 mm Petri kabındaki, buzla soğutulmuş HBSS rahim yerleştirin.
- Forseps (Şekil 1C) kullanarak, rahim ve amniyon kesesi embriyolar çıkarın. Buzla soğutulmuş HBSS yer embriyolar.
NOT: Şekil 1D dikdörtgen embriyonik ventral orta beyindeki yerini gösterir. - Bir diseksiyon mikroskobu (10x büyütme) altında embriyolar yerleştirin ve mezensefalik teşrih, berzah ve mezensefalik-diensefalik sınır bölgesinde beyin kesme bioscissor ve forseps kullanarak kemer (Şekil 1E, kesi hatları için 1A Şekil bakınız).
- Tüm Ortabeyin dışarı aldıktan sonra, mediodorsal orta beyin (Şekil 1F) bir kesim yapmak.
- İki forseps (Şekil 1 H) kullanarak, meninksler çıkarın.
NOT: KRİTİK ADIM: Bu adım, optimum verim ve nöronal hayatta kalmak için gereklidir. Kültür şartları, beyin hücreleri için uygun olduğu için, çevreleyen dokudan hücrelerin en kaplamadan sonra ölür ve bu dokudan apoptotik sinyal kültürlerinin bütünlüğüne zarar verebilir. - Bir sterilize tıraş bıçağı (Şekil 1 H, I) kullanılarak, kelebek şekli gözlemlemek ve her kanat yaklaşık yarısını kesmek için Petri kabı orta beyin doku düzeltin.
NOT: Şekil 1J izole ventral Ortabeyin göstermektedir. - Transferi15 ml konik tüp buz-soğuk HBSS içine ventral orta beyindeki parça ve bir sonraki embriyo devam edin.
NOT: 2,1-2,8 fazla 1 saat almamalıdır adımlar. Buz üzerinde bu zaman dilimi dışında embriyolar tutulması önemli ölçüde hücre canlılığını azaltır.
Ventral Orta beyin hücrelerinin 3. Ayrılma
- Laminer akış kaputun altında ventral orta beyindeki parçalarını aktarın. HBSS çıkarın ve (ventral orta beyindeki kadar 12 adet yeterli hacim) konik tüp içine önceden ısıtılmış, 1 ml (37 ° C),% 0.05 tripsin-EDTA ekleyin. 5-10 dakika süreyle 37 ° C'de doku inkübe edin.
- Kaputun altında tripsin-EDTA çıkarın ve doku 1 ml de-aktivasyon orta (serum tripsin devre dışı bırakır) ekleyin.
- Devreden Ortamı çıkarın ve iki kez tam bir ortam 1 ml doku yıkayın.
Not: ayrışmış hücreleri atmadan önlemek için, boru tüm orta çıkarılması ve doku pipetleme kaçının. - 1ml tam orta ve trit ekleBir yangın cilalı cam pipet ile doku ürat. Kabarcıkların oluşumunu önlemek ve tek hücre süspansiyonu elde edilinceye kadar triturating devam edin.
NOT: Genellikle 8-10 tam ayrışması için gerekli olan kısıtlı ucu geçer. - Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 400 x g'de santrifüj hücreleri ve ortam maddesinin ayrılması.
- Yeniden askıya yavaş yavaş pipetleme tam orta 1 ml pelet ve aşağı yukarı dört kez.
4. Kaplama Ventral Orta beyin Hücreler
- 90 ul Trypan mavi çözeltisi ile hücre süspansiyonu, 10 ul karıştırın ve bir hemositometre ile hücre sayısı.
Not: Hücrelerin canlılığı, aynı zamanda, bu aşamada kontrol edilebilir. - Kapaklar üzerine her seferinde bir forseps, birini kullanarak, 100 mm Petri tabaklarda steril mikrosantrifüj tüpü kapaklar yerleştirin ve Poli-L-ornitin / laminin kaplanmış lamelleri aktarın.
NOT: lamelleri yıkamayın ve bu uneve neden olabilir çünkü, laminin kurumasını önlemekN kültürleri ve hücre hayatta kalma azalma. - (Hacim harcanmadan, lamel yüzeyini kaplamak için uygun olan) tam orta eklenerek 1 ul başına 1500 hücre hacmini ayarlamak ve her bir lamel üzerine hücre süspansiyonu 100 ul (150,000 hücrelerin toplam) ekleyin. Nemlendirilmiş bir doku kültürü kuluçka makinesi içinde Petri kapları kapatın ve 1 saat süre ile inkübe (37 ° C,% 5 CO2).
Not: KRİTİK ADIM: Bu adım, hücre eki ve canlılığını geliştirmek için ve her embriyo için lamelleri sayısının arttırılması için gereklidir. Seçenek olarak ise, hücreler direkt olarak oyuklara (ihtiva lamelleri), ancak hücre sayısı (yerine 150,000) oyuk başına 350,000 artırılmalıdır aktarılabilir. Doğrudan transferi nedeniyle (yanında veya lamelleri altında) plakaları takmak hücrelerin, yaklaşık 3-4 lamelleri verir iken, diğer bir deyişle, bu yöntemi kullanırken, 8-10 lamelleri, elde edilebilir. Ortalama viabiliBu yöntemi kullanarak, kültürlerin Ty, yaklaşık% 90 idi.
5. Kültür Büyüme ve Bakım
- Inkübasyondan 1 saat sonra, dikkatli bir şekilde 400 ul önceden ısıtılmış (37 ° C kadar) tam bir ortam ihtiva eden 24 oyuklu plakalar içinde ortam dahil olmak üzere lamelleri transferi (toplam hacim: 500 ul). 37 ºC hücreleri O / N inkübe.
- Kuyular inkübasyonundan sonra, 24 saat içinde yavaşça, her bir oyuğa 500 ul komple ortam ekleyin.
Not: ilk birkaç saat dopaminerjik nöronların hayatta kalma ve bu noktadan sonra önemli ölçüde değişmez hayatta kalan hücrelerin sayısı en kritik aşamadır. - İlk iki hafta için veya orta sarı olana kadar kültürlere ek ortam eklemeyin. Iki haftadan daha uzun veya taze tam önceden ısıtılmış medya (genellikle her iki hafta) sarı, medyanın değişim yarısı (500 ul) orta renk değişiklikleri için kültürleme edin.
NOT: içinde dopaminerjik nöronlarkültürler bu koşullar altında daha 6 hafta boyunca hayatta olurdu.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Tirozin hidroksilaz (TH) karşı İmmünohistokimya kültürdeki hücre 0.5-1 arasında,% dopaminerjik olduğunu göstermektedir. Tirozin hidroksilaz (TH) ve mikrotübül ilişkili protein 2 (MAP2) antikorları (Şekil 3) kullanılarak, nöronal projeksiyonları kaplama sonra 2 saat içinde ortaya çıkar ve ilk gün, akson ve dendritler ayırt (Şekil 2). nöronlar fazla altı hafta boyunca hayatta ve kapsamlı akıbet göstermektedir. daha önce gösterildiği gibi kültürler nöron-glia oranı doğrudan ortam içinde serum konsantrasyonları ile ilişkilidir. Nispeten saf nöronal kültürler verebilir kültürlerden FBS ortadan birlikte, ve diğerleri, serum ilavesi kültür 9 dopaminerjik nöronların hayatta kalmasını arttırdığını bulduk.
Izolasyonu için 1. Prosedür Şekilventral orta beyindeki diseksiyonu kırmızı dikdörtgen (A) ve araçları içinde embriyonik ventral orta beyin. E12.5 fare beyin şematik görünümü, orta beyin sınırları (kesikli çizgiler), ve ilgi bölgenin yaklaşık konumu, ventral orta beyin, Bir bioscissor, foreceps, ve bir bıçak tutucusu (B) gösterilmektedir. Embriyolar bu (C) koparılması suretiyle amniyon kesesi dışarı alınır. faiz, ventral orta beyindeki bölgesi, dikdörtgen (D) ile gösterilir. Orta beyin (kesme parçasının sol) berzah ve (; E sağ) orta beyin-ön beyin sınırında kesim tarafından izole edilir. orta beyinin mediodorsal kısmı kelebek şekli (G, H) benzemeye, (F) kesilip ve düzleştirilir. Daha sonra, beyin zarları beyin (H) ve ventral orta beyindeki (dikdörtgen) bir traş bıçağı kullanılarak, kanatların yarısı keserek sırt parçası izole edilir aynldılar
Şekil ventral orta beyin kültürlerin 2. Temsilcisi aydınlık görüntüler. Görüntüler DIV1 (solda) alınmıştır, DIV2 (merkez), ve DIV15 (sağda). Ölçek çubuğu:. 50 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Şekil 3. Uzun süreli sağkalım, iki hafta o süreçlerin sonucudur ve sinaptogenezld ön orta beyin kültürleri. Orta beyin dopaminerjik nöronları, tirozin hidroksilaz antikor tarafından tanımlanan iki hafta E12.5 embriyolar ayrışma sonrasında ön orta beyin kültürleri, MAP2 antikor tarafından tanımlanan geniş aksonlar ve dentritler yetişmektedir. Dendritler sadece Th-pozitif lifler aksonlarını temsil Th ve MAP2-pozitif süreçleri, örtüşme ile ayırt edilebilir. 200: Antikorlar 1 bir seyreltide kullanıldı. Ölçek çubuğu:. 20 mikron bu rakamın daha büyük bir versiyonunu görmek için burayı tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Orta beyin dopaminerjik nöronları, merkezi sinir sisteminde dopamin ana kaynağıdır. Üç gruba ayrılır, substantia nigra pars compacta (SNpc), ventral tegmental alan (VTA) ve retrorubral alanı (RRF), 10, 11. SNpc ve VTA'da nöronlar gibi duygu, motivasyon ve motor davranışlarının kontrolü gibi işlevleri dahil, mezokortikal mezolimbik ve nigro-striatum büyük dopaminerjik yollar, yol. SNpc ve nigrostriatal sistemi fonksiyonel bozulma nöronların ölümü, ikinci en önemli nörodejeneratif bozukluk, Parkinson hastalığı (PD), 12,13 temel patolojik özelliğidir. Güncel tedavi yaklaşımları hastalığın belirtilerini ele ve durdurmak veya dejenerasyonu yavaşlatabilir ve yavaş, ilerleyici hücre kaybı nedenleri hala 14-16 bilinmemektedir yok. Bu nedenle, in vivo ve Kalkınma çalışması için in vitro teknikleri geliştirilmesintal, biyokimyasal, ve bu nöronal nüfusun fizyolojik özellikleri PD ve yeni tedavi yaklaşımlarının gelişimine etyolojisi anlamak için zorunludur.
Burada, böyle farklılaşması, akson gibi işlemler çalışma sağlayan, teşrih, çözünme ve bu bölgeden dopaminerjik nöronların in vitro yaşam için uzun vadede sonuçları embriyonik fare ve sıçan ventral orta beyin, birincil nöronların kültür için optimize edilmiş bir yöntemi tarif akıbet ve sinaps oluşumu. Bu protokolün birçok avantaj nöronlar 4 gelişimini en üst düzeye artan embriyo başına lamelleri sayısı, bağımsızlığını büyüme faktörleri gelen ve in vitro hayatta kalma süresini içerir. Bu yöntem, bu nöron ilerleyici dejenerasyonu gibi orta beyin dopaminerjik nöronları, normal fizyolojik fonksiyonları mekanizmasının anlaşılması için izin üzerindeki in vivo çalışmaları tamamlayabilirParkinson hastalığının sitotoksik ve genetik modeller al popülasyonu.
Bu protokolün temel sakıncalarından biri SNpc ve VTA dopaminerjik nöronlar arasındaki ayrımın olmaması. Bu sorun, kültür (E12.5 farelerde veya E14.5 sıçanlarda) nöronların terminal farklılaşmasına anda mevcut ve bölgeselleştirme tam değildir ve daha büyük embriyoların kullanılması mümkün olsa da, bu önemli ölçüde hayatta kalmasını azaltır Axotomy nedeniyle nöronlar. Iki popülasyonun ayırt gibi GIRK2 her populasyonu için spesifik belirteçleri karşı antikorlar kullanılarak, bağışıklık kimyası mümkün olacaktır (SNpc nöronlar belirlemek için) ve Kalbindin 17 (VTA nöronlar belirlemek için).
bölüm 4'te tarif edilen optimize edilmiş kaplama fazla% 50 oranında, deney başına embriyo miktarını azaltır ve bu nedenle, araştırmada hayvan kullanımına azaltılmasına katkıda bulunur. kült yaşama en kritik adımlaryanı sıra meninkslerin tam çıkarılması (basamak 2.6, Şekil 1H) - ures barajların euthanization ve embriyonik midbrains (2.8 2.1 adıma) tam diseksiyonu arasındaki zaman vardır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco's modified Eagle medium nutrient mixture F-12 | Invitrogen | 11330 | |
| Hanks' Balanced Salt Solution (HBSS) (1X), liquid | Invitrogen | 24020-117 | |
| Fetal bovine serum, heat-inactivated (FBS) | Invitrogen | 16140 | |
| N2 Supplement (100X), liquid | Invitrogen | 17502-048 | |
| D-(+)-Glucose solution (45% (wt/vol) in water | Sigma | G8769 | |
| Bovine serum albumin BSA | Sigma | A9430 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma | L2020 | |
| Penicillin/streptomycin | Invitrogen | 15070 | |
| Trypsin (0.05% (wt/vol) | Invitrogen | 25300 | |
| Bovine serum albumin (BSA) cell culture tested | Sigma | A9418 | |
| Phosphate-buffered saline (PBS) | Sigma | P3813 | |
| Anti-Tyrosine hydroxylase (Th) antibody | Pel-Freez Biologicals | P60101-0 | |
| Poly-L-ornithine, 0.01% solution | Sigma | P4957 | |
| Anti-Map2 (Microtubule associated protein-2A and -2B) antibody | Millipore | MAB3418 | |
| Anti-Synapsin-1 antibody | Millipore | AB1543P | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21206 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-rabbit IgG antibody | Molecular Probes | A-21207 | |
| Alexa Fluor 488 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-sheep IgG antibody | Molecular Probes | A-11016 | |
| Alexa Fluor 594 donkey anti-mouse IgG antibody | Molecular Probes | A-21203 | |
| Trypan blue solution (0.4% (wt/vol)) | Biowhittaker | 17-942E | |
| Stereo Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000-C | |
| Inverted phase contrast microscope | Carl Zeiss | Axiovert 40 C | |
| Dumont Forceps | Fine Scientific Tools | May-45 | |
| Cover Slip Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11251-33 | |
| Two Dumont #45 Forceps – Dumoxel | Fine Scientific Tools | 11245-30 | |
| Blade Holder/Breaker Flat Grip - 11cm | Fine Scientific Tools | 10052-11 | |
| Student Iris Scissors - Straight 11.5 cm | Fine Scientific Tools | 91460-11 | |
| Fiber optic halogen illuminator | Nikon | MKII | |
| Disposable Borosilicate Glass Pasteur Pipettes | Fisherbrand | 13-678-20C | |
| Hemocytometer | Proscitech | SVZ2NIOU | |
| 0.2 µm sterile filter units | Nalgene | NL-CE-156-4020 | |
| 100x20 mm Petri dishes | BD Biosciences | 351005 | |
| Round Cover Slip #1 Thickness German Glass 12 mm | Bellco Glass | 1943-10012 |
References
- Prasad, K. N., et al. Establishment and characterization of immortalized clonal cell lines from fetal rat mesencephalic tissue. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 30A, 596-603 (1994).
- Fall, C. P., Bennett, J. P. Characterization and time course of MPP+ -induced apoptosis in human SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurosci Res. 55, 620-628 (1999).
- Choi, H. K., Won, L., Roback, J. D., Wainer, B. H., Heller, A. Specific modulation of dopamine expression in neuronal hybrid cells by primary cells from different brain regions. Proc Natl Acad Sci U S A. 89, 8943-8947 (1992).
- Alavian, K. N., Sgado, P., Alberi, L., Subramaniam, S., Simon, H. H. Elevated P75NTR expression causes death of engrailed-deficient midbrain dopaminergic neurons by Erk1/2 suppression. Neural Dev. 4, 11 (2009).
- Chung, C. Y., et al. The transcription factor orthodenticle homeobox 2 influences axonal projections and vulnerability of midbrain dopaminergic neurons. Brain. 133, 2022-2031 (2010).
- Betarbet, R., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. Animal models of Parkinson's disease. Bioessays. 24, 308-318 (2002).
- Schober, A. Classic toxin-induced animal models of Parkinson's disease: 6-OHDA and MPTP. Cell Tissue Res. 318, 215-224 (2004).
- Chesselet, M. F., Richter, F. Modelling of Parkinson's disease in mice. Lancet neurology. 10, 1108-1118 (2011).
- Takeshima, T., Johnston, J. M., Commissiong, J. W. Mesencephalic type 1 astrocytes rescue dopaminergic neurons from death induced by serum deprivation. J Neurosci. 14, 4769-4779 (1994).
- Sgado, P., et al. Slow progressive degeneration of nigral dopaminergic neurons in postnatal Engrailed mutant mice. PNAS. 103, 15242-15247 (2006).
- Alavian, K. N., et al. The lifelong maintenance of mesencephalic dopaminergic neurons by Nurr1 and engrailed. J Biomed Sci. 21, 27 (2014).
- Simon, H. H., Bhatt, L., Gherbassi, D., Sgado, P., Alberi, L. Midbrain dopaminergic neurons: determination of their developmental fate by transcription factors. Ann N Y Acad Sci. 991, 36-47 (2003).
- Bjorklund, A., Dunnett, S. B. Dopamine neuron systems in the brain: an update. Trends Neurosci. 30, 194-202 (2007).
- Dauer, W., Przedborski, S. Parkinson's disease: mechanisms and models. Neuron. 39, 889-909 (2003).
- Dexter, D. T., Jenner, P. Parkinson disease: from pathology to molecular disease mechanisms. Free Radic Biol Med. 62, 132-144 (2013).
- Schapira, A. H. Aetiopathogenesis of Parkinson's disease. J Neurology. 258, S307-S310 (2011).
- Chung, C. Y., et al. Cell type-specific gene expression of midbrain dopaminergic neurons reveals molecules involved in their vulnerability and protection. Hum Mol Gen. 14, 1709-1725 (2005).
