Method Article

Évaluation de l'encéphalopathie spongiforme transmissible barrières d'espèces avec une In Vitro Test Prion de conversion des protéines

DOI:

10.3791/52522

⸱

March 10th, 2015

 ,  ,  ,  , 
1USGS National Wildlife Health Center, 2Department of Soil Science, University of Wisconsin–Madison, 3Laboratory of Immunology, National Institute of Allergy and Infectious Diseases, National Institutes of Health, 4Merial Veterinary Scholars Program, School of Veterinary Medicine, University of Wisconsin–Madison, 5Department of Neurology, University of British Columbia

In This Article

Summary

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La mesure de la barrière à la transmission interespèces des maladies à prions est difficile et implique généralement des défis sur les animaux ou des tests biochimiques. Ici, nous présentons un test de conversion de protéines prions in vitro avec la capacité de prédire les barrières d’espèces.

Abstract

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Les études visant à comprendre la transmission interspécifique des encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST, maladies à prions) sont difficiles en ce sens qu’elles reposent généralement sur des études de provocation in vivo longues et coûteuses chez l’animal. Un certain nombre d’essais in vitro ont été mis au point pour aider à mesurer les barrières entre les espèces de prions, réduisant ainsi l’utilisation d’animaux et fournissant des résultats plus rapides que les essais biologiques sur les animaux. Nous présentons ici le protocole d’un test de conversion rapide in vitro des prions appelé test du coefficient d’efficacité de conversion (CER). Dans ce test, la protéine prion cellulaire (PrPC) d’un cerveau hôte non infecté est dénaturée à des pH de 7,4 et 3,5 pour produire deux substrats. Lorsque le substrat de pH 7,4 est incubé avec un agent TSE, la quantité de PrPC qui se convertit en un état résistant à la protéinase K (PK) est modulée par la barrière d’espèce de l’hôte d’origine à l’agent TSE. En revanche, la PrPC dans le substrat de pH 3,5 est mal repliée par tout agent TSE. En comparant la quantité de protéine prion résistante à la PK dans les deux substrats, il est possible d’évaluer la barrière d’espèce de l’hôte. Nous montrons que le test CER prédit correctement les barrières d’espèces de prions connues chez les souris de laboratoire et, à titre d’exemple, nous montrons quelques résultats préliminaires suggérant que les lynx roux (Lynx rufus) peuvent être sensibles à l’agent de la maladie débilitante chronique du cerf de Virginie (Odocoileus virginianus).

Introduction

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Encéphalopathies spongiformes transmissibles (EST, maladies à prions) sont un groupe de maladies neurodégénératives fatales avec des périodes d'incubation prolongées qui touchent une variété d'animaux et les humains. L'agent étiologique présumé des EST est constitué d'un isomère mal repliée de la protéine prion hôte (PrP), qui est capable d'auto-propagation par conversion du modèle mécanique de la forme cellulaire normale de la PrP (PrPc) en un infectieuse, associée aux maladies forme (PrP EST) qui se accumule dans les tissus du système nerveux central de l'hôte infecté 1. Prions de mammifères infectieuses tran....

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Protocol

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travaux animale menée à la National Wildlife Health Center USGS a été réalisée en conformité avec l'Office de lignes directrices NIH Laboratoire bien-être animal et sous protection des animaux et le comité de l'utilisation protocole # EP080716. Tissus d'animaux de chasseurs-récoltés étaient des cadeaux du Wisconsin ou du Michigan ministères des Ressources naturelles.

1. Solution Préparation

REMARQUE: Les solutions énumérées ci-dessous sont nécessaires pour la préparation du substrat de dosage de CER dans la section 2 ci-dessous. Préparer chacune de ces solutions de concentration des ....

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Results

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L'utilisation réussie de l'essai de CER dépend en grande partie la qualité de la paire de substrats utilisés dans les réactions de conversion. Pour cette raison, les procédures pour préparer paires de substrat CER suivant, un immunoblot de contrôle de la qualité doit être effectuée (Figure 2). Pour les deux substrats, un dosage de 10 à 25 ul par immunotransfert. PrP C doit être facilement détectable dans chaque substrat et les niveaux de PrP C doit être approximativement la même en.......

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Discussion

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Pour la réussite de ce protocole, l'attention devrait être accordée aux niveaux PrP C dans le tissu cérébral infecté utilisé pour la préparation du substrat (étape 2.1.2) et la semence au substrat ratio pour les réactions de conversion (étape 4.4.2). Dans notre expérience, le cerveau peuvent être extraites pour une utilisation comme substrat de CER après un post-mortem de longue période, aussi longtemps que la PrP C est présent par immunoblot (Figure 4). En fait, certains autol.......

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Disclosures

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Acknowledgements

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Nous remercions John Olsen (Département des ressources naturelles du Wisconsin), Tom Cooley, Daniel O’Brien et Steve Schmitt (Département des ressources naturelles du Michigan) et le Dr Daniel Walsh (USGS National Wildlife Health Center) pour leur aide dans l’acquisition de tissus. Nous remercions également le Laboratoire d’hygiène de l’État du Wisconsin pour les services de tests de diagnostic, ainsi que la Dre Tonie Rocke et son personnel (USGS National Wildlife Health Center) pour l’utilisation de l’équipement. Toute utilisation de noms commerciaux, de produits ou d’entreprises est uniquement à des fins descriptives et n’implique pas l’approbation du gouvernement a....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
12 % Bis-Tris SDS-PAGE gelsLife TechnologiesNP0342
0,5 mm billes d’oxyde de zirconiumNext AdvanceZROB05D’autres variétés de billes sont également efficaces
Anticorpsdivers fournisseursSélectionnez les anticorps primaires et secondaires appropriés pour la détection par immunoblot de PrPres à partir d’espèces d’intérêt
Homogénéisateurde billesProchaine AdvanceBBY24M
CentrifugeuseBeckman Coulter369434Haute vitesse avec contrôle de la température
Tubes coniquesn’importe quelle marque
Applicateur à pointe de cotonUlineS-18991
Cuphorn sonicatorHeat Systems-UltrasonicsW-380Heat Systems-Ultrasonics, Inc. est maintenant Qsonica, LLC
Densitométrie logicielUVPVision Works LS Logiciel d’acquisition et d’analyse d’imagesD’autres programmes, tels que NIH ImageJ, fonctionneront également
Homogénéisateur DounceKimble Chase885300
Mélangeur bout à boutLabnet InternationalH5600
Acide éthylènediaminetétraacétiqueBoston BioproductsP-770Produit chimique dangereux : irritation oculaire
Chlorhydrate de guanidine, 8 MThermo Fisher Scientific24115Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, irritation cutanée, irritation oculaire
Bloc chauffantFisher Scientific11-718
Acide chlorhydriqueSigma-Aldrich435570Produit chimique dangereux : acide fort
Tampon d’échantillon de dodécylsulfate de lithium, 4xLife TechnologiesNP0008Produits chimiques dangereux : peau & irritation respiratoire, lésions oculaires graves, solide inflammable
MéthanolFisher ScientificA454-4Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, liquide inflammable
Tubes à microcentrifugern’importe quelle marque
Mini-centrifugeuseLabnet InternationalC1301
N-lauroyl-sarcosine (sarkosyl)Sigma-Aldrich  ;L-5125Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, irritation cutanée, lésions oculaires
Nonidet P-40AmrescoM158Produit chimique dangereux : irritation cutanée, lésions oculaires
Système de gel SDS-PAGE LifeTechnologiesSystème d’électrophorèse NuPAGED’autres systèmes SDS-PAGE fonctionnent également avec
tubes PCR (à faible liaison)AxygenPCR-02-L-C
Homogénéisateurde pilonsFisher Scientific03-392-106
pH-mètreSentronSI600
Membrane en polydifluorure de vinyleMilliporeIPVH00010
Proteinase KPromegaV3021Produit chimique dangereux : irritation de la peau et des yeux, sensibilisation respiratoire, toxicité pour les organes
Agent réducteur pour échantillons SDS-PAGE, 10xLife TechnologiesNP0009
Chlorure de sodiumFisher Scientific7647-14-5
Désoxycholatede sodium Sigma-Aldrich  ;D6750Produit chimique dangereux : toxicité aiguë
Dodécylsulfate de sodiumThermo Fisher Scientific28364Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, irritation cutanée, lésions oculaires, solide inflammable
Hydroxyde de sodiumSigma-AldrichS5881Produit chimique dangereux ; seringue à base forte
BD BiosciencesdiversUtiliser une taille de seringue adaptée aux volumes de substrat à homogénéiser
Aiguilles de seringueBD Biosciencesdivers
Thermoshaker (secoueur de tube PCR)Hangzhou All Sheng InstrumentsMS-100
Tris baseBio Basic77-86-1Produit chimique dangereux : irritation de la peau, des yeux, des voies respiratoires
Triton X-100Integra Chemical CompanyT756.30.30Produit chimique dangereux : toxicité aiguë, irritation oculaire
VortexerFisher Scientific12-812
des

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Colby, D. W., Prions Prusiner, S. B. Cold Spring Harb Perspect Biol. 3 (1), a006833(2011).
  2. Hill, A. F., Collinge, J. Prion strains and species barriers. Contrib Microbiol. 11, 33-49 (2004).
  3. Scott, M., et al. Transgenic mice expre....

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Prion Protein ConversionSpecies Barrier AssessmentIn Vitro AssayConversion Efficiency RatioProteinase K ResistanceSDS Page ImmunoblotBrain Tissue HomogenateTSE Agent IncubationPrP C DenaturationCER Assay Protocol

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