Hier präsentieren wir ein Protokoll zur Ultraschall Mikrobläschenkontrastmittel in Wohn-, isoliert späten Schwangerschaftsphase murine Embryonen zu injizieren. Dieses Verfahren ermöglicht die Untersuchung der Perfusion Parameter und vaskulärer molekularer Marker innerhalb des Embryos mit kontrastverstärkten hochfrequenten Ultraschall-Bildgebung.
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Methodenartikel
Contrast Imaging in Maus Embryonen Verwendung von Hochfrequenz-Ultraschall
In diesem Artikel
Zusammenfassung
Zusammenfassung
Die kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung kann wesentliche quantitative Informationen über die Vaskularität und Perfusion des Gewebes vermitteln und in gezielten Anwendungen den Nachweis und die Messung von vaskulären Biomarkern auf molekularer Ebene erleichtern. Im Mausembryo kann diese nicht-invasive Technik verwendet werden, um grundlegende Mechanismen aufzudecken, die der Gefäßentwicklung im frühen Kreislaufsystem der Maus und in genetischen Modellen für Herz-Kreislauf-Erkrankungen zugrunde liegen. Der Mausembryo eignet sich auch hervorragend als Modell für die Untersuchung der Adhäsion von Mikrobläschen an angiogene Ziele (einschließlich des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktor-Rezeptors 2 (VEGFR2) oder αvβ3) und für die Beurteilung der quantitativen Natur des molekularen Ultraschalls. Wir haben daher eine Methode entwickelt, um Ultraschallkontrastmittel in das Gefäßsystem lebender, isolierter Embryonen einzubringen. Dies ermöglicht Freiheit in Bezug auf die Kontrolle und Positionierung der Injektion, die Reproduzierbarkeit der Bildgebungsebene ohne Obstruktion und Bewegung sowie eine vereinfachte Bildanalyse und -quantifizierung. Im späten Gestationsstadium (Embryonaltag (E)16.6 und E17.5) wurden murine Embryonen aus der Gebärmutter isoliert, sanft aus dem Dottersack nach außen gestreckt und Mikroblasenkontrastmittel in Venen injiziert, die auf der Chorionoberfläche der Plazentascheibe zugänglich sind. Die nichtlineare Kontrastultraschallbildgebung wurde dann eingesetzt, um eine Reihe grundlegender Perfusionsparameter (Peak-Enhancement, Wash-In-Rate und Zeit bis zum Peak) zu erfassen und die gezielte Mikroblasenbindung in einem Endoglin-Mausmodell zu quantifizieren. Wir zeigen die erfolgreiche Zirkulation von Mikrobläschen in lebenden Embryonen und den Nutzen dieses Ansatzes bei der Charakterisierung des embryonalen Gefäßsystems und des Mikroblasenverhaltens.
Einleitung
Die kontrastverstärkte Ultraschallbildgebung nutzt Mikrobläschenkontrastmittel sichtbar zu machen und kennzeichnen das Gefäßumgebung. Diese Agenten ermöglichen die nichtinvasive Beurteilung der Mikrozirkulation, Vaskularität und Herz-Kreislauf-Funktion. Zusätzlich kann eine Modifikation der Blasenoberfläche in gezielter Mikrobläschen führen Bindung an Endothelzellen Biomarkern in der präklinischen Anwendungen der Angiogenese, Arteriosklerose und Entzündung 1,2 Herstellung Molekularultraschallbildgebungs vaskulärer Ereignisse möglich demonstriert. Kontrastverstärkten Ultraschall kann daher verwendet werden, um die komplexen und vielfältigen Umgebungen, die ....
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Protokoll
HINWEIS: Die in dieser Studie durchgeführt experimentellen Verfahren wurden von der Animal Care Committee bei Sunnybrook Research Institute (Toronto, Ontario, Canada) zugelassen. Die Verfahren für die humane Behandlung von Tieren muss jederzeit eingehalten werden. Es wird angenommen, daß der Prüfer in den Grundbetrieb eines Ultraschall-Bilderzeugungssystem ausgebildet. Dieses Protokoll funktioniert am besten mit zwei Personen.
1. Tiermodelle
- Mate-CD-1 männlich und weiblich Mus musculus zu Wildtyp-Embryonen zu Perfusionsstudien erhalten.
- Für die molekulare Bildgebung Studien generieren Eng +/- Mäusen durch hom....
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Ergebnisse
Die Injektion von Ultraschallkontrastmitteln in ex utero Mausembryonen ist abhängig von der erfolgreichen Isolierung von lebenden spät Gestationsalter Embryonen aus dem Uterus und Wartung der Lebensfähigkeit im Verlauf der Injektion und ähnliche Ultraschallbildgebung. Nachdem der Embryo wurde nach außen verlagert und so positioniert, wie in Figur 1 gezeigt, ist eine sorgfältige Injektion von Kontrastmittel in den embryonalen Gefßsystems möglich. Eine typische B-Mode-Ultraschallbild eines E17.5 .......
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Diskussion
Ultraschallkontrastmittel wurden in der Spätphase der Trächtigkeit Mausembryonen und nichtlineare Kontrastbilder injiziert wurden erworben, um die Perfusion Parameter zu messen und zielgerichtete Mikrobläschen verbindlich. Erfolgreiche Abbildung von Mikrobläschen in embryonalen Vaskulatur war abhängig von einer Reihe von Faktoren, wobei der erste Embryo Lebensfähigkeit. Die gesamte Ausrüstung und die Vorrichtung wurden im Voraus, um die Zeit für die Trennung von Embryonen aus dem Uterus zu Beginn der Einspritzung zu min.......
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Offenlegungen
F.S. Foster bekennt sich zu seiner Rolle als Berater von VisualSonics Inc.
Danksagungen
Diese Arbeit wurde unterstützt durch das Terry Fox Programm des National Cancer Institute of Canada.
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Materialien
AntikörperEquipment
td colspan="4"> (biotinyliert, eBioscience) — Die Wahl des Antikörpers hängt vom Experiment ab Sigma 76240 4 % td colspan="4">3120000062022491351
| Name | Unternehmen | Katalognummer | Kommentare |
|---|---|---|---|
| Reagenzien< | |||
| eBioscience | 13-4321-85 | Diese Antikörper/Mikroblasen-Kombination wird häufig als experimentelle Kontrolle benötigt |
| eBioscience | 13-5821-85 | |
| Biotinylierte Ratte MJ 7/18 Antikörper gegen Maus-Endoglin | Inhouse-Hybridom | Externe Antikörper können auch geeignet sein: wir haben in der Vergangenheit eBioscience (13-1051-85 ) verwendet | |
| Destilliertes Wasser | |||
| Embryo media | |||
| Sigma | D5796 | |
| ATCC | 30-2020 | Los # 7592456 |
| Gibco | 15630 | 5 ml, 1 M |
| Gibco | 15140-122 | 5 ml, 10.000 Stück Pen., 10.000 μ g Streptokokken-Ethanol |
| , 70 % | |||
| Eis-Paraformaldehyd | |||
| phosphatgepufferte Kochsalzlösung [1x] | Sigma | D8537 | 1x, ohne Calciumchlorid & Magnesiumchlorid |
| Schwangere Maus, CD-1 | Charles River Laboratories Inc. | ||
| 0,9 % Natriumchlorid (Kochsalzlösung) | Hospira | 0409-7984-11 | |
| Ultraschall-Kontrastmittel, zielbereiter und nicht zielgerichteter | MicroMarker; VisualSonics Inc. | ||
| Ultraschallgel (Aquasonic 100, farblos) | CSP Medical | 133-1009< | |
| Zellkulturplatten (4) : 100 x 20 mm | Fisher Scientific | 08-772-22 | |
| Zellkulturplatten (12) : 60 x 15 mm | Sigma | D8054 | |
| Zentrifuge | Sorvall Legend RT Zentrifuge | ||
| Konische Röhrchen, 50 ml BD Falcon | VWR | 21008-938 | |
| Verdünnungsmittel | Beckman Coulter | Isoton II Verdünnungsmittel, 8448011 | |
| Sezierschere (Wagner) | Fine Science | Tools Wagner 14068-12 | |
| Pinzette (2), Dumont SS (0,10 x 0,06 mm) | Fine Science Tools | 11200-33 | |
| Pinzette, Splitter | VWR | 25601-134 | |
| Glasbecher, 2 L (Griffin-Becher) | VWR | 89000-216 | |
| Glaskapillaren, 1 x 90 mm GD-1 mit Filament | Narishige | GD-1 | |
| Glasnadelabzieher | Narishige | PN-30 | |
| Handschuhe | Ansell | 4002 | |
| Grobstoffsonde | Fine Science Tools | 10088-15 | |
| Heizplatte | VWR | 89090-994 | |
| Eiskübel | Cole Parmer | RK 06274-01 | |
| Bildgebung Plattform | VisualSonics Inc. | Integriertes Schienensystem | |
| Lichtquelle, faseroptisch | Fisher Scientific | 12-562-36 | Idealerweise mit verstellbaren Armen |
| Luers (12), Polypropylen mit Widerhaken weiblich ¼-28 UNF-Gewinde | Cole Parmer | 45500-30 | |
| Mikroultraschallsystem, Hochfrequenz | VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Nadeln, 21 Gauge (1") | VWR | 305165 | |
| Partikelgrößenmessgerät | Beckman Coulter | Multisizer 3 Coulter Counter | |
| Perforierter Löffel (Moria) | Fine Science Tools | MC 17 10373-17 | |
| Stifte (6), schwarz eloxiert minutien 0,15 mm | Fine Science Tools | 26002-15 | |
| Pipettierer [2-20 μ L, 20-200 μ l, 100-1.000 μ l] | Eppendorf | Research Plus verstellbare 3120000038; 3120000054; | |
| Pipettierspitzen [2-200 μ l, 50-1.000 μ l] | Eppendorf | epT.I.P.S. 22491334; | |
| Schere | |||
| Sylgard 184 Silikon Elastomer Kit | Dow Corning | ||
| Schlauch, Tygon Labor 1/32" x 3/32" | VWR | 63010-007 | |
| Applikatorstäbchen aus Holz (Tupfer, Wattekopf) | VWR | CA89031-270 | |
| Operationsmikroskop mit 5-8-facher Vergrößerung | Fisher Scientific | Steromaster | |
| Spritzen, 1 ml Normject | Fisher | 14-817-25 | |
| Spritzen (10), 30 ml | VWR | CA64000-041 | |
| Spritzeninfusionspumpe | Bio-Luchs | NE-1000 | |
| Thermometer, -20-110 ° C | VWR | 89095-598 | |
| Zeitschaltuhr | VWR | 33501-418 | |
| Röhren, Eppendorf | VWR | 20170-577 | |
| Röhrengestell (3) | VWR | 82024-462 | |
| Ultraschallwandler, 20 MHz | VisualSonics Inc. | MS250 | |
| Vannas-Tübingen, abgewinkelt | Fine Science Tools | 15005-08 |
Referenzen
- Voigt, J. U. Ultrasound molecular imaging. Methods. 48 (2), 92-97 (2009).
- Klibanov, A. Preparation of targeted microbubbles: Ultrasound contrast agents for molecular imaging. Medical Biological Engineering Computing. 47 (8), 875-882 (2009).
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Nachdrucke und Genehmigungen
