Summary
L'objectif du présent Protocole est de développer une méthode qui permettra aux analyses de génomique fonctionnelle de la sécrétion des mastocytes. Le protocole est basé sur l'évaluation quantitative de la libération d'un gène rapporteur fluorescent cotrasfected avec le gène d'intérêt et des analyses en temps réel de la morphologie du granule sécrétoire.
Abstract
Mastocytes (MC) sont des cellules sécrétoires du système immunitaire qui accomplissent leurs fonctions physiologiques et pathologiques en libérant des médiateurs allergiques, inflammatoires et immunorégulateurs préformés et nouvellement synthétisés. Les médiateurs de MCs affectent plusieurs tissus et organes aboutissant à des réactions allergiques et immunitaires. La synthèse, le stockage et la libération des médiateurs MC sont très réglementés. Les médiateurs préformés sont emballés dans des granules sécrétoires cytoplasmiques (SG) qui fusionnent avec la membrane plasmique et libèrent leur contenu par exocytose régulée. Nous présentons un protocole basé sur la co-expression d'un gène d'intérêt avec un gène rapporteur qui est ciblée pour la GV et est libéré de manière régulée à côté des médiateurs endogènes SG. Le protocole permet haute résolution confocale quatre dimensions analyses de la MC SG et le suivi de leur calendrier de biogenèse d'exocytose déclenché. Ainsi, en utilisant ce protocole pour le dépistage de gènes entreEST pour leur impact phénotypique et fonctionnelle permet de déchiffrer les mécanismes moléculaires qui régissent la biogenèse et l'exocytose de la MC SG et l'identification des organismes de réglementation concernés. Ainsi, de nouvelles informations sur les mécanismes cellulaires qui représentent fonction MCs en matière de santé et de la maladie devraient être fournis.
Introduction
Mastocytes (MC) sont des cellules immunitaires qui sont les mieux connus pour leur implication dans des réactions allergiques et inflammatoires telles que l'arthrite, l'asthme, l'oesophagite à éosinophiles, la dermatite chronique et choc anaphylactique 1,2 ainsi que d'autres pathologies dont la maladie coronarienne et 3,5 le cancer 3,4. En outre, MCs jouent un rôle important dans l'immunité innée et adaptative, tant en défense de l'hôte contre les bactéries et les parasites et par la suppression de la réponse immunitaire, par exemple induire la tolérance 5,6 allogreffe.
MC proviennent de la moelle osseuse, le développement du CD34 + / CD117 + cellules progénitrices pluripotentes 7. Engagé moelle osseuse MC progéniteurs sont libérés dans la circulation sanguine et migrent dans les tissus périphériques de localisation principalement dans les tissus conjonctifs et les surfaces épithéliales 8. Maturation et différenciation terminale sont finalement atteints sous l'influence of cytokines au sein du milieu environnant de 8,9.
MCs peuvent être activés par un allergène (antigène, Ag), dont la rencontre entraîné la production d'immunoglobuline E (IgE) de type anticorps. La liaison d'une telle IgE aux récepteurs FceRI de la MC, suivie par une reticulation de cellule IgE liée à une nouvelle exposition à la même Ag, conduit à l'agrégation FceRI et l'initiation d'une cascade de signalisation qui aboutit à la dégranulation cellulaire [commentaire à 10,11] . MCs sont également activés, indépendamment des IgE, par neuropeptides 5,12, les toxines 13, bactérienne et antigènes viraux 14,15, un certain nombre de peptides chargés positivement collectivement dénommées sécrétagogues de base, cellules immunitaires et de cytokines 5,13,12,16 , 17. MCs sont également activés par beaucoup de leurs propres médiateurs libérés, qui amplifient encore la réponse inflammatoire.
MCs sont emballés avec des granules sécrétoires (SGS) qui contiennent immunomédiateurs réglementaires, y compris des amines vasoactives telles que l'histamine et de la sérotonine (chez les rongeurs), des protéoglycanes, des proteases telles que la tryptase et la chymase, facteur de croissance vasculaire endothéliale et de plusieurs cytokines et de chimiokines 8,9. Ces médiateurs sont "prêt à aller" et une fois MCs sont activées par un stimulus approprié, ces médiateurs sont libérés des cellules par exocytose régulée (de dégranulation) dans une affaire de secondes à quelques minutes 18,19. Cet événement initial est suivi de la synthèse de novo et la libération d'un large éventail de substances biologiquement puissants, y compris les metabolites de l'acide arachidonique, de multiples cytokines et de chimiokines 20,21,22. Libération de produits nouvellement synthétisés se produit indépendamment de presse SG. Collectivement, ces médiateurs initient précoce et la phase tardive réponses inflammatoires et allergiques. Par conséquent, la compréhension des mécanismes responsables de l'activation et de la dégranulation MC sont deux imp théorique et cliniqueOrtance.
La difficulté de manipuler génétiquement MCs primaires et de culture a entravé les tentatives pour élucider les mécanismes sous-jacents MC dégranulation qui sont encore mal résolus. Pour surmonter ce problème, nous avons développé un dosage à base rapporteur par co-transfection de la lignée cellulaire de la muqueuse de mât, rat leucémie basophiles (RBL) -2H3 (ci-après dénommé RBL) ou de moelle osseuse dérivés MCs (BMMCs) 30 avec un gène d'intérêt et neuropeptide Y (NPY) fusionné à DP monomère (mRFP), en tant que journaliste de SG.
NPY a déjà été démontré de récapituler le comportement des marqueurs de SG endogènes dans d'autres systèmes. En outre, parce que mRFP fluorescence est insensible au pH, l'expression de NPY-mRFP permet la visualisation des acides SG ainsi que l'évaluation quantitative de l'exocytose en utilisant des plaques à 96 puits et un lecteur de plaque à fluorescence. Nous avons montré que NPY-mRFP est livré à SGS acides de cellules RBL et BMMCs et est libérée par les cellulesd'une manière réglementée aux côtés de la cargaison de SG endogène (ce est à dire, β-hexosaminidase et la sérotonine) 30, 32. Ce protocole fournit une méthodologie basée imagerie à haute résolution qui permet de criblage de gènes d'intérêt pour leur phénotypique et fonctionnel incidence sur les caractéristiques de SG et la dégranulation dans des cellules RBL 32. Plus précisément, ce protocole permet un suivi en temps réel de MC SG et la quantification de leur zone de volume ou la taille, le nombre, la cinétique de l'assemblage, leur mouvement le long du cytosquelette de la cellule et leur fusion ultime avec la membrane plasmatique dans des conditions différentes. Par exemple, la sensibilisation des cellules avec DNP-IgE spécifique et déclencher les cellules avec un Ag multivalent (DNP de l'albumine de sérum conjugué) sous différentes perturbations (c.-à-knockdown de gènes d'intérêt, sur l'expression de gènes wt ou mutants, ou des manipulations pharmacologiques) et la comparaison aux cellules témoins.
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Protocol
1. Préparation de RBL Culture Cellulaire médias
- Mélanger 500 ml de milieu de Eagle modifié par Dulbecco faible taux de glucose (DMEM) avec 56 ml de sérum de veau fœtal (cela fait 10% de FBS), puis ajoutez 5,5 ml de pénicilline streptomycine (ce qui rend ~ 1% PEST).
- Filtrez les médias en utilisant 500-1000 ml Bottle-Top filtres à vide avec 0,22 um taille des pores et conserver à 4 ° C.
2. Culture de cellules RBL
- Cultiver les cellules RBL dans une atmosphère humidifiée de 5% de CO2 à 37 ° C, dans des plaques ou flacons. Cellules RBL qui gagnent en plaques de 10 cm doivent être complétés par 10 ml de milieu et forment monocouche confluent de ~ 10 7 cellules / plaque.
- Lorsque la couche cellulaire se approche de la confluence, Réensemencement la culture à une densité inférieure.
- Retirer le milieu de culture à partir de la plaque / fiole à l'aide d'une pipette Pasteur stérile raccordée à vide.
- Rincer la monocouche cellulaire avec préchauffé (37° C) 0,25% de trypsine / EDTA qui couvre l'ensemble monocouche (le volume dépend de la taille de la plaque de culture / flacon; 2 ml pour 10 cm de plaque). Cela détacher les cellules.
- Sinon, laver la monocouche cellulaire avec tampon phosphate salin (PBS), retirez le PBS et ajouter préchauffé (37 ° C) de la trypsine / EDTA. Cette étape détache les cellules plus rapidement.
- Placer la plaque / fiole dans un incubateur à 37 ° C (pas plus de 10 min).
- Inspectez les cellules sous le microscope optique pour vérifier se ils ont détaché. Si les cellules ne se détachent au bout de 10 min, appuyez doucement sur la plaque / flacon.
- Ajouter moyen de la plaque de culture / flacon de suspendre les cellules (le volume du milieu doit être au moins 2 fois supérieur au volume de la solution de trypsine).
- Pellet les cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 200 g à 25 ° C.
- Resuspendre les cellules dans un milieu. Diluer les cellules en 1h10 et épépiner dans une nouvelle boîte de culture. Incuber les cellules pendant 48 à 72 h, jusqu'à ce qu'ils REACh environ 90% de confluence.
- Répétez la même procédure (section 2.2.1-2.2.8) pour un maximum de trois mois (30 passages).
3. Préparation de transfection médias.
- Préparer une solution de 100 mM pH 7, solution 1 mM de Ca2 + et de la solution de l'acétate 100 mM d'acétate de Mg 2+ K Pipes.
- Diluer la solution 100 mM de K Pipes à pH 7 en utilisant 20 mM de milieu DMEM, ajouter la solution de 1 mM de Ca 2+ de l'acétate à une concentration finale de 10 uM et une solution 100 mM de Mg 2+ acétate à une concentration finale de 2 mM.
- Peser potassium glutamate et l'ajouter à la solution à une concentration finale de 128 mM, bien mélanger et maintenir à 4 ° C jusqu'à utilisation. Gardez les solutions restantes (ie., K-Pipes, Ca 2+ acétate, Mg 2+ acétate) à -20 ° C.
4. Transfection de cellules RBL
- Retirer le milieu de culture à partir de la plaque / fiole au moyen d'unpipette pasteur stérile connecté à vide.
- Rincer la monocouche cellulaire avec préchauffé (37 ° C) de la trypsine / EDTA qui devrait couvrir l'ensemble monocouche. Placer la plaque / fiole dans un incubateur à 37 ° C (pas plus de 10 min). Vérifiez si les cellules ont détaché en utilisant le microscope optique.
- Ajouter moyen de la plaque de culture / flacon de suspendre les cellules (le volume du support doit être au moins de 2 plus grande et plus que le volume de la solution de trypsine).
- Comptez le nombre de cellules en utilisant hémocytomètre.
- Pellet 1,5 × 10 7 cellules par centrifugation pendant 3 minutes à 200 x g à 25 ° C. Jeter le surnageant et ajouter 280 ul de milieu de transfection. Transférer le mélange de réaction dans 4 mm cuvette.
- Ajouter 20 pg de NPY-mRFP plasmide et soit 30 ug du contrôle plasmide vide ou un plasmide testé. Le volume final du mélange de réaction doit être de 300 ul.
- Placer immédiatement sur de la glace pendant 10 min. Essuyer la cuvette de l'eau résiduelle et procéder à une électroporation à 300 V pendant 9 ms.
- Pour les mesures de l'exocytose, Réensemencement les cellules immédiatement dans 24 des boîtes de culture tissulaire puits contenant 300 ul de milieu. Ajouter 8 ul du mélange de réaction (4 × 10 5 cellules) dans chaque puits. Ajouter cellules 4 × 10 5 non transfectées à des puits supplémentaires pour le contrôle. Préparer suffisamment de puits pour avoir au moins des puits en double pour chaque traitement pour chaque transfection.
- Par microscopie laps de temps, immédiatement Réensemencement les cellules dans un système de lamelle chambre borosilicate 8 puits contenant 80 ul de milieu. Ajouter 1,5 pi de mélange réactionnel (7,5 × 10 4 cellules) pour chaque chambre. (Essayez d'éviter d'utiliser les chambres au bord de la lamelle, les chambres au centre de la lamelle sont plus faciles à l'image).
NOTE: Il est important, toutes les cellules de réponse de pas à un déclencheur et parfois la microscopie time-lapse est abrogée en raison de perte de concentration et de la dérive de la borosi de chambre 8 puitssystème de lamelle licate. Par conséquent, préparer au moins 8 chambres pour chaque traitement pour chaque transfection. - Pour sensibiliser les cellules pendant l'activation médiée par FceRI, ajouter 1 ug / ml de DNP monoclonal de souris spécifique des IgE à la presse (incuber les cellules avec des IgE pendant au moins 2 h).
- Après 18 à 24 h utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer que les cellules expriment les plasmides. Les excitation et d'émission des longueurs d'onde de la fluorescence mRFP sont: Xex 584, Xem 607 nm. NPY-mRFP devrait apparaître dans des structures vésiculaires qui correspondent aux SG. Si le second gène d'intérêt est fusionnée à un marqueur fluorescent utiliser un microscope à fluorescence pour confirmer la co-expression des deux plasmides dans les mêmes cellules. Par exemple, si le gène testé est fusionné à la GFP, Les longueurs d'onde d'excitation et d'émission de fluorescence de la GFP sont: Xex 488, Xem 507 nm. La protéine GFP étiqueté devrait apparaître dans les mêmes cellules qui expriment NPY-mRFP.
- Pour les mesures d'exocytose procéder to étape 5 et pour la microscopie laps de temps, passez à l'étape 6.
5. Mesure de NPY-mRFP exocytose
- Préparation du tampon Tyrode:
- Préparer une solution de 54 mM de KCl, 20 mM de MgCl2, 2,74 M de NaCl et 8 mM de NaH 2 PO 4 dans DDW. Bien mélanger et stocker à 4 ° C. Cette étape est la préparation de tampon 20x Tyrode.
- Préparer une solution de Hepes 20 mM pH 7, 1,8 mM CaCl 2, 1 mg / ml de BSA, 5,6 mM de glucose et de 1 à 20 dilution de Tyrode 20x dans DDW et bien mélanger. Cette étape est la préparation de tampon 1x Tyrode.
- Aliquoter le tampon 1x Tyrode et conserver à -20 ° C. Évitez congélation et décongélation répétée.
- Retirez le milieu de culture de la plaque à 24 puits et laver trois fois avec un tampon Tyrode. Préparer des cellules non stimulées en ajoutant un tampon Tyrode 200 pi aux puits témoins.
- Préparez 10 ul / puits de réactif d'activation concentré 20X [(par exemple, 1000 ng / ml DNP-BSA ou DNP-HSA (Ag), 200 uM de Ca 2+ ionophore (A23187 par exemple), et une combinaison de 20 uM ionophore Ca2 + et 1 000 nM 12-O- tétradécanoylphorbol-13-acétate (TPA)]. Si les réactifs sont conservés dans du DMSO, diluer les réactifs en concentration 20x dans le tampon de Tyrode contenant 1% de DMSO. Incuber à 37 ° C pendant 30 min.
- Retirez les surnageants de chaque puits avec soin pour une plaque de 96 puits, placer sur la glace et éviter de la lumière. (Les surnageants contiennent le peptide chimérique NPY-mRFP qui a été libéré par les cellules).
- Ajouter tampon Tyrode 200 pi contenant 0,5% de Triton X-100 à chaque puits et incuber à 37 ° C pendant 10 min. (Cette étape est importante pour la préparation de lysats de cellules qui contiennent le restant de NPY-mRFP qui n'a pas été libéré par les cellules). Recueillir les lysats cellulaires et les transférer sur une plaque de 96 puits, placer sur la glace et éviter de la lumière.
- Mesurer la fluorescence des surnageants cellulaires et des lysats cellulaires en utilisant un Déessrence lecteur de plaque, en utilisant un 590-, 20 nm de bande passante excitation filtre et 635-, 35 nm filtre bande passante d'émission.
- Calculer le pourcentage de NPY-mRFP publié:
NOTE: La mesure de lecteur de fluorescence unités de fluorescence arbitraires (AFU). AFU valeurs dépendent de la machine et de sa sensibilité et de l'efficacité de transfection.- Réglez le autofluorescence des cellules RBL non transfectées comme vierges. Divisez la AFU de chaque surnageant à la fluorescence totale (AFU des surnageants + AFU du lysat correspondant) et multiplier par 100.
6. Time-lapse microscopie d'exocytose
- Graine 7,5 × 10 4 cellules de la / chambre transfectée dans un système de lamelle chambre borosilicate 8 puits. Après 18 à 24 h, éliminer le milieu de culture des chambres et laver trois fois avec un tampon Tyrode
- Ajouter 72 pi de tampon Tyrode à chaque chambre. Diluer les réactifs d'activation dans un tampon Tyrode à la concentration 10x. <li> utiliser un microscope à fluorescence confocal équipé d'une chambre chauffée (37 ° C) et CO 2 de commande (4,8%) et un objectif 40X ou 63X. Activer les systèmes de microscope: lampe au mercure, un ordinateur, et des lasers. Assurez-vous que la chambre est chauffée à la bonne température avant de commencer l'expérience.
- Placez la chambre dans la chambre chauffée et assurez-vous que la chambre est correctement installé et stable.
- Allumez la lumière de fluorescence selon le fluorophore pertinentes et visualiser les cellules transfectées. Éteignez fluorescence fois une cellule d'intérêt est dans le domaine afin de minimiser le blanchiment et la cytotoxicité. Il est important que ce champ contiendra environ 3.2 cellules transfectées. Les cellules transfectées doivent être bien répartis mais ne se touchant pas les uns les autres.
- Réglez la puissance du laser (selon le microscope) pour minimiser le bruit et sursaturation ainsi que la toxicité, et régler le gain et le décalage de modifier le rapport signal sur bruit. Balayage rapide ouder à minimiser la durée d'exposition au laser (moyenne de 2).
- Ajuster la taille sténopé à un maximum, cela permet de diminuer la puissance du laser et de maintenir images porté pendant une longue période de temps. Si vous le souhaitez, définir les paramètres de la pile de Z à reconstruire l'image en trois dimensions, ajuster la taille sténopé à 1 unité aérée (UA) qui donne le meilleur rapport signal sur bruit et acquérir balayage successives de tranches optique confocal à deux dimensions dans le z -axes avec des tranches optiques ≤0.7 um.
- Réglez l'intervalle de temps entre chaque acquisition de 15 à 30 secondes et la durée d'acquisition totale de 15 min et commencer à acquérir des images. Après 5 minutes de pause acquisition de la série chronologique. Ajouter 8 pi de la gâchette 10x et continuer immédiatement l'acquisition.
- Enregistrer les images, effectuez déconvolution en utilisant un logiciel de déconvolution et de reconstruire les piles à images en trois dimensions et d'un film en utilisant un logiciel Imaris.
- Importer les données à partir des images de séries chronologiques déconvolués qui ont été obtenues par le microscope à fluorescence confocale à Imaris logiciel. Ce logiciel lit plus de 40 fichiers microscopie. Si le logiciel ne peut pas lire les fichiers; convertir les fichiers au format TIF et l'importation.
- Pour ajouter des points de temps à la fin d'un ensemble de données ouverte appuyez sur Modifier -> Ajouter des points de temps et d'importer les nouveaux ensembles de données.
- Créer surface du canal mRFP utilisant l'option de l'assistant de surface. Choisissez l'algorithme par défaut. Choisissez le canal de NPY-mRFP. Marquez l'option de lissage pour réduire le bruit. Pour éviter la perte de petits détails de réduire le niveau de détail de la zone à 0,05 um.
- Réglez le seuil d'intensité. Nouvelle surface grise se affiche. Allez dans "Paramètres" et changer le style de "point central" à "Surface".
- Allez à l'onglet statistique dans les propriétés de l'objet sélectionné, sélectionnez l'onglet détaillée et la CUS de valeur spécifiqueh que l'intensité de fluorescence, volume, etc.
- Examiner les données et de confirmer que les valeurs sont compatibles avec les images. Par exemple, deux ou plus de granules adjacents peuvent être mesurés comme une plus grande granule. Pour quantifier la taille moyenne des granules diviser la taille des granules ont fusionné pour le nombre réel de granules.
- Exporter les ensembles de données désirées vers des fichiers Excel et analyser les données.
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Representative Results
En raison de la faible efficacité de transfection des MCs, les manipulations génétiques sont peu susceptibles de laisser un impact sur les lectures de la sécrétion moyenne mesurée par SGS médiateurs endogènes. Néanmoins, en établissant la co-expression complète du gène rapporteur NPY-mRFP et le plasmide co-transfecté dans les mêmes cellules, suivi des résultats NPY-RGRF exclusivement dans le suivi de la population de cellules qui exprime le gène d'intérêt. Par conséquent, l'avantage de ce dosage par rapport aux méthodes classiques est la possibilité de contrôler de façon sélective des cellules génétiquement manipulées (figure 1).
En effet, en utilisant cet essai, nous avons examiné les gènes qui régulent le trafic vésiculaire comprenant NSF soluble récepteur de la protéine de fixation des protéines (SNARE) [sensible fusion N-éthylmaléimide de] et 44 membres de la famille Rab GTPases. Nous avons identifié des gènes qui régulent SGsize, nombre, la composition de la cargaison et exocytose 23.
We identifié 30 Rabs que modifié (ce est-à inhiber ou stimuler) l'exocytose dans les cellules RBL stimulées par soit Ag, soit par la combinaison d'un ionophore de Ca 2+ et le TPA ester de phorbol (Ion / TPA) 23. L'imagerie confocale a révélé SNAREs et Rabs qui ont causé phénotypes dramatiques altérant la morphologie des cellules ou SGS 30,32. L'imagerie confocale de ces protéines a révélé 8 SNAREs et Rabs qui ont causé phénotypes dramatiques sur des cellules ou du SG morphologie 30,32. En utilisant ce protocole, nous avons pu suivre SG individuels et effectuer des mesures de leur taille, l'intensité de fluorescence, leur mouvement et l'exocytose. Par exemple, nous avons identifié Rab5 comme un régulateur de la biogenèse SG 30. Rab5 a été identifié comme un régulateur de maître de l'endocytose et la fusion des endosomes 24. Nous avons montré que la co-expression de (CN) mutants constitutivement négatifs du PIB verrouillage des isoformes exprimées de manière endogène de Rab5 (RAB5A, Rab5B et Rab5C), ou eXpression de RAB5A / B / C ciblant shRNAs, réduit de façon significative la taille de la SG avec une augmentation concomitante de leur nombre 30. Inversement, l'expression d'un, de manière constitutive-actif (CA) mutant RAB5A GTP asservie (RAB5A Q79L, ici: "CA RAB5A»), qui est connue pour faciliter la fusion homotypique des endosomes précoces (SEE) 24, a entraîné la formation de géant vésicules RAB5A décoré, que nous avons identifiées comme SGS en fonction de leur contenu de la cargaison de sécrétion NPY-mRFP et la sérotonine, et leur capacité à exocytose d'une manière réglementée 30.
Figure 2 montre analyses morphométriques de la SG NPY-mRFP contenant. Le volume SG moyenne dans les cellules RAB5A exprimant CA a atteint la valeur de 44 um 3, qui était> 20 fois plus grand que le volume moyen de la SG dans le contrôle GFP-cellules exprimant alors que leur nombre a diminué de 20 fois (Figure 2A). La relation inverseentre le nombre et la taille de la SGS (figure 2A) a suggéré que l'élargissement de Rab5 médiation du SG implique leur fusion homotypique. Le géant NPY-mRFP contenant SG formés par CA RAB5A permet l'imagerie de microscopie confocale de cellules vivantes dans une haute résolution qui permet la surveillance des SGS en détails qui pourraient ne pas être possible autrement. Par exemple, nous avons détecté RAB5A à fusionner SG aux côtés de petites structures disséminées parmi les SG géant, le plus probable correspondant aux endosomes (figure 2B). En outre, nous avons montré que Rab5 transitoirement et de préférence associés avec SGS nouvellement formés qui suggère que l'association sélective et temporaire de RAB5A nouvellement formé avec SG est compatible avec un appareil fusogène dans lequel seulement des granules nouvellement générés ont la capacité de fusionner avec d'autres SG 30.
La figure 3 montre des images représentatives de time-lapse de MC géant SG qui ont été formés par l'expression de CARAB5A et la cinétique de l'exocytose dans la résolution d'un seul SG après la stimulation. Au cours de l'exocytose MC, SGS se déplacent vers et fusionnent avec la membrane plasmique. En conséquence, le chargement de sécrétion est libéré des cellules dans l'espace extracellulaire. Dans ce système expérimental, NPY-mRFP est libérée à partir des cellules et les cellules trouvées dans les surnageants. La fluorescence de NPY-mRFP dans les surnageants de cellules peut être mesurée par un lecteur de fluorescence. Toutefois, en raison NPY-mRFP est dilué dans les surnageants son signal de fluorescence peut être détectée ou non visualisée par microscopie à fluorescence. La libération de NPY-mRFP des granules au cours des résultats d'exocytose dans une baisse rapide et spectaculaire dans NPY-mRFP intensité de fluorescence et le retrait de la NPY-mRFP contenant SG et de leur disappearance.Therefore, imagerie des cellules vivantes des cellules et des mesures de NPY stimulées intensité de fluorescence -mRFP ou NPY-mRFP taille contenant de SG fournissent des évaluations précises de la cinétique de l'exocytose degranules individuels. Figure 3b montre les intensités de fluorescence de SGS après stimulation des cellules avec un Ca 2+ Ionophore. SGS subissent exocytose à des moments différents (par exemple, 2, 3, 6, et 11 après stimulation min), tandis que l'intensité de fluorescence d'une seule SG qui ne fusionnent avec la membrane plasmique est restée constante.
Figure 1:. Illustration des principales étapes du protocole RBL cellules sont cotransfectées avec NPY-mRFP et un second gène d'intérêt ou de contrôle plasmide correspondant et immédiatement ensemencées sur des lamelles, 8 puits système de lamelle de borosilicate de chambre ou des plaques à 96 puits. Le lendemain, Images de la SG NPY-mRFP contenant de repos et les cellules déclenchées sont acquises par microscopie confocale (A). En outre, l'exocytose de resting et déclenché cellsis quantifiée en mesurant la libération de NPY-mRFP dans un lecteur de fluorescence de plaque 96 puits (B).
Figure 2:. Quantification de la taille de la SG RBL cellules ont été cotransfectées avec NPY-mRFP et soit GFP ou GFP-CA RAB5A et ensemencées sur 8 puits système de lamelle chambre de borosilicate. 24 h plus tard, la chambre 8 puits a été placé dans un microscope confocal à laser équipé chambre chauffée (37 ° C). Images Z-stack d'images successives avec des tranches optiques 0,7 um ont été capturés en utilisant un / 1,4 objectif d'ouverture numérique 63X d'huile. Les images ont été déconvolution et trois images de dimension ont été construites par le logiciel Imaris. Le volume de la GV et leur nombre a été calculé en utilisant le logiciel Imaris (A). Une partie du granulome NPY-mRFP contenantLes semble être incorporé dans RAB5A (pointes de flèches). D'autres sont nus ou ponté avec RAB5A (flèches). La barre d'échelle = 5 um (B). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Figure 3:. De mesurer l'ampleur et la cinétique de l'exocytose dans la résolution d'un seul SG dans les cellules RBL activatedRBL cellules ont été cotransfectées avec NPY-mRFP et GFP-CA RAB5A et ensemencé système de lamelle chambre borosilicate in8 puits. 24 h plus tard chambre IN8 puits a été placé dans un microscope confocal à laser équipé d'une chambre chauffée (37 ° C) et les cellules ont été déclenchée avec 10 uM ionophore Ca2 +. Les images ont été acquises toutes les 15 secondes en utilisant un / 1,4 objectif d'ouverture numérique 63X d'huile. Imagesétaient déconvolué puis traitées par le logiciel Imaris. La barre d'échelle = 5 um (A). L'intensité de fluorescence moyenne des NPY-RGRF contenant des granules a été déterminée par le logiciel Imaris et les données ont été normalisées en fonction du temps 0 (temps d'addition de l'ionophore Ca2 +). Les flèches représentent les points de temps au cours de laquelle la libération de SGcargo wasnoted (B). Se il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
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Discussion
Nous décrivons une stratégie innovante qui combine la quantification des MCs exocytose et quatre (x, y, z, t) quantifications de dimension par imagerie de temps écoulé en trois dimensions des SG dans les cellules vivantes en utilisant un gène rapporteur pour l'exocytose. Cette technique permet le dépistage des familles de protéines pour leur impact sur la fonction MC tels que SGS de surveillance à partir dès leur sortie de l'appareil de Golgi travers leur maturation, l'acquisition de la compétence de l'exocytose et de la dégranulation. La combinaison de mesures de exocytose ainsi que des caractérisations morphométriques et cinétiques de la SGS fournit un aperçu des mécanismes par lesquels les protéines testées interviennent fonctions MC. Par conséquent, en utilisant cette méthodologie, la manipulation génétique des gènes ciblés peut dévoiler de nouveaux mécanismes moléculaires par lesquels la boutique MC SG et de libérer leur cargaison. Notamment, NPY peut servir comme journaliste pour l'exocytose dans d'autres cellules sécrétoires tels que cellules MCF-7, un fr lignée cellulaire dérivéeom un adénocarcinome de la glande mammaire humaine 31, cellules chromaffines 34 et β-cellules pancréatiques 35.
Les manipulations génétiques sont des outils les plus puissants actuellement disponibles pour la recherche des réseaux fonctionnels. Les manipulations génétiques permettent l'identification de protéines essentielles dans chaque réseau, dont la suppression se appliquer effondrement du système, par opposition à d'autres protéines, dont la suppression se appliquer diaphonie entre les réseaux parallèles ou ne ont aucun effet en raison de la redondance. Toutefois, en raison de la faible efficacité de transfection des MC, pour mesurer l'exocytose de médiateurs endogènes seule une petite fraction de cellules est expression de l'ADN d'essai «manipulation». Par conséquent, lorsque l'on mesure l'exocytose de médiateurs endogènes, la contribution des cellules transfectées à la lecture total est mineure. Par conséquent, tenter d'adopter cette approche pour explorer les réseaux complexes associés à l'exocytose régulée dans MCs était hampered. Cette technique permet de surmonter l'obstacle de l'efficacité de transfection bas et fournit un moyen simple d'observer alternances phénotypiques de MC SG causés par surexpression, démontable et la mutagenèse de gènes d'intérêt.
Cette technique peut être étendue pour enquêter sur la hiérarchie et le mode d'interaction des réseaux fonctionnels à l'aide transitoire triple transfection. Les résultats seront analysés pour déterminer quel gène peut sauver un certain phénotype; causer un phénotype plus dramatique ou ne ont aucun effet. Sur la base de ces transfections combinatoires, les réseaux d'exocytose peuvent être construits. Par exemple, en utilisant triple transfection nous avons pu identifier le VAMP8 de protéines SNARE comme médiateur en aval dans le processus de Rab5 dépendant SG 25 fusion.
Cette méthode permet la visualisation et la quantification de l'exocytose dans la résolution de SGS simples. En effet, nous avons pu montrer que SGS réponses différentielles d'affichage pour stimuli. La raison pour expliquer pourquoi certaines SG en fusion avec la membrane plasmique tandis que d'autres ne ont pas ou la raison de la cinétique de différentiels de MC SG fusion restent à déterminer. Les futures études utilisant cette approche expérimentale ont le potentiel de répondre à ces questions. Par exemple, la quantification des différents SNAREs ou Rabs sur personne SG et corrélation avec les compétences de l'exocytose et la cinétique de l'exocytose dans la résolution d'un seul SG devrait révéler de nouveaux régulateurs de l'exocytose.
La principale limitation de cette technique est la manipulation génétique parce que la surexpression d'une protéine peut affecter la fonction ou la morphologie des cellules. Par conséquent, il est essentiel de valider les résultats avec des approches complémentaires. Par exemple, lorsque la surexpression d'un mutant constitutivement active inhibe l'exocytose, l'effet d'un mutant négatif constitutive ou abattre du gène doivent être testés ainsi.
En utilisant cette technique, on identifnouveaux régulateurs IED de fonctions MC, qui affectent MC exocytose ou modifient la morphologie SG. La combinaison de mesures d'exocytose avec SG morphométrique caractérisation fournit un aperçu plus approfondi de la fonction et les mécanismes d'action des protéines testées.
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Acknowledgments
Nous remercions le Dr U. Ashery pour le don de NPY-mRFP ADNc. Nous remercions les Drs. MJ Kofron, L. Mittleman, M. Shaharbani, et Y. Zilberstein pour son aide précieuse à la microscopie et analyse d'images. Nous remercions également le Dr Joseph Orly pour la lecture critique de ce manuscrit. Ce travail a été soutenu par une subvention de la Fondation israélienne des sciences, fondée par l'Académie israélienne des sciences (1139-1112 RS-E.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| DMEM | Sigma-Aldrich | D6046-500ML | Warm in 37 °C water bath before use |
| Fetal Bovine Serum | GE health care Life sciences | SH30071.01 | |
| Penicillin-Streptomycin | Life technologies | ||
| Cellulose acetate membrane, pore size 0.22 μm | Sigma-Aldrich | CLS430769-1EA | |
| Corning tissue-culture treated culture dishes | Sigma-Aldrich | CLS430167 | |
| Trypsin/EDTA Solution (TE) | Life technologies | R001100 | Warm in 37 °C water bath before use |
| PIPES dipotassium salt | Sigma-Aldrich | 108321-27-3 | |
| Calcium acetate hydrate | Sigma-Aldrich | 114460-21-8 | |
| Magnesium acetate tetrahydrate | Sigma-Aldrich | M5661 | |
| L-Glutamic acid potassium salt monohydrate (Potassium glutamate) | Sigma-Aldrich | G1501 | |
| 4 mm electroporation cuvettes | cell projects | EP-104 | |
| GENE PULSER WITH PULSE CONTROLLER & CAPACITANCE | Bio rad | ||
| Chambered coverglass | Thermo scientific | 155411 | |
| 24 well, flat bottom | Sigma-Aldrich | CLS3524 | |
| Corning 96 well plates | Sigma-Aldrich | CLS3367 or CLS390 | |
| 96 well plate fluorescence reader- Infinite 200 | Tecan | ||
| Calcium ionophore A23187 | Sigma-Aldrich | C7522 | Avoid from direct light exposure |
| 12-O-tetradecanoyl-13-acetate (TPA) | Calbiochem | P3766 | |
| anti-DNP monoclonal IgE | Sigma-Aldrich | D8406 | |
| DNP-BSA/ DNP-HAS | Sigma-Aldrich | A6661 | Avoid from direct light exposure |
| Triton-x-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | |
| Confocal fluorescent microscope: | |||
| Zeiss LSM 510 | |||
| Leica | SP5 | ||
| Nikon A1 inverted | |||
| Imaris software | BITLANE | ||
| Microsoft exel or Prism or other analyses software | |||
| Other reagent: | |||
| Magnesium Chloride | MERK | 5833 | |
| Sodium chloride | MERK | 6404 | |
| Calcium chloride | MERK | 2382 | |
| Bovine serum albumin | Sigma-Aldrich | A4503 | |
| Glucose | BDH Laboratories | 284515V | |
| Monosodium phosphate | MERK | 5345 | |
| Sterile water |
References
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